恶性疟原虫疫苗研究VIPfCMR基因与人白细胞介素-2基因的连接与克隆

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ｐＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点。重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出正向插入的重组载体ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。     

HL-60细胞中IL6基因的克隆及鉴定

目的：为探索性构建重组人白细胞介素６－绿脓杆菌外毒素融合蛋白（ＩＬ６－ＰＥ４０）以选择性杀伤高表达ＩＬ６受体（ＩＬ６Ｒ）的白血病细胞,本研究试图从人急性早幼粒细胞白血病细胞株（ＨＬ－６０）中克隆Ｎ－末端缺失２４个氨基酸的人ＩＬ６基因（ＩＬ６ｃＤＮＡ）并构建含此基因的重组质粒。方法：根据ＩＬ６基因序列设计合成可扩增ＩＬ６ｃＤＮＡ的特异性引物;利用基因重组技术,构建含ＩＬ６基因的重组质粒ｐＵＣ－ＩＬ６。结果与结论：本文首次从ＨＬ－６０中扩增出预期４８０ｂｐ的ＩＬ６ｃＤＮＡ,将其克隆至ｐＵＣ１８质粒中,命名为ｐＵＣ－ＩＬ６,并经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ双酶切电泳及序列分析鉴定加以确证,为进一步构建重组人ＩＬ６－ＰＥ４０奠定了坚实基础。     

人单核细胞超化蛋白—1（MCP—1）基因的PCR扩增,克隆…

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣ     

恶性疟原虫六个保护性抗原表位基因的化学合成及克隆

本文设计并化学合成一条含有恶性疟原虫裂殖子表面抗原（ＭＳＡ１、ＭＳＡ２）、环子孢子蛋白（ＣＳＰ）、环状体感染红细胞表面抗原（ＲＥＳＡ）等不同生活史期的４种抗原，共６个表位的复合基因（ＰｆＣＭＲ）。该基因含２个粘性未端，共分８个片段，采用“缺口填补法”接成双链ＤＮＡ，再与噬菌体Ｍ１３ｍｐ１８分别经ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ双酶切后回收、纯化、重组，并转化ＥｃｏｌｉＪｍ１０９，经ＰＣＲ和酶切鉴定，ＤＮＡ序列分析测定，证实阳性克隆子Ｍ１３ｍｐ１８－Ａ４与预设计基因顺序完全一致。     

恶性疟原虫保护性抗的复合基因——豆苗病毒重组活疫苗株的构建

将本实验室合成的一段编码恶性疟原虫不同发育阶段抗原表位基因，包括裂殖子表面怕ＭＳＡ１、ＭＳＡ２、环子孢子蛋白ＣＳＰ及环状体感染经细胞表面蛋白ＲＥＳＡ以及来自白细胞介素－１（ＩＬ－１）和破伤风类毒素（ＴＴ）上Ｔ细胞激活点等的抗原基因（ＨＧＦＳＰ）。先定向克隆人ＰＳＫ载体的ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点，后用ＥｃｏＲＩ单酶切，补平及用ＳａｃⅠ单酶切下手目的基因再定向克隆人痘苗病毒表面载体ＰＪ２－１６的Ｓｍ     

人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌DH5α中的表达

目的;构建人钙调素基因表达载体并在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃ ＤＮＡ）,将其插入表达载体ｐＢＶ２２０,构建重组表达质粒ｈＣａＭα／ｐＢＶ２２０,用酶切,ＤＮＡ测序,ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白,经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一分子量与理论值相符的诱导表达条带,其表达     

人单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）基因的PCR扩增、克隆及序列分析

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣＰ－１中第１２个氨基酸的编码序列与国外报道的不同。由ＴＧＴ变成了ＴＧＣ，但编码相同的氨基酸即半胱氨酸，其余的编码序列则完全相同，说明ＭＣＰ－１的基因型可能存在着多态性。     

