抗RSV人-鼠嵌合抗体的构建及表达

用RT PCR法克隆抗RSV 鼠单抗4C2 的轻、重链可变区基因, 构建了轻、重链分别表达的载体pAG4622_4C2 和pAH4604 4C2, 及轻、重链同时表达的载体pdHL4C2, 分别转染SP2/0 细胞和DHFR- CHO细胞, 检测培养上清中的嵌合抗体表达。结果在pdHL4C2 转染的CHO 细胞中检测出了可与表达RSVG/F糖蛋白的143TK 细胞结合的人 鼠嵌合抗体     

CD137(人4-1BB)在dhfr-CHO中的表达及活性研究

目的 :构建CD137真核高效表达系统 ,深入研究CD137及其配体在细胞信号转导中的作用。方法 :将构建有CD137全长cDNA序列的pCDNA3质粒 (CMV ILA SEN ,CIS)及pSV2 dhfr(含二氢叶酸还原酶基因 ) ,运用脂质体介导法共转染二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞 (dhfr CHO) ;用G4 18筛选出阳性克隆 ;MTX压力选择系统诱导CD137在dhfr CHO细胞的高效表达 ;RT PCR、免疫细胞化学法及流式细胞术测定CD137的表达情况 ;3H TdR掺入法进行活性研究。结果 :CD137为膜型表达 ,CIS转化dhfr CHO细胞CD137表达率为 96 0 7% ;活性研究显示CD137膜蛋白轻度促进抗CD3单抗诱导的PBMC增殖。结论 :获得高效表达CD137的CHO细胞株 ,CD137膜蛋白促进抗CD3单抗诱导的PBMC增殖。     

通过载体DHFR基因的弱化提高抗体在CHO细胞中的表达

目的:提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体在二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞株(CHO/DHFR-)中表达的产量。方法:对表达载体中DHFR基因表达调控序列进行一系列的删除突变和点突变后,构建不同的嵌合抗体表达载体。用这些载体转染CHO细胞并以递增量的氨甲喋呤(MTX)筛选,用ELISA法测定每个加压水平的各组细胞中抗体的表达水平。结果:通过对表达载体中DHFR基因表达调控序列的突变,使DHFR的基础表达水平产生了不同程度的弱化。转染CHO细胞后,可明显提高MTX加压增加抗体表达的效果,抗体表达水平的增加基本与DHFR基因的弱化程度呈正相关。从弱化程度最高的pWS2-BDI组中,我们筛选得到表达量达55μg/(106细胞·24 h)的高表达细胞株,经锌离子进一步诱导后,表达量可达100μg/(106细胞·24 h)以上。结论:弱化表达载体中DHFR的表达,可提高MTX对工程抗体表达的增加效果。     

人糖基磷脂酰肌醇(GPI)-B7-1真核表达载体的构建及表达

目的：在仓鼠卵巢细胞CHO细胞中高效表达糖基磷脂酰肌醇GPI-B7-1(B7-1即CD80)融合蛋白，获得大量融合蛋白以研究GPI-B7-1在肿瘤治疗中的应用潜力。方法： 构建真核表达载体pc3.1/GPI-B7-1，利用脂质体lipofectamine 2000将其转染CHO细胞，G418加压筛选抗性克隆，流式细胞仪检测细胞膜上GPI-B7-1融合蛋白的表达情况，SDS-PAGE、Western blot分析鉴定其免疫活性。结果： 真核表达载体转染CHO细胞经G418筛选后，流式细胞分析证实为GPI锚定蛋白，SDS-PAGE在60 kD左右蛋白表达量明显高于对照组，在Western blot 在60 kD左右有一条强的棕色条带，说明GPI-B7-1在CHO中得到表达。结论： 在CHO细胞中高效表达GPI-B7-1融合蛋白，可获得大量融合蛋白，对进一步研究GPI-B7-1在肿瘤治疗中的应用打下基础。     

人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体的构建和表达

目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSeetag2/seFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达.方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体psectag2,构建重组载体pSectag2/scFv,测序鉴定后,电转染CHO细胞,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况.结果:将750 bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag2/scFv.将pSectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达.SDS-PAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34 000.结论:成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv,并在CHO细胞中获得表达,为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据.     

