乳腺癌干细胞的检测及Hedgehog信号通路关键分子的表达

目的:探讨乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中是否存在乳腺癌起始细胞(CD44+/CD24-/low)亚群;并分析Hedgehog信号通路在CD44+/CD24-/low乳腺癌起始细胞亚群中的表达.方法:应用荧光激活细胞分选方法检测与分选MCF-7和MDA-MB-231中的CD44+/CD24-/low细胞亚群和非CD44+/CD24-/low细胞亚群,并在激光共聚焦显微镜下进行观察确认.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测CD44+/CD24-/low细胞亚群和非CD44+/CD24-/low细胞亚群中Hedgehog信号通路重要基因PTCH(human patched gene)、SHH(sonic Hedgehog)、Gii-1(glioma-associated oncogene homoglog-1)和SMOH(smoothened homolog)的表达情况.结果:乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中CD44+/CD24-/low亚群,比例分别为(1.70±1.43)%和(94.2±1.2)%.乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的CD44+/CD24-/low亚群中Hedgehog信号通路处于明显活化状态,其中Hedgehog信号通路中重要下游信号分子Gii-1在MCF-7和MDA-MB-231细胞系CD44+/CD24-/low细胞亚群中的表达要明显高于非CD44+/CD24-/low细胞亚群(P分别为0.007和0.005).结论:乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中存在CD44+/CD24-/low干细胞标志细胞亚群,其中Hedgehog信号通路处于明显活化状态.     

乳腺癌干细胞在无血清培养基K-SFM中的有效富集

摘要:CD24+/CD24-已被证实是乳腺癌干细胞的标记,该群细胞具有致瘤性、克隆形成及转移潜能。但在癌组织中或细胞系中含量极小,对其有效分离及纯化方法的缺乏已成为研究干细胞的主要障碍。本研究应用改良的无血清培养基K-SFM能在乳腺癌原代细胞及已建立的乳腺癌细胞系中体外有效富集CD24+/CD24-细胞群,对乳腺癌干细胞相关基因的检测显示Oct-4、ABCG2、Nanog和N-cadherin显著上调,而E-cadherin显著下调。 方法 1．乳腺癌细胞系培养 人乳腺癌细胞系MCF-7、SKBR-3在含20 ng/ml 表皮生长因子(EGF; R and D Systems, Minneapolis, MN), 5 μg/ml 胰岛素, 0.4% 牛血清白蛋白 (Sigma, St. Louis, MO) 的K-SFM无血清培养基中培养,对照组为含10%小牛血清RPMI 1640培养基培养。37˚C、5%二氧化碳浓度下,恒湿培养箱培养。 2．乳腺癌组织标本原代培养 乳腺癌标本在离体30分钟内获取,进行机械分离,部分需酶消化。用30μm 柱状微孔过滤,制成单细胞悬液,以1000个/ml分别于RPMI-1640全培养基和K-SFM无血清培养基中培养。培养方法同上。 3．流式细胞分析与分选 收集上述方法培养的细胞系以及原代培养细胞,通过流式检测乳腺癌干细胞分子标记CD44+/CD24-/low,确定培养方法对于富集干细胞的有效性。同时通过荧光分选 (FACS),富集CD44+/CD24-/low样细胞制成单细胞悬液。 4．定量RT-PCR分析 收集流式细胞仪分选的K-SFM无血清培养基中细胞及对照分化细胞,提取RNA,通过实时定量 RT-PCR检测干细胞相关基因Oct-4, ABCG2, Nanog 和N-cadherin的表达,以GAPDH作为内参。 结果 在MCF-7细胞系观察到微球体的形成,制成单细胞悬液,应用乳腺癌干细胞表面标记CD44+/CD24-/low标记,经流式细胞仪分选发现MCF-7中干细胞标记细胞占17.3%,较含血清培养基中干细胞比例（0.5%）增加了34.6倍;而 SKBR-3干细胞比例占17.4%,较对照组（0.9%）高28倍。且实时定量 RT-PCR检测显示该群细胞大量表达干细胞相关基因Oct-4, ABCG2, Nanog 和N-cadherin。在人乳腺癌组织作原代培养也得出相似结论。     

乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群初步研究

目的:检测不同乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群含量,并探讨使乳腺癌细胞系MCF-7中肿瘤干细胞相关亚群富集的方法.方法:利用流式细胞仪检测3种乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s中SP细胞(side population cells)比例及CD44 CD24-/low细胞比例.用Percoll不连续密度梯度法分离MCF-7细胞亚群,利用流式细胞仪筛选出SP细胞富集的亚群.用添加生长因子的无血清培养液培养MCF-7,检测其中CD44 CD24-/low细胞的比例.结果:MCF-7、MDA-MB-435s中SP细胞比例分别为3.61%和2.72%,MDA-MB-231中未检测到SP细胞.3种细胞系中CD44 CD24-/low细胞比例分别为0.87%、0.59%和94.04%.MCF-7经Percoll分选,D亚群SP细胞富集,比例高达25.23%.MCF-7中CD44 CD24-/low细胞比例随着无血清培养时间的增加而增加,3周时达29.35%.结论:SP检测与CD44 CD24-/low细胞检测是目前乳腺癌干细胞检测的两种常用方法,但两者在同一乳腺癌细胞系中的检测结果并不一致,两种方法均有一定的局限性.另外,Percoll分选或无血清培养均能使MCF-7中肿瘤干细胞相关亚群(SP细胞或CD44 CD24-/low细胞)富集.     

人乳腺癌细胞系MCF-7中不同亚群细胞的体内外克隆和成瘤能力分析

目的了解在人乳腺癌细胞系MCF-7中是否存在乳腺癌干细胞。方法采用流式细胞技术对MCF-7细胞进行分选,检测MCF-7中不同亚群细胞的体外克隆形成能力和体内成瘤能力。结果MCF-7中有部分细胞具有体外克隆形成能力和体内成瘤能力,而且和CD44 CD24 细胞相比,CD44 CD24-细胞中成瘤细胞的含量更高。结论MCF-7中存在乳腺癌干细胞,并主要集中于CD44 CD24-细胞中,CD44 CD24 细胞也可能是乳腺癌祖细胞。     

rAAV/CEA转染树突状细胞诱导特异性CTL杀伤MCF-7细胞系CD44+ CD24-/low乳腺癌干细胞

目的:携带癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)基因的重组人腺相关病毒(reconstructive human ade-no-association virus,rh-AAV)感染树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导获得抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cyto-toxic lymphocyte,CTL),体外检测其对CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的杀伤效果。方法:分离供者外周血单个核细胞,以细胞因子白介素-4(interleukin-4,IL-4)、粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimu-lating factor,GM-CSF)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)诱导培养获得DC,细胞因子白介素-2(interleukin-2,IL-2),刺激培养获得T淋巴细胞。含CEA基因的rh-AAV感染培养DC,诱导成熟后将DC和T细胞混合培养获得CTL细胞。流式分选MCF-7和MA-MDB-231细胞系中CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞,MTT法检测CTL细胞对CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的杀伤效果。结果:MCF-7和MDA-MB-231中CD44+/CD24-/low亚群比例分别为5.1%和76.3%。CEA基因转染DC诱导的CTL细胞对表达CEA抗原的MCF-7杀伤率为46.5%±15.0%,与未转染组相比,差异有统计学意义(P=0.009);对MCF-7细胞中分选的CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的杀伤率为44.7%±28.2%,明显高于未转染组。对非乳腺癌干细胞杀伤率为50.6%±22.2%,与未转染组相比,差异有统计学意义(P=0.05)。在不表达CEA基因的MDA-MB-231乳腺癌细胞,CEA转染诱导的CTL细胞对未分选细胞、分选的CD44+/CD24-/low亚群和非干细胞亚群的杀伤率与未转染的对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:携带CEA基因rh-AAV转染DC诱导产生的抗原特异性CTL细胞可杀伤表达CEA的乳腺癌细胞,对CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞也具有一定的杀伤活性,提示免疫治疗可能是治疗乳腺癌干细胞潜在有效的手段。     

人乳腺癌干细胞中CCR5的表达及意义

目的:探讨人乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中CCR5的表达及意义。方法:采用流式分选技术从人乳腺癌细胞系MCF-7中分选出乳腺癌干细胞,并利用SYBR实时PCR技术测定不同亚群乳腺癌细胞中CCR5的表达。结果:熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证实PCR反应的特异性;相对定量结果显示,乳腺癌干细胞CD44+CD24-/low的CCR5表达水平为对照组CD44+CD24+乳腺癌细胞的6.14倍(P<0.05)。结论:高表达CCR5的乳腺癌干细胞与乳腺癌细胞相比具有更强的侵袭转移能力,可能是乳腺癌转移关键因素之一。     