单纯疱疹病毒I型SM44株胸苷激酶基因的克隆及序列测定

为了分离、克隆单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ－Ｉ） ＳＭ_(４４)株胸苷激酶基因（ＴＫ），采用原代兔婴肾细胞培养ＨＳＶ－ＩＳＭ_(４４) 株病毒，提取病毒核酸作为模板，设计了 ＨＳＶ－ＩＴＫ基因的上、下游引物，在引物的 ５’端分别引入 ＢａｍＨＩ和 ＥｃｏＲ Ｉ 限制性内切酶位点，通过ＰＣＲ方法扩增出 ＴＫ基因，经ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ双酶切与 ＰＵＣ１９质粒载体相连接，构建重组 体转化受体菌ＪＭ１０９，通过筛选和酶切鉴定，获得ＨＳＶ－ＩＳＭ_(４４) ＴＫ基因阳性克隆，行全序列测定分析，与ＨＳＶ－ＩＣＬ１０１ 株 ＴＫ基因同源性为 ９９．０２％，存在 １１个核苷酸和 ７个氨基酸的差异。 ＨＳＶ－ＩＴＫ基因的克隆成功，为该基因应用于恶 性肿瘤的自杀基因治疗奠定了基础。     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

CD44H胞外区cDNA片段的克隆及在大肠杆菌中的表达

以ｐＵＣ／ＣＤ４４为模板，用ＰＣＲ法扩增出Ｈ型ＣＤ４４的ｃＤＮＡ片段。用ＥｃｏＲＩ／ＢｃＩＩ双酶切保留编码ＣＤ４４Ｈ的信号肽及胞外内ＤＮＡ片段，插入融合蛋白表达载体ＰＥＸ３１ｂ的ＥｃｏＲＩ／Ｓａ１Ｉ位点，形成重组质粒ＰＥＸ－ＣＤ４４，将ＰＥＸ－ＣＤ４４导入大肠杆菌菌ＲＲ１（ＰＣＩ８５７），经４２℃温控诱导，有额外蛋白的产生，分子量与预期大小一致，表达产物形成包涵体，表达产量占菌体总蛋白的２１％左右     

复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定

目的将人ＩＬ－２的重组腺病毒载体与Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物同源重组，高效制备人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒，并进行体外表达和活性检测。方法将含全部编码序列的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ置于真核表达载体ｐＣＩｃｃ的ＣＭＶ启动子下游，切出含ＣＭＶ启动子、人ＩＬ－２ｃＤＮＡ和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号肽序列的ＣｌａＩ片段，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｏｗ，选择左向转录的人ＩＬ－２重组腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ．ＣＩｈＩＬ－２与经ＥｃｏＴ２２Ⅰ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞；通过同源重组获得人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒；体外转染人宫颈癌ＨｅＬａ细胞、人Ｔ细胞淋巴瘤Ｈｕｔ７８细胞和原代人皮肤成纤维细胞。结果扩增到的病毒滴度达２．１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ；体外转染的人肿瘤细胞均检测到ＩＬ－２的表达（４００～２６００Ｕ／１０６细胞／２４小时）。结论所制备的复制缺陷型重组腺病毒能有效介导人ＩＬ－２的基因转移，可望用于肿瘤基因治疗的临床研究。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型SM44株胸苷激酶基因的克隆及序列测定

为了分离、克隆单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）ＳＭ４４株胸苷激酶基因（ＴＫ）,采用原代兔婴肾细胞培养ＨＳＶ－Ｉ ＳＭ４４株病毒,提取病毒核酸作为模板,设计了ＨＳＶ－１ ＴＫ基因的上、下游引物,在引物的５‘端分别引入ＢａｍＨ１和ＥｃｏＲ１限制性内切酶位点,通过ＰＣＲ方法扩增出ＴＫ基因,经ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ １双酶切与ＰＵＣ１９质粒载体相连接,构建重组体转化受体菌ＪＭ１０９,通过筛选和酶切鉴定,获得     

乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及其表达

目的　为探讨 Ｈ Ｂ Ｖ Ｘ 基因在肝细胞癌（ Ｈ Ｃ Ｃ） 中的致瘤机理提供实验模型。方法　用限制性内切酶从ｐ Ｅｃｏｂ６ 上切下 Ｘ 基因读码框,克隆到ｐ Ｂ Ｋ Ｓ＋ 上,再将 Ｘ 片段插入ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４ 的 Ｈｉｎｄ Ⅲ和 ＮｏｔⅠ位点间。将重组载体（ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４ Ｘ） 和空载体（ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４） 导入肝癌细胞株 Ｈｅｐ Ｇ２ 中,潮霉素选择培养, Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 鉴定其稳定表达。结果　构建的ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４ Ｘ 质粒在 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞中有稳定表达。结论　本实验为进一步探讨 Ｈ Ｂ Ｖ Ｘ 基因在 Ｈ Ｃ Ｃ 中的致瘤机理提供了理想的实验细胞株。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

