LRIG2基因全长及胞外段对胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2（LRIG2）基因全长及胞外段对脑胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响。方法将LRIG2全长,LRIG2胞外段（LRIG2_ecto）及空白质粒（对照）经慢病毒法分别转染胶质瘤细胞系U251细胞,筛选稳定细胞株,实时PCR及免疫印迹法检测mRNA及蛋白表达,细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖,流式细胞分析检测细胞周期及细胞凋亡。结果两转染组Flag标签蛋白表达成功;两转染组LRIG2全长及LRIG2_ectomRNA表达较对照组明显升高（氏0．01）;两转染组细胞增殖率均明显高于对照组（P〈0．01）;两转染组s期与G2/M期细胞数之和（即细胞增殖指数）均明显高于对照组（P〈0．01）,而细胞凋亡率均明显低于对照组（P〈0．05）。结论LRIG2基因全长及LRIG2_ecto促进胶质瘤细胞增殖,并将细胞周期阻滞于G2/M期,抑制细胞凋亡。     

Evi1基因对胶质瘤细胞株U87/U251增殖、侵袭的影响

目的探讨Evi1基因在不同级别胶质瘤组织中的表达,以及调控该基因对胶质瘤细胞株U87和U251细胞增殖、细胞周期和侵袭影响,为靶向癌基因治疗胶质瘤提供客观依据。方法首先通过实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测人脑不同级别胶质瘤组织以及U87和U251细胞株中Evil基因的表达水平。用合成的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰下调U87和U251细胞Evi1基因表达作为干扰组,同时设空白和阴性对照组。qRT-PCR检测转染前后Evi1基因在U87和U251细胞中的表达和转染效率。CCK-8法检测实验组细胞的增殖能力,流式细胞仪分析Flow Cytometer(FCM)其细胞周期。Transwell以及划痕试验检测各组U87和U251的侵袭和迁移能力。以及用qRT-PCR分析下调Evi1基因后U87和U251细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达水平。结果 Evi1基因在胶质瘤组织中呈现高表达,且随着胶质瘤级别程度增加其表达水平亦上升,其中Ⅲ和Ⅳ级的胶质瘤组织以及U87、U251细胞Evi1基因表达明显高于非瘤脑组织(均P0.05)。通过siRNA下调Evi1基因后,胶质瘤细胞株U87和U251的增殖减缓(均P0.05),其侵袭和迁移能力明显下降(均P0.01),并能阻滞其细胞周期G1期(P0.05)。干扰组U87和U251细胞MMP2表达水平明显降低(均P0.01)。结论 Evi1基因在胶质瘤中呈高表达,干扰U87和U251细胞Evi1基因可抑制胶质瘤的增殖和侵袭。     

STIP1对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 探讨下调磷酸化应激诱导蛋白1（STIP1）表达对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,及其对JAK2/STAT3信号通路的调控作用。方法 免疫印迹法检测体外培养的正常胶质细胞（SVG）和人胶质瘤细胞（U251、U87和U37）STIP1蛋白表达水平。NC-siRNA或STIP1-siRNA质粒转染U251细胞,CCK-8法检测U251细胞增殖;Transwell实验检测U251细胞侵袭能力;流式细胞术检测U251细胞凋亡率;免疫印迹法检测JAK2/STAT3信号通路蛋白表达水平。结果 与正常胶质细胞SVG比较,胶质瘤细胞U251、U87和U373的STIP1蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）。与NC-siRNA组比较,STIP1-siRNA组STIP1蛋白表达水平、细胞增殖活力和细胞侵袭力明显明显降低（P<0.05）,细胞凋亡率明显增高（P<0.05）,而且,p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 STIP1在胶质瘤细胞中呈高表达,抑制STIP1表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭、促进凋亡,机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。     

