维甲酸诱导神经管畸形小鼠组蛋白H2BK120ub1泛素化修饰及相关基因表达变化

目的 利用维甲酸(RA)诱导C57BL/6J小鼠神经管畸形(NTDs),探讨RA对NTDs鼠胚脑、脊髓组织组蛋白H2BK120单泛素化修饰水平及神经管发育基因表达水平变化。方法 孕鼠随机对照(Con)组和RA构建的NTDs组。实验组孕鼠7.5 d灌胃RA 25 mg/kg;对照组孕鼠灌胃相同体积的香油。孕10.5 d通过体视显微镜观察胎鼠畸形及神经管发育。采用Elisa方法检测NTDs小鼠胚脑、脊组织维生素A、维甲酸浓度的变化,采用Western blot检测NTDs小鼠胚脑、髓组织H2BK120ub1蛋白的表达量变化;采用RT-PCR检测NTDs小鼠胚脑、脊组织神经管发育基因Pax6、Nestin表达变化;采用ChIP-qPCR检测NTDs小鼠胚脑、脊组织神经管发育基因Pax6、Nestin与H2BK120ub1结合变化。结果 RA组诱导NTDs胚鼠脑、脊髓组织：维甲酸及维生素A浓度相较于对照组明显增高(P<0.05);H2BK120ub1蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05);神经管发育基因Pax6、Nestin表达水平明显高于对照组(P<0.05);神经管发...     

牛磺酸对环磷酰胺致神经管畸形的保护作用研究

目的 研究环磷酰胺(cyclophosphamide, CP)引起小鼠神经管畸形(neural tube defects, NTDs)的动物模型, 探讨牛磺酸的保护作用及其作用机理, 为预防NTDs的发生提供理论依据。方法 建立CP致小鼠NTDs模型, 分析比较各组鼠胚神经管发育情况和畸形情况;用免疫组织化学和图像分析技术检测各组鼠胚神经管上皮细胞中Cx26和Cx43蛋白的表达, 分析其与NTDs发生的关系。结果 1)用CP建立小鼠NTDs模型的最佳剂量为15 mg/kg体重, 牛磺酸能有效减少NTDs的发生;2)Cx26和Cx43蛋白定位于神经细胞的胞膜和胞质, CP组Cx26和Cx43蛋白的表达明显高于对照组(P＜0.05);中、高剂量牛磺酸组Cx26和Cx43蛋白的表达显著降低(P＜0.05)。结论 Cx26和Cx43的过度表达可能是CP致NTDs的途径之一;牛磺酸可能拮抗CP的毒性, 保护神经细胞, 减少NTDs的发生。     

高温致神经管畸形金黄地鼠HSP70及p38MAPK的通路变化

目的探讨热休克蛋白70(HSP70)及p38MAPK信号通路蛋白在高温致神经管畸形中的机制。方法将清洁级雌性金黄地鼠孕鼠于妊娠第8天进行水浴,分别于高温后的8、16、24、48、72、96h取出36只正常对照组孕鼠(水浴温度为37℃,持续20min)和36只高温致神经管畸形的实验组孕鼠(水浴温度为42℃,持续20min),取胚胎脑组织。应用Western blot检测HSP70和p38MAPK及P-p38MAPK蛋白的表达水平,RT-PCR法检测HSP70和p38MAPK的mRNA表达。结果高温处理后HSP70mRNA及蛋白表达水平在24～96h均不同程度地高于对照组(P0.05);高温后8～48hp38MAPK磷酸化蛋白产物增加,于16h表达增加最为显著(P0.01),而8～96h,对照组和实验组间p38MAPKmRNA及蛋白含量差异无统计学意义。结论 HSP70及p38MAPK信号通路蛋白的变化与高温致金黄地鼠神经管畸形密切相关。     

Caspase-3、P53在神经上皮及间充质细胞的表达和意义

目的:探讨维甲酸致神经管畸形中细胞凋亡的发生机制。方法:应用维甲酸建立小鼠胚胎NTDs模型,采用核固红-结晶紫和免疫组化染色方法,观察鼠胚神经上皮和周围间充质细胞的凋亡情况及凋亡相关蛋白Caspase-3、P53在神经上皮表达的变化,用图像分析技术对不同胎龄鼠胚的神经上皮及其间充质细胞Caspase-3、P53蛋白的表达进行半定量分析。结果:①对照组鼠胚神经管发育良好,神经管在E9d闭合,细胞凋亡较少。实验组神经管大多未闭合,凋亡细胞较多,伴有凋亡小体。②实验组神经上皮细胞的凋亡率明显高于对照组(P<0.05),细胞凋亡率在E9d、E10d最高;实验组神经管周围间充质细胞的凋亡率在E9d、E10d、E11d最高,明显高于对照组(P<0.05)。③Caspase-3蛋白定位于神经上皮及其间充质细胞的胞膜和胞质,实验组该蛋白的表达在E9d、E10d达最高峰,显著高于对照组(P<0.05),以后又逐渐降低至对照组水平。④P53蛋白定位于胞质和胞膜,实验组P53蛋白在神经上皮及其间充质细胞的表达明显高于对照组(P<0.05),而且该蛋白的表达始终处于高水平,没有明显的峰值。结论:Caspase-3、P53蛋白的过度表达可能促进细胞凋亡,从而诱导NTDs的发生。     

