EMMPRIN基因表达对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨特异性小分子干扰（small interference,siRNA）抑制人脑胶质瘤U251细胞株内细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）基因的表达后,对U251细胞株增殖、凋亡的影响。方法构建EMMPRIN基因小干扰RNA,转染人胶质瘤U251细胞株,运用半定量RT-PCR及Western blot的方法验证转染组及对照组的胶质瘤细胞EMMPRIN基因mRNA及蛋白的表达水平,通过MTT法观察转染48 h后对U251细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染48 h后U251细胞周期及凋亡的改变。结果 EMMPRIN基因的特异性siRNA转染U251细胞后,EMM-PRIN基因的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加。结论 EMMPRIN基因的特异性siR-NA能抑制胶质瘤U251细胞株的增殖,促进细胞凋亡。     

Schlafen2基因在细胞中的表达及其生物学特性研究

目的:建立Schlafen2(Slfn2)基因稳定表达的细胞系以进一步研究其生物学功能.方法:构建pEGFP- Slfn2真核表达载体;瞬时转染pEGFP- Slfn2载体及其对照载体于NIH/3T3细胞,观察细胞中Slfn2基因的表达及分布;稳定转染pEGFP-Slfn2及其对照空载体于NIH/3T3细胞,G418筛选获得抵制的细胞株,用Northern印迹进一步鉴定Slfn2在各细胞株中的表达情况;利用细胞生长曲线和Transwell细胞侵袭实验检测Slfn2对细胞增殖及迁移能力的影响.结果:本研究获得了稳定表达Slfn2的细胞株,该基因表达的蛋白在细胞核及细胞浆均有分布;稳定表达该基因的细胞株的增殖及迁移能力均显著降低.结论:Slfn2基因可能是一个潜在的肿瘤抑制基因.     

大鼠胚胎肺上皮细胞在肿瘤形成过程中伴发的p53基因突变及辐射敏感性的增强

实验选择4株来源于同一细胞群体,但代表肿溜形成过程中不同阶段的细胞株(BP. BPwt、HE和BP-T)进行研究,其中HE细胞株是在BP细胞培养23代时从转化灶中分离出来,BP-T细胞株则来源于将BP细胞注入同基因小鼠中所形成的肿瘤组织,它们均可在p53基因的130密码子处发生AAG→AGG突变。     

人乳腺癌B7-H3分子的高表达及其抑制T淋巴细胞活化增殖作用的机制

目的探讨乳腺癌组织及细胞中高表达协同刺激分子B7-H3对T淋巴细胞作用的机制。方法 RT-PCR及流式细胞仪方法分析乳腺癌组织及细胞中B7-H3基因的高表达,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,采用脂质体法转染乳腺癌细胞株MCF-7,采用免疫荧光标记和流式细胞术分析在MCF-7细胞上的表达。继而,利用CCK8法和酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析B7-H3基因干扰细胞株对T细胞体外增殖和细胞因子的分泌。结果乳腺癌组织和细胞中高表达B7-H3分子,成功通过RNAi技术构建低表达B7-H3基因乳腺癌细胞株。体外生物学功能分析表明,与转染空载体的MCF-7/mock细胞相比,B7-H3表达干扰细胞能有效增强T细胞增殖以及对IFN-γ的分泌。结论乳腺癌中高表达协同刺激分子B7-H3能有效逃避T淋巴细胞对其的作用和杀伤。     

mag-1基因与肿瘤细胞转移的相关性研究

目的:探讨mag-1基因与肿瘤细胞转移的关系.方法:检测mag-1在人肺巨细胞癌高低转移细胞株PLA801D与PLA801C、肺癌高低转移细胞株A549与H1299及乳腺癌高低转移细胞株MCF-7与MDA-MB-231中mag-1的表达水平;检测构建的mag-1正反义真核表达载体转染细胞后mag-1表达水平的变化;将mag-1正义表达载体分别转染低转移细胞株PLA801C及MCF-7并筛选出稳定克隆;研究mag-1过表达对细胞形态、增殖、迁移、黏附及侵袭等生物学行为的影响.结果:高转移细胞株PLA801D中mag-1的mRNA及蛋白表达水平均显著高于低转移细胞株PLA801C中mag-1的表达水平,乳腺癌高低转移细胞株中mag-1的蛋白表达水平也有明显的差异;过表达mag-1细胞的形态及增殖能力没有发生改变,而细胞的黏附、迁移及侵袭能力增强.结论:mag-1可能促进肿瘤细胞的转移.     