4型腺病毒载体的构建和β—半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４质粒，质粒ｐＡｄ４和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂｐ腺病毒晚期表达盒，在所构宾腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ     

表皮生长因子与假单胞菌外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达 …

目的和方法：应用基因工程技术，将ＥＧＦＣＤＮＡ克隆到ＰＬＹ５／ＩＬ２－ＰＥ４０载体的ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ位点之间ＩＬ２基因位置上，再将重组融合基因亚克隆到表达载体ＰＢＶ２２０的ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ位点上，以探索ＥＧＦ－ＰＥ４０融合基因在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的进行表达及其生理功能。结果：ＳＤＳ－聚丙烯胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明：ＥＧＦ－ＰＥ４０融合蛋白获得表达，并且具有ＥＧＦ和ＰＥ４０的免     

HBsAg S与GM—CSF融合基因在L929细胞中的表达

将乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）主蛋白的编码基因Ｓ与人ＧＭ－ＣＳＦ基因融蛤 后,插入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ１中,经质粒酶切鉴定及ＤＮＡ序列分析证明,目的基因插入ｐｃＤＮＡ１的ＣＭＶ启动子下降。以获得的重组质粒ｐＳＧＭ转染Ｌ９２９细胞,经ＲＴ－ＰＣＲ及细胞原位杂交证实目的基因的转录。     

人白细胞介素6逆转录病毒表达载体的构建

实验以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒为载体，构建了人白细胞介素６次级克隆ｐＢＩＬ－６。用限制性内切ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＩＬ－６，分离并回收了ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段，并在其平未端加入了ＢａｍＨＩ接头。实验将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＩＬ－６全基因片段插入到了逆转录病毒载体ｐＺＬＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ位点上，构建了重组质粒ｐＺＬＰＩＬ－６。经对重组予ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳、限制住内切酶分析和核酸杂交鉴定，筛选出了含有ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段及插入方向正确的ｐＺＬＰＩＬ－６。     

我国登革2型病毒E基因的克隆与表达研究

以我国登革２型病毒４３（Ｄ２－４３）株ＲＮＡ为模板，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了Ｅ基因。扩增的ｃＤＮＡ片段约１２９０ｂＰ， 与预期大小相一致，经ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实了Ｅ基因片段的特异性。将Ｅ基因的扩增片段首先克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐtⅡＫＳ~＋质粒ＤＮＡ中，利用重组子中载体的酶切位点，将该基因片段再克隆到高效表达载体ｐＢＶ２２０中。用ＰＣＲ技术从２０个重组子中筛选出６个阳性克隆　，经ＳａｌⅠ和ＰｓｔⅠ酶切进一步鉴定，证明这６个重组质粒中均含有Ｅ基因片段。采用温控诱导，４小时表达的蛋白量约占菌体总蛋白的２０％。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，表达的蛋白可与该病毒株的多克隆腹水抗体和登革２型病毒标准株的单克隆抗体起特异反应。     

汉坦病毒A9株M基因片段全长cDNA克隆及其在痘苗病…

采取反转录－聚合酶链反应，分３个片段扩增Ⅰ型汉坦病毒（野鼠型）中国毒株Ａ９株Ｍ基因片段，分别克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ载体中。选择个正向插入的ＴＡ９ＩＢ、ＴＡ９ＣＤ、ＴＡ９ＥＡ克隆，选用Ｃｌａ Ⅰ、ＥｃｏＲ Ｖ进行酶切、连接，获得了１个在ＰＧＥＭ－Ｔ载体中插入３．６ｋｂ的Ａ９株Ｍ基因片段ｃＤＮＡ克隆，酶切图谱分析证实插入片段正确。将Ａ９Ｍ片段在痘苗病毒／Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶瞬时表达系统中进行表达，用抗汉