大豆异黄酮联合叶酸对胎鼠脑细胞Pax3和Cx43表达的影响

目的观察大豆异黄酮联合叶酸对胎鼠脑细胞Pax3和Cx43表达的调控作用及其与神经管畸形发生的关系,并分析其可能的机制。方法将72只孕鼠随机分为9组对照组、模型组(环磷酰胺,CP组)、叶酸干预组(FA)、大豆异黄酮不同剂量干预组(SIF1、SIF2和SIF3)以及与FA配伍的大豆异黄酮联合干预组(SIF1+FA、SIF2+FA和SIF3+FA)。SP免疫组化法检测胎鼠脑神经细胞Pax3及Cx43蛋白的表达,并观察胎鼠外观,记录胎鼠总数和畸胎数。结果(1)与模型组比较,各干预组均能降低NTDs发生率,其中以FA+SIF2联合干预组效果最好;(2)与对照组比较,模型组中Pax3表达下调,Cx43表达过度;与模型组相比,各干预组均有Pax3表达上调,而Cx43表达下调的改变。结论大豆异黄酮、叶酸或两者联合与NTDs形成相关基因Cx43的下调和Pax3的上调有关;Cx43的过度表达、Pax表达的下调可能是CP诱发NTDs重要机制之一。     

乙醇对金黄地鼠胚胎神经上皮细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

目的探讨乙醇染毒对金黄地鼠胚胎神经上皮细胞内B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因和Bcl相关蛋白(Bcl-associatexprotein,Bax)表达的影响。方法成年未经产金黄地鼠48只,实验组分6组,每组5只;对照组分6组,每组3只。实验组于孕7.5d腹腔注射乙醇,剂量为5.8g/kg,分别于4、8、16、24、48和72h后剖腹取胎,用免疫组织化学和图象分析技术对各期鼠胚神经上皮的Bcl-2和Bax的表达进行检测。对照组腹腔注射生理盐水。结果对照组Bcl-2和Bax正常分布于金黄地鼠胚胎神经上皮和周围间充质的核膜和胞浆,随时间推移,二者的表达量逐渐增高,于处理后16h达到高峰,与对照组相比,升高有统计学意义(P<0.01),之后逐渐下降。各实验组胚胎神经上皮细胞的Bcl-2免疫组化染色强度均不同程度地低于对照组,Bax的表达在8h低于对照组,其他各组均不同程度地高于对照组。结论乙醇能抑制Bcl-2的表达,促进Bax的表达,从而参与了乙醇致神经管畸形中细胞凋亡的调节。     

Wnt信号通路GSK-3β和β-catenin mRNA在胎鼠围生期脑缺血再灌注损伤中的变化

目的探讨围生期脑缺血再灌注损伤后,不同发育期胎鼠胚脑Wnt信号通路关键分子糖原合成酶激酶(GSK)-3β及β-连环蛋白(catenin) mRNA表达水平变化。 方法采用完全随机设计,将40只成功受孕的雌性SD大鼠分为实验组及对照组,每组各20只。两组分别于孕14,16,18及20 d(分别计为E14,16,18及20)时,各取5只孕鼠予相关处理：实验组钳夹双侧子宫动脉30 min,建立围生期脑缺血再灌注模型,并于再灌注24 h后留取胎鼠胚脑标本;对照组则不钳夹子宫动脉,仅在与实验组对应时间点留取胎鼠胚脑标本。采用实时定量(RT)-PCR检测胎鼠胚脑Wnt信号通路关键分子GSK-3β和β-catenin mRNA表达水平;采用尼氏染色和TUNEL标记法,检测两组胎鼠胚脑神经细胞凋亡情况。统计学比较两组胎鼠在相同发育期及同组胎鼠在不同发育期胚脑GSK-3β及β-catenin mRNA相对表达量,以及胚脑神经细胞凋亡率差异。 结果①两组胎鼠在相同发育期(E14,16,18或20)胚脑GSK-3β及β-catenin mRNA相对表达量比较,以及同组胎鼠胚脑GSK-3β或β-catenin mRNA相对表达量在不同发育期(E14,16,18及20)比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。②实验组胎鼠胚脑神经细胞凋亡率,在相同发育期均较对照组高,且差异有统计学意义[(0.254±0.001) vs (0.027±0.004),t＝46.547;(0.256±0.022) vs (0.029±0.003),t＝45.917;(0.263±0.011) vs (0.029±0.002),t＝34.355;(0.265±0.031) vs (0.030±0.003),t＝91.108;均为P<0.001]。不同发育期(E14,16,18及20)同组胎鼠胚脑神经细胞凋亡率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。③胎鼠胚脑尼氏染色结果显示,实验组神经细胞的细胞质嗜碱性增强,细胞核固缩浓染。 结论Wnt信号通路和发育期宫内缺血缺氧性脑损伤的关系尚待进一步研究。     