乳腺癌miRNAs表达谱检测及初步分析

目的 制作哺乳动物micro RNAs(miRNAs)检测微阵列,筛选乳腺癌miRNAs表达谱并进行初步分析.方法 利用已知的人及小鼠的miRNAs序列,设计了496条探针,制作miRNAs微阵列并验证其可靠性;培养乳腺癌细胞株MCF-7和正常乳腺上皮细胞株MCF-10A,分别抽提细胞总RNA,分离小分子RNA,经T4RNA连接酶荧光标记后与微阵列杂交,通过芯片扫描和数据分析,获得乳腺癌miRNAs表达谱.结果 成功制作哺乳动物miRNAs微阵列,筛选获得57个乳腺癌相关miRNAs,其中,29个为低表达,28个为高表达.结论 建立了哺乳动物miRNAs检测微阵列的技术平台,并筛选到乳腺癌miRNAs表达谱,为进一步研究其在乳腺癌发病机制中的作用打下基础.     

乳腺癌干细胞的培养及鉴定

目的从乳腺癌患者的肿瘤组织中获得乳腺癌干细胞,并确定其生物学特性。方法收集乳腺癌患者的肿瘤组织,利用乳腺球悬浮培养法获得乳腺球细胞。用流式细胞仪检测细胞CD44以及CD24的表达,用Western印迹法检测细胞ALDH1,ESA以及Oct4的表达。将2×104、2×105和2×106三种细胞数的原代乳腺球囊细胞及贴壁细胞分别接种到NOD/SCID鼠的脂肪垫,观察其成瘤能力和肝肺转移情况。结果利用乳腺球悬浮培养的原代乳腺癌细胞中有62.36%呈CD44+/CD24-/low表型,且肿瘤干细胞标记物ALDH1,ESA以及Oct4的表达高于贴壁培养的原代乳腺癌细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。与贴壁细胞相比,悬浮培养富集的原代球囊细胞均有更强的成瘤和肝肺转移能力。结论利用乳腺球悬浮培养法可以从人乳腺癌组织中获得乳腺癌干细胞。     

乳腺癌干细胞微球体形成的影响因素

目的:探讨MCF-7、MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞微球体形成的影响因素,并检测其中CD44+/CD24-/low的表达.方法:将MCF-7、MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞进行微球体培养.取培养第7天的微球体细胞,用流式细胞术分析干细胞比例.结果:MCF-7形成微球体的效率最高(2.1%±0.3%),MDA-MB-231很少能形成微球体,原代乳腺痈细胞中未观察到微球体形成.但在无B27的干细胞培养环境中,MCF-7易贴壁生长.MCF-7单层培养细胞中CD44+/CD24-/low的比例为2.0%±0.1%,将悬浮及贴壁来源的McF-7细胞进行微球体培养,微球体细胞中CD44+/CD24-/low的比例分别为11.8%±0.3%和8.2%±0.8%(P<0.01).MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞中CD44+/CD24-/low的表达比例分别为92.2%±3.1%和93.8%±2.4%.结论:MCF-7细胞通过微球体培养富集了肿瘤干细胞,而MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞则不能.MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞中CD44+/CD24-/low的表达与微球体形成不呈正相关.     

乳腺癌干细胞中活性氧簇水平的研究

目的 探讨乳腺癌MCF-7细胞中CD44+CD24-/low表型乳腺癌干细胞活性氧簇水平.方法 用悬浮培养的方法富集乳腺癌干细胞.用流式细胞仪检测CD44+CD24-/low表型乳腺癌干细胞含量,体内成瘤实验验证其干细胞特性,克隆形成实验检测其辐射敏感性,2′-7′-二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)法检测其活性氧簇...     