转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用

目的 构建转染小鼠可诱导共刺激分子配体(ICOSL)基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株(CHO/ICOSL),探讨其对T细胞体外增殖与活化的促进作用.方法 从小鼠脾脏细胞中抽提总RNA,采用RT-PCR的方法获得小鼠ICOSL基因,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后装入EGFP-pIRES2真核表达载体中并测序鉴定,用脂质体转染技术将重组载体EGFP-pIRES2/ICOSL转染CHO细胞,经G418加压筛选,流式细胞术和RT-PCR分析其在CHO细胞中的表达.以转染空载体CHO细胞(CHO/Mock)作为对照,将CHO/ICOSL细胞与T细胞体外共培养,通过检测活化T细胞上CD25、CD69的表达及T细胞增殖实验对小鼠ICOSL转基因细胞的生物学功能进行初步研究.结果 CHO/ICOSL基因转染细胞能稳定地高表达小鼠ICOSL分子.与CHO/Mock相比,CHO/ICOSL基因转染细胞能够显著促进T细胞的体外活化与增殖(P＜O.05).结论 成功构建稳定表达小鼠ICOSL的基因转染细胞株,该细胞株能显著促进T细胞的体外活化与增殖,为进一步深入研究该分子生物学功能奠定了基础.     

人突变CD59基因在CHO细胞的表达、检测及生物活性研究

目的：分别构建两个高效表达人突变CD59的CHO细胞真核表达系统，探讨突变CD59基因表达蛋白糖基化前后抗补体活性的变化，为在基因水平阐明糖尿病血管增殖症的发病机理奠定基础。方法：将两种含不同突变基因的人CD59全长cDNA序列（HM7、HM8）的重组pALTER质粒运用阳离子脂质体导入法共转染CHO细胞，用含有400μg/ml新霉素类似物（G418）的F12培养基筛选出阳性表达克隆，应用荧光免疫组化（FIH）检测CD59在CHO细胞表面的表达。经染料释放试验检测突变CD59糖基化前后抗补体活性。结果：运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒与pcDNA3质粒共转染CHO，成功筛选出的阳性克隆经FIH证明突变CD59可在CHO细胞表达。染料释放法证实两种突变CD59均具有抗补体活性，且在高糖环境下易糖基化，糖基化后抗补体活性明显降低。结论：建立了两个高效表达突变CD59的真核表达系统，获得阳性克隆细胞株。初步研究证实突变CD59具有抗补体活性，糖基化后抗补体活性明显降低，为单克隆抗体的制备奠定了基础。     

抗人角蛋白全IgG基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建抗角蛋白抗体基因的真核表达载体，并在CHO(dhfr^-)细胞中表达。方法：从含抗角蛋白抗体基因的原核Fab表达载体中，扩增VH及VL基因。以回收的PCR产物为模板，用重叠PCR扩增带有前导序列的VH、VL基因。经XbaⅠ/BamHⅠ和XhoⅠ/HindⅢ酶切后，分别插入真核表达载体pWD中，构建重组载体pWDkH。经PCR和测序鉴定正确后，用lipofectAMINE2000转染CHO(dhfr^-)细胞。取培养上清检测抗人角蛋白全IgG的表达。结果：构建了抗人角蛋白基因的真核表达载体pWDkH，并在CHO(dhfr^-)细胞中表达：结论：在CHO(dhfr^-)细胞中成功地表达了具有抗原结合活性的抗人角蛋白IgG，为其临床应用奠定了基础。     