高同型半胱氨酸致神经管畸形的研究进展

神经管畸形(NTDs)是新生儿最常见的中枢神经系统缺陷之一,神经管闭合经过神经板形成、神经板塑形、神经板卷褶和神经褶融合四个阶段,此过程涉及遗传和环境两大危险因素。高同型半胱氨酸血症(HHcy)通过氧化应激、Ca²⁺超载、降低S-腺苷甲硫氨酸(SAM)/S-腺苷高半胱氨酸(SAH)比值等使胚胎整体DNA低甲基化,通过组蛋白修饰、基因多态性和甲硫氨酸合酶(MTR)等导致神经管闭合相关基因高表达,并激活相关信号通路(如Wnt/β-catenin信号通路和PI3K/AKT信号通路),破坏细胞增殖和凋亡之间的平衡,影响神经管正常发育,最终导致NTDs的发生。本文介绍HHcy与上述几种机制之间的关联,并进一步阐述HHcy对NTDs发生发展的影响,为临床上诊断和预防NTDs提供更为明确的理论依据。     

维甲酸致神经管畸形中牡蛎拮抗神经细胞凋亡的实验研究

目的 探讨维甲酸(retinoic acid,RA)致神经管畸形(neural tube defects,NTDs)中牡蛎拮抗神经细胞凋亡的分子机制。方法 建立NTDs模型并给予牡蛎拮抗,观察神经细胞的凋亡情况及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax与Caspase-3表达的变化。结果 1)RA组神经管上皮细胞凋亡指数明显高于对照组,牡蛎组凋亡指数明显低于RA组(P＜0.05)。2)RA组神经上皮细胞Bcl-2的表达明显低于对照组,牡蛎组Bcl-2的表达明显高于RA组(P＜0.05)。3)RA组Bax与Caspase-3的表达均明显高于对照组,牡蛎组Bax与Caspase-3的表达明显低于RA组(P＜0.05)。 结论 牡蛎可以拮抗RA引起的神经上皮细胞过度凋亡,其机理可能是通过上调Bcl-2的表达和下调Bax与Caspase-3的表达实现的。     

不同波段红外线对小鼠胚胎发育作用的实验研究

目的:研究不同波段红外线对小鼠胚胎的作用。方法:采用不同波段的红外线对正常孕鼠及环磷酰胺(CP)致毒孕鼠的照射,观察了受孕母鼠的体重变化,活胎率、死胎率、吸收胎率以及胎鼠的身长、尾长、体重等指标。结果:单纯红外线照射各组孕鼠的体重、胎鼠的体重、身长、尾长都有增加。其中中波红外线组与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01)。阳性对照组(CP组)与正常对照组比较活胎率、死胎率、吸收胎率、胎鼠的体重、身长、尾长均有显著性的差异(P<0.01),CP可明显抑制胎鼠的发育及降低胎鼠的活胎率。红外线+CP各组与阳性对照组比较,活胎率、吸收胎率、死胎率、胎鼠的体重、身长、尾长均有显著性差异。结论:红外线特别是中波红外线能促进胚胎的生长并对CP引起的胚胎发育障碍有一定的缓解作用。     

环磷酰胺与同型半胱氨酸制备NTDs大鼠的比较

目的比较环磷酰胺和同型半胱氨酸两种致畸物质在建立大鼠神经管畸形模型中的作用.方法将大鼠按体重随机分为8组,即正常对照组、4个不同剂量的环磷酰胺组和3个不同剂量的同型半胱氨酸组,正常对照组给予生理盐水,环磷酰组的剂量分别为7.5,10.5,12.5和15 mg/kg,均于怀孕第13 d一次性腹腔注射相应剂量的环磷酰胺;同型半胱氨酸组的剂量分别为600,300和150mg/kg,于怀孕第1 d开始经口给药,每天1次,并持续整个怀孕期.各组孕鼠均于怀孕第14d随机处死3只,剖腹取胎鼠进行光镜形态学观察;其余孕鼠均于怀孕第20 d时处死,进行胎鼠外形、病理及电镜的检测.结果环磷酰胺组胎鼠神经管畸形发生处有大量的凋亡细胞存在;以12.5 mg/kg的剂量组致畸率高且致死率低;在本实验剂量范围内未发现同型半胱氨酸对大鼠的明显致神经管畸形的作用.结论可以利用12.5 mg/kg环磷酰胺制备大鼠神经管畸形模型;畸形的发生与胚胎神经管细胞过度凋亡有关;而大鼠对同型半胱氨酸没有对环磷酰胺致神经管畸形敏感.     