Syk表达对乳腺肿瘤细胞侵袭迁移作用的影响

目的:探讨脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)在人乳腺癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响.方法:RT-PCR法、免疫荧光法检测不同侵袭能力乳腺癌细胞株--MCF-7(低侵袭性)和MDA-MB-231(高侵袭性) Syk mRNA及蛋白的表达;采用脂质体介导的方法,将Syk基因导入Syk(-)乳腺癌细胞株,利用Transwell小室法检测Syk基因对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响.结果:Syk mRNA及蛋白在MCF-7细胞中呈中等程度表达,在MDA-MB-231中表达缺失;转染Syk基因的MDA-MB-231细胞与转染空载体及未转染MDA-MB-231细胞相比,侵袭及迁移实验中的穿膜细胞数(总迁移细胞数/5HPF)均明显减少(P＜0.05).结论:Syk表达可降低乳腺肿瘤细胞体外侵袭迁移能力.     

黑色素瘤细胞经太空环境诱变后致瘤性和基因表达变化

目的 筛选经太空环境诱变后B16细胞致瘤性改变的细胞株,观察其基因表达的改变,寻找与黑色素瘤发生及转移密切相关的基因.方法 将小鼠黑色素瘤B16细胞搭载于第20颗返回式卫星,返地后克隆化,随机选择5株克隆细胞株（1^#、5^#、6^#、7^#和8^#）,接种C57BL/6J小鼠,分别观察细胞致瘤性、荷瘤小鼠生存期及瘤体病理变化,用基因表达谱分析其中2株初筛致瘤性改变细胞株（1^#和8^#）的基因表达情况。结果 与对照组比较,1#细胞株接种小鼠后,肿瘤潜伏期延长（P＜0.05）,1^#和8^#细胞株移植瘤瘤体重量减小（P＜0.01）,且荷瘤小鼠生存期延长（P＜0.01）;病理诊断结果显示：1^#和8^#细胞移植瘤内血管不及对照组丰富,坏死区较少,瘤体内浸润淋巴细胞较对照组有不同程度的增多,瘤旁组织内有较多淋巴细胞;基因芯片分析结果表明：与对照B16细胞相比,2株诱变细胞（1^#和8^#）分别有145和125个基因表达水平发生改变（P＜0.05）,其中9个基因为共同变化基因,前列腺素D2合成酶基因在2株细胞中的表达均明显增高,与对照相比,差别在5倍以上。结论 1^#和8^#细胞株致瘤性减弱,且2株细胞的移植瘤肿瘤新生血管及癌旁浸润减少,癌旁组织中有较多淋巴细胞,推测可能与前列腺素D2合成酶等多种肿瘤相关基因表达的改变有关。     

实时荧光定量RT—PCR检测胃癌细胞中MRP2、MRP3及MRP5mRNA的表达

目的研究多药耐药相关蛋白2（MRP2）基因及MRP3、MRP5基因在正常胃细胞系GES-1、胃癌细胞株（BGC-823）及胃癌耐药细胞株BGC-823／ADM的表达差异,并探讨其在胃癌耐药中的意义。方法分别提取GES-1、BGC-823及BGC-823／ADM细胞的总RNA,逆转录cDNA,利用实时荧光定量PCR,根据标准品绘制标准曲线,检测MRP2、MRP3、MRP5基因的表达水平。结果MRP2基因在胃癌耐药细胞株BGC～823／ADM细胞中的表达量明显高于在胃癌细胞株（BGC-823）的表达,而与其在正常胃细胞系GES-1的表达没有显著性差异;MRP3、MRP5基因表达量在三种细胞中均有显著性差异。结论MRP2可能参与了胃癌的内在性耐药,而MRP3、MRP5可能与胃癌的获得性耐药有关,实时荧光定量方法是一种灵敏度高,特异性强,重复性好的定量检测方法。     