大鼠重组骨桥蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达和纯化

目的 构建包含大鼠骨桥蛋白(OPN)的真核表达载体,获得稳定表达重组蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对蛋白进行纯化,为OPN在大鼠模型实验中的进一步功能学研究奠定基础.方法 通过脂质体lipofectamine 2000将重组质粒pLVX-OPN转染到CHO细胞中,嘌呤霉素筛选出稳定克隆细胞.Real-time PCR法检测转染后CHO细胞中OPN的mRNA表达水平,酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测上清中OPN分泌水平.取CHO细胞72 h无血清培养上清进行镍柱亲和层析纯化,ELISA法和Western blot法分别检测产量和纯度.结果 pLVX-OPN表达载体经DNA琼脂糖电泳鉴定为阳性,且质粒测序成功.经质粒pLVX-OPN转染的CHO细胞中OPN mRNA表达水平是转染前的上千倍,上清分泌蛋白水平较转染前增加.上清分泌的OPN蛋白通过镍柱亲和层析纯化后纯度有所提高,产量在30％以上.结论 pLVX-OPN真核表达载体的成功构建和在CHO细胞中的稳定表达及纯化为OPN的功能学研究提供了有效工具.     

人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达

目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。     

人胰岛素样生长因子-1的真核表达及其生物学功能研究

目的：构建人胰岛素样生长因子1（IGF-1）分泌型真核表达载体，并检测表达产物的生物活性。 方法：用RT-PCR法从人肝细胞克隆IGF-1基因，并将其连入Psec Tag/FRT/V5-His载体，用脂质体法转染CHO细胞，将转染细胞上清培养骨髓基质干细胞，用MTT法测定骨髓基质干细胞的增殖情况。 结果：成功扩增210 bp的IGF-1基因，表达产物经SDS-PAGE分析及Western blotting检测具有7.7 kD特异性条带。骨髓基质干细胞的增殖随转染细胞上清的浓度、转染细胞上清培养时间的增加而增加。 结论：成功构建分泌型IGF-1真核表达载体，其表达产物对骨髓基质干细胞具有促增殖作用。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

GPI-B7-1分子膜表面修饰瘤苗抗肿瘤作用的研究

目的：研制抗肿瘤免疫治疗的新疫苗。方法: 用含目的基因的质粒pcDNA3.1(+)/GPI-B7-1转染QK10341细胞，提取膜蛋白GPI-B7-1, 经Western blotting鉴定后，用蛋白转化法锚定在肿瘤细胞SKOV3膜上，取正常健康人外周血中非贴壁的淋巴细胞， 进行淋巴细胞扩增和CTL功能检测，并检测细胞培养液中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平，FCM检测CTL的Fas表达水平。结果:与野生型SKOV3细胞比较，用GPI-B7-1修饰的SKOV3细胞能够更有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异CTL杀伤活性(P<0.01)，还可诱导 CTL表达的Fas水平升高等活性增强以及分泌的IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子水平均显著上升(P<0.05)。结论: B7-1基因在肿瘤细胞中表达可增强其免疫原性，在体外有效诱导T细胞活化， 显著增强T细胞杀伤肿瘤细胞的活性；对防治肿瘤侵袭具有一定作用。     

小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应

目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒，表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白，初步探讨其体外生物学效应。方法 借助RT-PCR技术，从小鼠脾脏总FLNA中扩增4-1BB全长编码基因，并导入克隆载体pGEM-T Easy。经测序证实，用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3．1中。应用脂质体将重组子pcDNA3．1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞，经G418筛选，获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株。双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达，经蛋白A亲和层析纯化，借助免疫印迹进行鉴定。应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2．4表面4-1BBL结合情况。采用MTT及CFSE（羧基荧光素乙酰乙酸）标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用。结果 经测序证实，所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确；ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用。结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达，可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制。并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础。     

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。     

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的 克隆人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）F基因,构建F基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/F,并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因,然后克隆到pGEM-3zf载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,行酶切鉴定,脂质体法转染COS-7细胞,应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSVF基因序列,序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSVF基因,并在真核细胞中获得表达。     

Conformationally appropriate expression of the Toxoplasma antigen SAG1 (p30) in CHO cells.