维生素C、B_6和牛磺酸增强叶酸防畸效果的观察

目的　观察维生素 C、B6和牛磺酸对叶酸防畸效果的影响。方法　以环磷酰胺致胎鼠发育畸形动物模型 ,分别对孕鼠补充叶酸 ;叶酸 +VC+VB6+牛磺酸 ,观察防畸效果。结果　补充上述营养素者可使胎鼠脑膨出率下降 (P<0 .0 1 ) ,胎鼠平均体重增加 (P<0 .0 5 ) ,上枕骨骨化程度提高 (P<0 .0 1 )。补充叶酸 +VC+VB6+牛磺酸组 ,与单独补充叶酸组比较 ,脑膨出率降低明显 (P<0 .0 5 ) ,上枕骨骨化程度提高 (P<0 .0 1 )。结论　叶酸有明显的促进胚胎发育和拮抗环磷酰胺致畸的作用 ,且与 VC、VB6及牛磺酸联合应用的效果明显优于单独补充。     

细胞凋亡在环磷酰胺致大鼠神经管畸形中作用

目的 探讨细胞凋亡在环磷酰胺致大鼠神经管畸形发生中的作用。方法 利用环磷酰胺致大鼠神经管畸形的模型,体内实验利用光镜、透射电镜的方法进行检测,而在体外实验中利用倒置相差显微镜、流式细胞仪和单细胞凝胶电泳的技术检测细胞凋亡在其发生中的作用。结果 (1)光镜病理切片观察到,细胞核浓缩深染并碎解成许多碎片;(2)透射电镜观察可见细胞核固缩以及染色质分布欠均匀等细胞凋亡的特征性变化;(3)倒置相差显微镜观察发现加有环磷酰胺的组别漂浮细胞增多,神经突触变短,存活细胞数减少,网络变稀疏;(4)流式细胞仪检测发现有明显的“凋亡峰”的出现;而通过单细胞凝胶电泳实验检测时出现明显的“彗星状细胞”。结论 细胞凋亡是导致神经管畸形发生的重要作用机制之一。     

被动吸烟致神经管缺陷的形态学观察

目的　探讨香烟烟雾致畸的可能机理。方法　利用体视显微镜和电镜技术 ,观察被动吸烟对金黄地鼠神经管形成的影响及神经上皮细胞超微结构的变化。结果　被动吸烟对胚胎有显著的致畸作用 (χ2 =5 1 2 8,P <0 0 1) ,香烟烟雾导致的神经管畸形主要表现为脊柱裂、露脑等。各被动吸烟组胚胎神经上皮细胞排列不规则 ,细胞间隙增宽 ,游离面微绒毛短缩 ,有的微绒毛末端膨大 ,甚至形成若干不规则的胞质突起 ;细胞质中出现许多空泡 ,线粒体膨胀 ,嵴减少甚至消失 ,有的线粒体伸长 ;细胞核形态不规则 ,核周间隙局部扩张 ,可见有形物质 ,异染色质增多 ,细胞核固缩或裂解现象增多 ;有的死亡细胞裂解形成多个凋亡小体 ,在其邻近的正常细胞质内可见被吞噬的凋亡小体。结论　被动吸烟能引起金黄地鼠胚胎神经系统发育异常 ,诱导神经上皮及其周围间充质细胞变性、死亡 ,使细胞数量减少 ,从而导致了神经管的形成和分化异常 ,使神经管延迟闭合或不闭合。     

缺氧-复氧对肾小管上皮细胞内DRP1及OPA1表达的影响

目的:探讨缺氧-复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)后人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)内动力相关蛋白1(Dynamin related protein 1,DRP1)及视神经萎缩症蛋白1(optic atrophy,OPA1)表达的变化。方法:以人近曲肾小管上皮细胞株为研究对象,将培养细胞随机分为正常对照组和H/R组。正常对照组常规培养,H/R组先缺氧24h,然后复氧培养6h。光镜观察细胞形态变化,CCK-8检测细胞活力,透射电子显微镜观察线粒体形态改变,免疫组织化学法检测细胞内DRP1和OPA1蛋白表达。结果:H/R组与对照组相比,细胞活力下降,线粒体出现凋亡相关改变,OPA1表达减少而DRP1的表达增加。结论:缺氧-复氧可导致HK-2细胞发生凋亡相关改变,其机制可能与诱导线粒体形态相关蛋白DRP1、OPA1的表达改变相关。