SNAI2与E-cadherin参与LRIG1对U251细胞侵袭与转移的抑制作用

目的 探讨多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（LRIG1）对人脑胶质瘤U251细胞侵袭与转移及U251细胞SNAI2、E-cadherin表达的影响。方法 传代培养U251细胞,随机分为空白对照组、LRIG1空载体组、LRIG1过表达组、LRIG1低表达组、LRIG1低表达阴性对照组,应用脂质体介导的基因转染技术分别转染PBS、PEGFP-N1-U251质粒、PEGFP-LRIG1-U251质粒、LRIG1-siRNA、LRIG1-NC-siRNA。应用PCR、Western blot检测细胞LRIG1、SNAI2、E-cadherin mRNA和蛋白表达水平,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞转移能力。结果 LRIG1过表达组U251 SNAI2表达下调（P<0.05）,E-cadherin表达上调（P<0.05）,细胞侵袭与转移能力明显下降（P<0.05）。LRIG1低表达组U251细胞SNAI2表达上调（P<0.05）,E-cadherin表达下调（P<0.05）,细胞侵袭与转移能力明显提高（P<0.05）。结论 上调LRIG1可抑制U251细胞侵袭与转移,而敲除LRIG1可明显促进U251细胞侵袭与转移,SNAI2及E-cadherin可能参与其调节过程。     

CREPT对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制

目的 探讨肿瘤高表达细胞周期相关蛋白（CREPT）对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响及可能机制。方法 体外培养人胶质瘤细胞株U373、U251、A172、U87-MG、SHG44,并构建过表达或沉默CREPT的U251细胞;免疫印迹法检测蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 U251细胞CREPT蛋白表达水平最高,SHG44细胞最低。沉默CREPT后,U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显下降（P<0.05）,p-Wnt和p-β-catenin蛋白表达水平下降（P<0.05）。过表达CREPT后,U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显增强（P<0.05）,p-Wnt和p-β-catenin蛋白水平明显升高（P<0.05）。Wnt/β-catenin通路抑制剂KYA1797K可逆转过表达CREPT对细胞增殖、侵袭和迁移的影响（P<0.05）。结论 CREPT可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭和迁移。     

过表达TBX2对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨TBX2表达对胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响。方法 采用RT-qPCR和免疫印迹法检测53例胶质瘤组织和瘤旁组织TBX2mRNA和蛋白表达水平。体外培养胶质瘤细胞（U251、U87和SHG-44）和正常星型胶质细胞（HA1800）,采用RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平。构建TBX2过表达或低表达U251细胞株,分别采用WST-1法检测胶质瘤细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 胶质瘤组织TBX2 mRNA和蛋白表达水平明显高于瘤旁组织（P<0.05）,而且,高级别胶质瘤TBX2表达水平显著高于低级别胶质瘤（P<0.05）。相比于人正常星型胶质细胞系HA1800,胶质瘤细胞系U251、U87、SHG-44细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）;而且,U251细胞TBX2表达水平显著高于U87和SHG-44细胞（P<0.05）,因此使用U251细胞进行后续实验。过表达TBX2显著增加U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）,低表达TBX2显著抑制U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）。结论 胶质瘤TBX2呈高表达,与胶质瘤增殖、侵袭能力有关。     

隔蛋白7对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响

目的 检测SEVT7对胶质瘤细胞系U251的细胞周期、增殖、侵袭以及凋亡的影响.方法 流式细胞术分析转染SEPT7对细胞周期的影响,Western blot检测细胞周期因子表达变化,MTT法和Annexin V法评价SEFT7对U251细胞的增殖活性和凋亡的影响,Martrigel三维立体培养分析转染SEPT7后U251细胞侵袭能力的变化.结果 SEPT7使U251细胞G0/G1期阻滞,S期细胞比例(SPF)降低,增殖活性和侵袭能力明显受到抑制,并可诱发细胞凋亡.结论 SEPT7抑制U251细胞侵袭、增殖,促进凋亡.结果 提示,SEPT7是对胶质瘤具有抑制作用的基因.     