同源盒基因Lhx4在PC12细胞缺氧损伤保护中的作用

目的:转染并筛选Lhx4高表达的PC12细胞株,观察Lhx4基因对PC12细胞的缺氧保护作用.方法:①用RT-PCR检测PC12细胞缺氧培养后Lhx4基因的表达变化;②Lhx4基因连接至pLXIN逆转录病毒载体,收集病毒上清,感染PC12细胞,G418筛选阳性克隆,PCR鉴定,所筛选的克隆缺氧培养;③通过台盼蓝染色和培养液中乳酸脱氢酶活性的检测评价PC12细胞的存活状态.结果和结论:PC12细胞缺氧培养4 h后Lhx4基因的表达明显上调;缺氧8 h后Lhx4基因表达开始下调.所筛选的Lhx4高表达转染细胞株表现出明显的缺氧耐受性,相同的损伤条件下,细胞的存活数目及生存状态明显优于对照组.说明Lhx4基因在PC12细胞的缺氧损伤保护中具有重要的作用.     

利用CRISPR/Cas9系统构建Slc35c1敲除细胞株及其抗蓖麻毒素效应研究

目的 构建稳定敲除小鼠Slc35c1基因的单克隆细胞株,为研究Slc35c1基因抗蓖麻毒素毒性效应奠定实验基础.方法 根据Slc35c1基因序列设计2对sgRNA插入载体lentiCRISPRv2中,构建lentiCRISPRv2-sgRNA质粒;慢病毒包装并感染NIH/3T3细胞,加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;T7E1酶切鉴定sgRNA切割效率;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行RT-qPCR检测及基因组PCR产物测序,确认Slc35c1敲除成功的细胞株;最后通过CCK-8试剂检测蓖麻毒素对野生型和Slc35c1敲除细胞对的抗毒效应差异.结果 测序结果显示sgRNA成功插入载体质粒中,T7E1酶切结果表明两对sgRNA均可高效切割基因组DNA.RT-qPCR及基因组PCR产物测序鉴定出Slc35c1敲除的纯合子细胞株.CCK-8实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除Slc35c1使毒素作用NIH/3T3细胞24 h的IC50值由0.45×10-10 mol/L升至2.1×10-10 mol/L.结论 利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除了NIH/3T3细胞中的Slc35c1基因并筛选获得纯合子细胞株,该细胞株可用于抗蓖麻毒素效应的研究.     

利用CRISPR/Cas9系统构建HeLa细胞Cdc25C基因敲除稳定细胞株

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类宫颈癌细胞HeLa中的细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 homolog C,Cdc25C)基因,构建Cdc25C基因稳定敲除细胞株.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别Cdc25C基因第一外显子相关序列的上下游小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选稳定敲除Cdc25C基因细胞株,再用免疫印迹方法鉴定细胞Cdc25C敲除效果.最后用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响.结果 筛选出稳定敲除Cdc25C基因细胞株,且Cdc25C敲除显著影响G2/M期进程.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源Cdc25C基因敲除细胞株,为研究Cdc25C在细胞周期进程的功能以及相关癌症的发生奠定了基础.     

表达人HER2/neu及荧光素酶的小鼠乳腺癌模型的建立

目的建立表达HER2/neu表皮生长因子受体及萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞模型。方法将重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体与荧光素酶报告基因依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,用G418与潮霉素加压筛选阳性克隆,Western印迹及活体成像技术鉴定HER2/neu和荧光素酶在4T1细胞中的表达。在BALB/c小鼠前肢乳腺皮下注射该细胞1.5×106个,活体成像观察肿瘤的生长及转移。结果与结论经过两步转染获得抗G418及潮霉素4T1细胞,Western印迹结果显示,该细胞高表达HER2/neu。流式细胞术检测结果提示几乎所有细胞均有GFP的表达。用该细胞株接种小鼠后具有与野生型4T1细胞相似的成瘤性和转移能力。实验结果提示,我们已建立可表达HER2/neu表皮生长因子受体及荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞株,为乳腺癌的研究提供一个良好的模型。     

表达人HER2/neu及荧光素酶的小鼠乳腺癌模型的建立

目的建立表达HER2/neu表皮生长因子受体及萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞模型。方法将重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体与荧光素酶报告基因依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,用G418与潮霉素加压筛选阳性克隆,Western印迹及活体成像技术鉴定HER2/neu和荧光素酶在4T1细胞中的表达。在BALB/c小鼠前肢乳腺皮下注射该细胞1.5×106个,活体成像观察肿瘤的生长及转移。结果与结论经过两步转染获得抗G418及潮霉素4T1细胞,Western印迹结果显示,该细胞高表达HER2/neu。流式细胞术检测结果提示几乎所有细胞均有GFP的表达。用该细胞株接种小鼠后具有与野生型4T1细胞相似的成瘤性和转移能力。实验结果提示,我们已建立可表达HER2/neu表皮生长因子受体及荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞株,为乳腺癌的研究提供一个良好的模型。     