The Toxoplasma gondii major surface antigen, called SAG1 or p30, is a highly immunogenic protein which has generated great interest as a diagnostic reagent, as a potential subunit vaccine, and for its role in invasion. Unfortunately, bacterial recombinant protein is grossly misfolded so that, for example, it is not effectively recognized by antibodies to native SAG1. To overcome this, we have turned to expression in CHO cells, using cotransfection of the SAG1 gene and the mouse dihydrofolate reductase (DHFR) gene into CHO cells that are DHFR-. SAG1 expression was amplified by methotrexate coselection of CHO cells in combination with fluorescence-activated cell sorting for SAG1 expression. The resulting population expressed recombinant SAG1 that is recognized by antiserum specific for natural, nonreduced SAG1, indicating that, unlike in bacteria, expression in CHO cells results in proper folding. Processing was at least partially correct in that, like natural SAG1, recombinant SAG1 was attached to the plasma membrane via a glycolipid anchor, although tunicamycin treatment was necessary to prevent N-glycosylation (SAG1 is not glycosylated in the parasite but does have a consensus N-linked site). Finally, purified recombinant SAG1 was recognized by human sera known to be reactive to toxoplasma proteins, indicating that this material has potential as a diagnostic reagent and possibly as a component of a subunit vaccine.     

Expression of GFP-tagged low affinity Na+-dependent glucose transporter in Xenopus oocytes and CHO cells

A low-affinity and high-capacity Na(+)-dependent glucose transporter (SGLT2) was inserted into the expression vector tagging of green fluorescent protein (EGFP). The protein expression and glucose transport activity were examined in Xenopus oocytes and Chinese hamster ovary (CHO) cells. In Western blotting analysis, EGFP-tagged SGLT2 protein expressed in both Xenopus oocytes and CHO cells. We also observed the EGFP fluorescence in both cells with a confocal laser microscope. To determine the function of EGFP-tagged SGLT2, we measured the uptake of [(14)C]-alpha-methyl glucopyranoside (AMG), a specific substrate for SGLT. The AMG uptake was time-dependently increased and inhibited by phloridzin in the EGFP-tagged SGLT2-expressing cells. The K(m) value of 1.7 mM for AMG and the IC(50) of 2 microM for phloridzin consist with the renal low affinity Na(+)-dependent glucose transporter. These results indicate that EGFP-tagged SGLT2 protein functionally expressed both in Xenopus oocytes and CHO cells, and these models are useful for studying the regulatory mechanisms of glucose reabsorption.     

Immunoreactivity of Recombinant Carcinoembryonic Antigen Proteins Expressed in Escherichia Coli

Immunoreactivities of recombinant carcinoembryonic antigen (CEA) proteins expressed in Escherichia coli (E. coli) were analyzed in relation to the CEA domain structure [domains N, I (A1—B1), II (A2—B2), III (A3—B3) and M). We reconstructed in a prokaryotic expression vector, pUCPL-cI, the cDNAs for CEA-N, CEA-I. CEA-II, and CEA-III-M. The latter three were expressed as fusion products with bacterial β-galactosidase. The recombinant proteins were solubilized by sonication in 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and purified by preparative SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by electroelution. Their molecular weights Judged from Western blotting coincided with those calculated from their cDNA sequences, respectively. By solid-phase enzyme immunoassays, the immunoreactivities of the purified recombinant proteins were tested with 21 distinct anti-CEA monoclonal antibodies (MAbs) which had been found to recognize the peptide epitopes of the CEA molecule and to be reactive with the recombinant CEA proteins expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells. Fourteen of the 21 MAbs reacted with the recombinant CEA proteins expressed in E. coli and confirmed the localization of the epitopes identified by using the recombinant CEA proteins expressed in CHO cells. The reactivities of 5 MAbs with the recombinant proteins expressed in E. coli were remarkably low when compared with those of the proteins expressed in CHO cells but also confirmed the localization of the epitopes identified with the recombinant CEA proteins expressed in CHO cells. The remaining 2 MAbs did not react with any recombinant protein expressed in E. coli. These results indicate that the fusion CEA-proteins expressed in E. coli are useful in the localization of the epitopes on the polypeptide chains when they reacted with the MAbs tested. However, one third of the epitopes of CEA peptides may be profoundly affected by the presence of disulfide bonds and/or sugar chains which do not seem to be formed well in E. coli.