细胞免疫荧光检测人胰腺癌干细胞Oct4､Nanog基因的表达

目的:研究胚胎干细胞相关基因Oct4和Nanog在人胰腺癌肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞中表达的差异?方法:用流式细胞仪在人胰腺癌Panc-1细胞系中分选肿瘤干细胞,细胞免疫荧光法检测2种肿瘤干细胞和Panc-1细胞中Oct4?Nanog基因的表达情况?结果:Oct4及Nanog基因在2种分选出的细胞中表达均高于未分选细胞?结论:干细胞相关基因Oct4?Nanog在胰腺癌Panc-1肿瘤干细胞中的表达高于普通胰腺癌细胞?     

多西紫杉醇对乳腺癌干细胞的作用研究

目的 通过研究多西紫杉醇对乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231及原代乳腺癌干细胞在体外的影响,观察多西紫杉醇对乳腺癌干细胞的作用,从而为选择针对乳腺癌干细胞治疗的药物提供理论依据.方法 利用流式细胞仪,分别从原代乳腺癌细胞、乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中,分选出细胞表型为CD+44、CD-/low24、ESA+的乳腺癌干细胞.将分选出来的3种乳腺癌干细胞及未分类细胞分别置于含有不同浓度多西紫杉醇的培养液中,测得多西紫杉醇对不同干细胞的生长抑制曲线,并利用流式细胞仪进行细胞周期及细胞凋亡的分析.结果 原代乳腺癌、MCF-7、MDA-MB-231细胞系干细胞比例分别为(0.50±0.26)%、(1.40±0.26)%和(1.63±0.32)%.四甲基偶氮唑盐(MTT)试验显示各系乳腺癌干细胞均对多西紫杉醇有一定的耐药性:其中MDA-MB-231未分类细胞、干细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为34 nmol/L和12.422 μmol/L(P＜0.01);MCF-7 两类细胞的IC50分别为31 nmol/L和8.357 μmol/L(P＜0.01);原代乳腺癌两类细胞的IC50分别为51 nmol/L 和17.688 μmol/L(P＜0.01).且多西紫杉醇对乳腺癌干细胞的抑制作用呈浓度依赖性.多西紫杉醇对乳腺癌干细胞表现出了一定的G2/M期周期阻滞作用,且干细胞早期凋亡率随药物作用时间的增加而升高,呈时间依赖性.结论 多西紫杉醇对乳腺癌干细胞增殖生长有一定的抑制作用,降低了乳腺癌干细胞的成瘤性,且该作用呈浓度依赖性和时间依赖性.     

人乳腺癌原代细胞和细胞系中肿瘤干细胞的比较

目的比较人乳腺癌原代细胞以及人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231S中乳腺癌干细胞的含量和细胞表型。方法采用流式细胞技术对人乳腺癌原代细胞以及MCF-7、MDA-MB-231S进行检测和分选,并测定不同细胞亚群在裸鼠体内重建肿瘤的能力。结果人乳腺癌原代细胞以及MCF-7、MDA-MB-231S细胞的CD44和CD24表达与分布不同;和人乳腺癌原代细胞相比,MCF-7、MDA-MB-231S细胞中乳腺癌干细胞的含量更高(P<0.01)。结论和人乳腺癌原代细胞相比,人乳腺癌细胞系中含有更高比例的乳腺癌干细胞,并且细胞表型也发生了改变。     

人胰腺癌干细胞对吉西他滨的敏感性及其分子机制研究

目的 检测人胰腺癌干细胞对吉西他滨的敏感性,分析其差异性基因的表达,初步阐明其耐药分子机制.方法 运用流式技术从人原代胰腺癌和细胞系SW1990中分选CD24+CD44+ESA+细胞,行NOD/SCID鼠移植瘤实验验证其肿瘤干细胞特性;运用吉西他滨进行体内、外干预,检测胰腺癌干细胞凋亡和表达率变化情况.采用人类全基因组表达谱Affymetrix U133 plus2.0芯片对胰腺癌干细胞和非干细胞进行差异基因筛选.结果 人原代胰腺癌和细胞系SW1990中分选到CD24+CD44+ESA+(0.8%)和CD24+CD44+(3.6%)细胞,移植瘤实验证实其为胰腺癌干细胞.肿瘤干细胞凋亡率及表达率检测提示胰腺癌干细胞对吉西他滨显著耐药.与胰腺癌非干细胞比对,基因表达谱芯片筛查到胰腺癌干细胞820条差异基因,其中上调表达281个,下调表达539个.结论 胰腺癌干细胞对吉西他滨耐药,具有特征性基因表达谱,为阐明胰腺癌多药耐药机制及靶向治疗奠定基础.     