稳定转染小鼠IL-17全长基因的乳腺癌细胞株的建立及基因转染对4T1细胞的影响

目的建立稳定转染小鼠IL-17基因全长的小鼠乳腺癌4T1细胞株,并进行鉴定。方法脂质体法将携带小鼠IL-17基因全长的真核表达载体pcDNA3．1转染小鼠乳腺癌细胞4T1,经G418筛选出稳定表达IL-17的细胞株;镜下观察细胞形态,RT-PCR法、Western印迹和激光共聚焦法检测目的基因和蛋白的表达;收集转染和未转染IL．17的4T1细胞的培养上清,分别与巨噬细胞RAW264．7共培养,ELISA法检测RAw264．7细胞培养上清中IL-6水平;MTS法检测细胞的增殖情况,流式细胞技术检测细胞周期、凋亡以及细胞表面MHCI、MHC11、淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）等分子表达。结果获得1株稳定表达IL-17的4T1细胞,而且其培养上清可刺激小鼠巨噬细胞RAW264．7产生IL-6,证明该细胞可表达功能性IL-17。结论成功建立了稳定转染IL-17基因的小鼠乳腺癌细胞株。     

更昔洛韦对TK基因转染的淋巴瘤细胞的抑制作用

 目的探讨GCV对TK基因转染的淋巴瘤细胞生长的抑制作用.方法利用缺陷型逆转录病毒介导的TK基因(RV-HSV-TK)转染淋巴瘤细胞,细胞增殖实验(MTT法),研究GCV对转染TK基因阳性淋巴瘤细胞株杀伤作用.结果转染了TK基因的淋巴瘤细胞的生长曲线与未转染TK基因的细胞无差异.0.1～50μg/ml的GCV对转染阳性细胞有明显的毒性作用,杀伤效应与时间成正比.Hut-tk细胞对Hut细胞具有旁观者效应.结论RV-HSV-TK系统对淋巴瘤细胞有较高的转染效率,转染了TK基因的淋巴瘤细胞对GCV敏感.     

人MEPE基因稳定表达细胞系的建立及MEPE蛋白在DNA损伤应答中的功能初探

目的构建人MEPE基因真核表达载体,稳定转染人胚肾293T细胞,并建立稳定表达细胞株;初步探讨人MEPE蛋白在DNA损伤应答中的作用。方法将人MEPEcDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建重组质粒;分别将载体pREP10/MEPE-HA和pREP10/HA转染293T细胞;经潮霉素B加压筛选阳性克隆;用RT-PCR和免疫印迹方法分别在RNA水平和蛋白水平鉴定稳定表达MEPE-HA融合蛋白的阳性细胞株;利用一定浓度的DNA损伤诱导剂喜树碱（camptothecin,CPT）处理细胞,通过MTT比色法检测不同时间点细胞存活率的变化,其趋势即可反映出不同细胞株对DNA损伤诱导剂的敏感性。结果经酶切鉴定及序列分析,人MEPE基因真核表达载体pREP10/MEPE-HA构建正确,转染人293T细胞,筛选出MEPE表达较高的细胞株,并且发现该基因的高表达可以使细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性提高。结论成功建立了稳定表达人MEPE的293T细胞株,并对人MEPE蛋白在细胞中对DNA损伤诱导剂敏感性的影响进行了初步探讨,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。     