LRIG2基因全长及胞外段抑制胶质瘤细胞系U87凋亡的机制

目的研究富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因全长及胞外段抑制胶质瘤细胞系U87凋亡的机制。方法将LRIG2全长(LRIG2),LRIG2胞外段(LRIG2ecto)及空白对照(Con)慢病毒表达载体分别感染U87,筛选获得稳定细胞株;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞线粒体膜电位;Western blotting检测凋亡相关蛋白及信号通路蛋白表达。结果 LRIG2及LRIG2ecto过表达组细胞凋亡率分别为2.86%±0.30%和4.04%±0.59%,明显低于对照组5.90%±0.45%(P0.05);其线粒体膜电位分别是对照组的(2.77±0.25)倍和(2.33±0.17)倍,较对照组明显升高(P0.01);其凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值分别是对照组的(1.45±0.09)倍和(1.35±0.08)倍,较对照组明显升高(P0.01);其表皮生长因子受体(EGFR),磷酸化EGFR(P-EGFR)及其下游的磷酸化蛋白激酶B(p Akt)均较对照组明显增加。结论 LRIG2基因全长及胞外段均可激活EGFR信号通路,抑制胶质瘤细胞凋亡。     

上调LRIG1对胶质瘤U251细胞侵袭、迁移的影响

目的 探讨上调LRIG1表达对胶质瘤U251细胞侵袭及迁移的影响。方法 体外培养U251细胞，应用LipofectamineTM 2000试剂盒将质粒pLRIG1-GFP（pLRIG1-GFP组）及其空载pEGFP-N1质粒（pEGFP-N1组）转染U251细胞，G418挑选具有抗性的细胞并扩增，以供进一步实验。另选择不转染任何质粒U251细胞作为空白对照组。qRT-PCR、免疫印迹法检测LRIG1及细胞上皮-间充质转化（EMT）标志蛋白SNAI2、E-cadherin、N-cadherin和vimentin的mRNA和蛋白表达；应用Transwell小室实验检测U251细胞侵袭和迁移能力。结果 成功构建高表达LRIG1的胶质瘤U251细胞，荧光显微镜下可见细胞散发绿色荧光。pLRIG1-GFP组LRIG1 mRNA及蛋白表达水平明显高于pEGFP-N1组和空白对照组（P<0.05），而后两组之间均无统计学差异（P>0.05）。pLRIG1-GFP组侵袭和迁移细胞数明显低于pEGFP-N1组和空白对照组（P<0.05），而后两组之间均无统计学差异（P>0.05）。pLRIG1-GFP组SNAI2、N-cadherin、vimentin mRNA及蛋白表达水平明显低于pEGFP-N1组和空白对照组（P<0.05），而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平明显高于pEGFP-N1组和空白对照组（P<0.05）；后两组之间均无统计学差异（P>0.05）。结论 上调LRIG1，抑制U251细胞侵袭和迁移，其机制可能与调控细胞EMT过程有关。     

p53基因、PTEN基因协同对胶质瘤U251细胞系生长抑制作用的研究

目的探讨p53基因和PTEN基因在脑胶质瘤细胞系U251发生发展过程中的作用机制。方法用不同MOI的p53腺病毒表达载体pAdCMV-p53及空载体pAdCMV-lacZ分别感染表达野生型PTEN基因和突变型PTEN基因的细胞系,RT-PCR及Westernblot方法检测转染效率;并通过MTT检测生长抑制率、流式细胞仪检测细胞周期及TUNEL检测分析细胞凋亡等指标观察p53基因及PTEN基因对U251细胞生长的影响。结果MOI为100时,p53基因可引起U251细胞G0G1期阻滞、诱导细胞凋亡,生长抑制;MOI为50时,U251-p53 PTEN生长抑制率明显高于U251-p53,并能出现细胞凋亡,而U251-p53仅出现少量细胞凋亡。结论p53基因可以通过细胞周期G0G1期阻滞及诱导细胞凋亡抑制胶质瘤细胞系U251的生长;PTEN基因可以促进p53基因对胶质瘤细胞系U251的生长抑制作用,并能增加U251细胞对p53基因诱导凋亡的敏感性。     