E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒对乳腺癌干细胞的作用

目的研究E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒(E1B--OLV)对乳腺癌干细胞的作用。方法E1B--OLV感染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞(实验组),常规培养MCF-7细胞作为对照组。两组细胞分别行流式细胞仪(FCM)分析CD44 CD24-细胞的表型比例。两组细胞同时行微球体培养,观察微球体形成的大小及数量,计算微球体形成率(MFE),用FCM分析微球体CD44 CD24-细胞的比例。结果实验组MCF-7细胞的CD24-、CD44 和CD44 CD24-比例分别为43.90%、63.26%和22.19%,对照组为6.74%、88.30%和2.30%。实验组中微球体成球时间早于对照组,球体体积大于对照组,MFE高于对照组(1.26%和0.9%);实验组和对照组微球体中CD44 CD24-细胞的比例分别为38.08%和23.35%。结论ElB--OLV在短期内杀死MCF-7细胞,但主要是乳腺癌分化细胞,可能促进了乳腺癌干细胞的生长,加快了其自我更新和分化速率。     

单克隆抗体C225对乳腺癌干细胞的抑制作用

目的 研究表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体西妥昔单抗(C225)对乳腺癌细胞系MCF-7中乳腺癌干细胞的抑制作用。方法 MTT法检测C225对MCF-7细胞增殖的影响。将MCF-7进行微球体培养,根据培养液中是否加入表皮生长因子(EGF)和C225分为对照组、C225组、EGF组、EGF+ C225组;培养13 d,观察四组微球体形成大小及数量,计算微球体形成率(MFE);流式细胞术检测微球体细胞及常规培养MCF-7中CD44+CD24－细胞比例。结果 MCF-7细胞增殖抑制率随C225质量浓度的增加而上升。与对照组比较,C225组微球体体积明显减小,且MFE和微球体中CD44+CD24－细胞比例明显降低,分别为(0.61±0.04)% vs (1.44±0.09)% (P<0.01)和(3.50±0.29)% vs (9.07±0.52)% (P<0.01)。与EGF组比较,EGF+C225组微球体体积明显减小,且MFE和微球体中CD44+CD24－细胞比例明显降低,分别为(0.68±0.04)% vs (1.61±0.05)% (P<0.01)和(4.00±0.58)% vs (10.47±0.79)% (P<0.01)。常规培养MCF-7中CD44+CD24－细胞比例为（2.03±0.15）%,与EGF组和对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。EGF组与对照组微球体形成大小、MFE以及微球体中CD44+CD24－细胞比例的比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 C225对MCF-7中CD44+CD24－细胞有明显抑制作用。     

单克隆抗体C225对乳腺癌干细胞的抑制作用

目的 研究表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体西妥昔单抗(C225)对乳腺癌细胞系MCF-7中乳腺癌干细胞的抑制作用.方法 MTT法检测C225对MCF-7细胞增殖的影响.将MCF-7进行微球体培养,根据培养液中是否加入表皮生长因子(EGF)和C225分为对照组、C225组、EGF组、EGF+ C225组;培养13 d,观察四组微球体形成大小及数量,计算微球体形成率(MFE);流式细胞术检测微球体细胞及常规培养MCF-7中CD44+CD24-细胞比例.结果 MCF-7细胞增殖抑制率随C225质量浓度的增加而上升.与对照组比较,C225组微球体体积明显减小,且MFE和微球体中CD44+CD24-细胞比例明显降低,分别为(0.61±0.04)% vs (1.44±0.09)% (P<0.01)和(3.50±0.29)% vs (9.07±0.52)% (P<0.01).与EGF组比较,EGF+C225组微球体体积明显减小,且MFE和微球体中CD44+CD24-细胞比例明显降低,分别为(0.68±0.04)% vs (1.61±0.05)% (P<0.01)和(4.00±0.58)% vs (10.47±0.79)% (P<0.01).常规培养MCF-7中CD44+CD24-细胞比例为(2.03±0.15)%,与EGF组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).EGF组与对照组微球体形成大小、MFE以及微球体中CD44+CD24-细胞比例的比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 C225对MCF-7中CD44+CD24-细胞有明显抑制作用.