紫杉醇对卵巢癌耐药细胞SKOV3／TAX基因表达谱的影响及耐药机制的探讨

目的应用高通量Affymetrix人类基因组U133A基因芯片,比较耐药细胞SKOV3／TAX与亲代细胞SKOV3间基因表达差异,筛查获得性紫杉醇卵巢癌耐药的相关基因,为进一步探讨卵巢癌肿瘤耐药机制及临床逆转耐药提供依据。方法取对数生长期SKOV3、SKOV3／TPT细胞,按Trizol一步法抽提细胞总RNA,使用RNeasy Total RNA Isolation kit进一步纯化总RNA,合成双链cDNA,生物素进行标记,应用Affymetrix人类基因组U133A基因芯片,检测卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAX与敏感细胞株SKOV3细胞基因表达谱的变化,选择差异表达基因,在genbank中明确差异表达基因的功能,寻找与卵巢癌对紫杉醇耐药相关基因。结果基因芯片检测结果发现,与敏感细胞相比,有111条基因表达有显著性差异,包括45个上调基因和66个下调基因。涉及癌基因、DNA合成、修复、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成类以及细胞骨架和运动、离子通道蛋白、细胞代谢、发育相关等相关基因。与耐药有关的上调基因有CLU、BCL2L1、CD24、POR、BSG、SIRPA、PRKCA等;下调基因有YES1、CAV1、TGFBI、HSPH1等。结论部分基因表达差异与卵巢癌应用紫杉醇化疗耐药有关。     

利用CRISPR／Cas9系统构建H22细胞GP73基因敲除稳定株及功能鉴定

目的：利用CRISPR／Cas9基因编辑系统敲除小鼠源肝癌细胞H22中的GP73基因,构建H22细胞GP73基因敲除的稳定细胞株。方法根据CRISPR／Cas9靶点设计原则,设计2条特异性识别GP73基因启动子的上下游sgRNA,利用载体pX459质粒,构建2对重组真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染至H22细胞内,使用嘌罗霉素加压筛选稳定敲除GP73的H22细胞株,利用免疫印迹检测重组质粒对内源GP73的敲除效果。MTT实验检测GP73被敲除后对细胞增殖能力的影响,再利用划痕实验检测细胞的迁移能力。结果免疫印迹结果说明敲除GP73基因的小鼠源H22细胞株内无GP73蛋白的表达;并且GP73被敲除后,H22细胞的增殖能力和迁移能力减慢。结论通过CRISPR／Cas9系统获得了靶向GP73基因的重组质粒,并且筛选出了稳定干扰GP73表达的细胞株,从而为探讨GP73在肝癌发生中的作用奠定基础。     

ASPP1基因mRNA在肿瘤细胞株中的表达初探

目的 建立p53凋亡刺激蛋白基因(ASPP1)mRNA表达水平的RT-PCR测定方法;并应用该方法测定ASPP1 mRNA在正常人单核细胞与白血病细胞株Jurkat,HL-60、K562中的表达水平.方法 应用单核细胞分离液分离正常人血液单核细胞,用RPMI 1640培养液培养细胞株Jurkat、HL-60.K562,所得细胞用Tripure分离试剂提取总RNA,用RT-PCR扩增.取ASPP1基因和β-actin基因的扩增产物各10μl,行溴钇锭染色,在琼脂糖凝胶上进行电泳,检测AsfIP1 mRNA的表达水平.对ASPP1基因表达量与β-actin表达量的比值进行比较,从而计算ASPP1在各细胞株的相对表达量.结果 在正常人单核细胞和各自血病细胞株中均有ASPP1基因的mRNA表达,ASPP1与β-actin的比值在正常人单核细胞中为0.545±0.019,而在白血病细胞株Jurkat、HL-60、K-562中分别为0.155±0.081、0.199±0.016、0.191±0.015,可见ASPP1 mRNA在正常细胞中的表达水平比在白血病细胞株Jurkat、HL-60、K-562中的表达水平高(P＜0.01).结论 在肿瘤的发生、发展中,ASPP1与p53共同作用,形成ASPP-p53复合物作用于原凋亡基因启动子,能特异性增强p53结合DNA的能力,促进p53诱导细胞凋亡的作用.ASPP1的这种功能在抑制正常细胞恶性转化的过程中有重要作用.     

重组腺病毒介导mlL—12基因转染的EL—4细胞生物学特性的研究

目的：观察ｍＩＬ－１２基因转染的大鼠ＥＬ－４细胞（Ｃ５７ＢＬ／６小鼠Ｔ淋巴瘤细胞株）体外生物学特性的改变。方法：阳离子脂质体协同ＩＬ－１２重组腺病毒感染ＥＬ－４细胞。结果及结论：基因转染的ＥＬ－４细胞有ｍＩＬ－１２的ｍＲＮＡ表达,培养上清中可以检测到ｍＩＬ－１２的生物学活性。与野生型ＥＬ－４细胞相比,ｍＩＬ－１２重组腺病毒感染的ＥＬ－４细胞形态及体外增殖能力无明显改变,转染细胞的成瘤性降低,此外,