LRIG1抑制人脑胶质瘤细胞增殖的研究

目的探讨多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（LRIG1）对人脑胶质瘤细胞增殖的影响。方法分别构建携带LRIG1、LRIG1小干扰RNA、Bcl2和胶质细胞源性生长因子（BDMF）的质粒,将它们分别转染到人脑胶质瘤细胞系U251细胞内,应用细胞计数试剂盒8法检测细胞活性的变化,蛋白印迹法检测LRIG1、Bcl2、拓扑异构酶Ⅱ（topoⅡ）、GDNF的表达变化。结果成功构建携带LRIG1、LRIG1小干扰RNA、Bcl2、GDNF的质粒,并成功转入U251细胞株。过表达LRIG1显著抑制U251细胞增殖。蛋白印迹法结果显示LRIG1的表达和Bcl2、topoⅡ和GDNF的表达呈显著负相关。结论LRIG1通过负性调节Bcl2、topoⅡ和GDNF的表达抑制人脑胶质瘤细胞系U251细胞的增殖。     

全反式维甲酸增强替莫唑胺对U251细胞化疗效果的研究

目的观察全反式维甲酸（ATRA）对替莫唑胺（TMZ）治疗人脑胶质瘤是否有协同作用。方法用ATRA、TMZ或两药联合分别作用于人脑胶质瘤细胞株U251细胞,细胞划痕法检测各组的细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光检测CD133细胞阳性率。结果ATRA、TMZ均能抑制U251细胞的迁移,联合用药时迁移抑制更明显。对照组、ATRA组、TMZ组及联合用药组U251细胞凋亡率分别为（6．24±0．81）％、（24．93±4．58）％、（21．36±3．76）％和（54．27±4．83）％,CD133阳性细胞率分别为（7．05±0．27）％、（0．66±0．30）％、（36．32±3．22）％和（4．70±0．52）％。各组间细胞凋亡率和CD133阳性细胞率均有明显差异（P〈0．01）。结论ATRA和TMZ两药均可抑制U251细胞株迁移,促进细胞凋亡;两药联合应用可增强TMZ对U251细胞的化疗效果;其机制可能与ATRA减少CD133阳性细胞率有关。     

蒿甲醚对人胶质瘤细胞系U251细胞凋亡的影响

目的研究蒿甲醚对体外培养的人胶质瘤细胞系U251细胞凋亡的影响并初步探讨其机制。方法不同浓度蒿甲醚（25、50、100、200、400、800μmol／L）作用U251胶质瘤细胞,四甲基偶氮唑盐法测定药物抑制率和半抑制浓度（IC50）;流式细胞术检测细胞周期的变化和细胞凋亡情况;Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡情况。结果蒿甲醚对U251细胞生长抑制率随药物浓度增加而显著增加（P〈O．05）,同时随药物作用时间延长而显著增加（P〈O．05）。药物作用24、48和72h,其IC50分别为849．28±25．89、518．93±32．83和172．99±6．06μmol／L,三者之间均差异显著（P〈0．05）。经400μmol／L蒿甲醚作用48h,Hochest33258荧光染色可观察到凋亡小体。经400μmol／L蒿甲醚作用24、48、72h,细胞凋亡率分别为（4．55±0．24）％、（12．82±1．88）％和（24．22±2．17）％,三者之间均差异显著（P〈0．05）;细胞周期分析显示,随着蒿甲醚作用时间的延长,G0/G1期细胞比例显著增加（P〈0．05）,S期和G2/M期细胞比例显著减少（P〈O．05）。结论蒿甲醚能抑制U251细胞生长,呈剂量和时间依赖性;其机制可能为将细胞阻滞在G0/G1期并诱导其凋亡。     

Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞凋亡的影响

目的探讨Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞体外增殖的抑制作用及细胞周期的影响。方法将U251细胞与不同浓度的Survivin拮抗肽进行体外培养,采用四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度的Survivin拮抗肽对U251细胞的生长抑制率;采用流式细胞仪分析细胞周期与细胞凋亡。结果浓度为5、10、20ug／ml的Survivin拮抗肽均能抑制U251细胞的生长,且抑制率与Survivin拮抗肽浓度及作用时间成正比（P〈0．01）。20ug/ml Survivin拮抗肽作用U251细胞72h,抑制率达63．33％。流式细胞仪结果显示,终浓度为5、10、20ug／ml Survivin拮抗肽亦能促进U251细胞凋亡,且随作用浓度增大及作用时间延长凋亡率明显上升（P〈0．01）;20ug／ml Survivin拈抗肽作用U251细胞72h,凋亡率为31．29％。不同浓度的Survivin拮抗肽作用U251细胞72h,随作用浓度增大,G2/M期细胞构成比明显上升（P〈0．01）。结论Survivin拮抗肽对U251细胞增殖具有抑制作用和促进凋亡,其抗胶质瘤细胞增殖作用机制可能为诱导肿瘤细胞凋亡,调控肿瘤细胞周期。     

腺病毒载体介导的RNAi对胶质瘤U251细胞肝细胞生长因子受体表达的影响

目的探讨腺病毒载体介导的RNA干扰技术对胶质瘤细胞肝细胞生长因子（HGF）受体（c—Met）的表达和细胞凋亡的影响。方法用PCR法获得人U6启动子及带有c—Met反向互补靶序列的片段HU6shmet：利用腺病毒载体将其传递至U251细胞；分别采用RT-PCR和Western blot方法检测U251细胞的c—Met mRNA和蛋白的表达．Annexin—V—PI双染法流式细胞术检测细胞的凋亡状况。结果获得了带有人U6启动子及c—Met反向互补靶序列的重组腺病毒载体rAdUshmet1和rAdUshmet2。转导了rAdUshmet1和rAdUshmet2的U251细胞的c—Met mRNA和蛋白相对表达量较未转导腺病毒及转导了rAdGFP和rAdU-sicon的U251细胞均有明显下降（P〈0．01），rAdUshmet1和rAdUshmet2转导的U251细胞凋亡率分别为（13．5±4．21％和（28．2±5．6）％，明显高于未转导腺病毒的及rAdGFP和rAdUsicon转导的U251细胞凋亡率（P〈0．05）。结论腺病毒载体rAdUshmet通过抑制HGF受体c—Met表达，能在一定程度上阻断HGF—c—Met信号通路，有可能成为对胶质瘤进行基因治疗的有效载体。     

胶质瘤多药耐药细胞株U251/TMZ的生物学特性

目的探讨胶质瘤U251／替莫唑胺（TMZ）多药耐药细胞株的生物学特性。方法采用TMZ间歇浓度梯度递增法诱导建立胶质瘤多药耐药细胞株U251／TMZ,光镜观察细胞形态,细胞计数计算倍增时间,四甲基偶氮唑蓝法检测耐药指数,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录-PCR法检测多药耐药性1（MDRl）、Bcl-2、多药耐药相关蛋白5（MRP5）、肺耐药相关蛋白1（LRPl）等mRNA表达。结果胶质瘤耐药细胞株U251／TMZ对TMZ、依托泊苷、硫酸长春新碱、环磷酰胺、阿霉素的耐药指数分别为4．39、3．61、2．64、2．00、1．63;细胞周期结果显示U251／TMZ细胞系较U251亲本细胞系G0/G1期和s期明显减少（P〈0．05）,GfM期明显增多（P〈0．05）;U251／TMZ倍增时间[（14．64＋1．98）h1较亲本细胞系u251[（10．26＋1．03）h1明显延长（P〈0．05）;U251／TMZ耐药细胞株MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl等mRNA表达均较亲本细胞系U251明显上调。结论间歇TMZ浓度递增法可成功建立人脑胶质瘤U251多药耐药系,MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl的表达明显上调可能与耐药性形成有关。