骨髓间充质干细胞表达的hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白的提纯及功能鉴定

目的:用hVEGF_(121)/EGFP真核质粒转染骨髓间充质干细胞,提纯其表达的hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白,并体外检测其功能.方法:用课题组前期工作构建的pEGFP-N_2-hVEGF_(121)重组质粒提取质粒DNA.通过阳离子脂质体介导pEGFP-N_2-hVEGF_(121)重组质粒DNA转染体外培养的骨髓间充质干细胞,使用荧光显微镜检测hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白表达.用Amicon超滤离心管纯化融合蛋白.结果:荧光显微镜下观察到转染pEGFP-N_2-hVEGF_(121)重组质粒的骨髓间充质干细胞,Westen blot证实转染骨髓间充质干细胞的培养液中存在hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白表达.MTT试验证实人脐静脉内皮细胞数量在hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白组明显多于对照组(P<0.05).Miles实验证实hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白增加血管壁的通透性.结论:①携带hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒,在骨髓间充质干细胞中获得表达.②骨髓间充质干细胞表达的hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白在体外具有野生型血管内皮细胞生长因子的功能.     

表达hVEGF121/EGFP融合蛋白骨髓间充质干细胞的制备及缺氧干预

目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的人血管内皮细胞生长因子121的真核质粒,检测所制备的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞在不同时长缺氧后血管内皮细胞生长因子的水平.方法:设计携带酶切位点的扩增引物,通过PCR技术扩增人血管内皮细胞生长因子121编码基因全序列,以粘端连接克隆法将其编码片段定向连接入质粒载体pEGFP-N2的多克隆位点中,构建pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒,采用酶切法、PCR以及DNA序列测定法鉴定所构建的重组质粒.全骨髓差速贴擘法分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增传代.通过形态学观察及表面标记物进行细胞鉴定.通过阳离子脂质体介导pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染体外培养的骨髓间充质干细胞,使用荧光显微镜检测hVEGF121/EGFP融合蛋白的表达.将制备好的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞存体外缺氧环境下分别培养6,12,24h,另设相同缺氧干预下的空白骨髓间充质干细胞组,以转染空载pEGFP-N2质粒的骨髓间充质干细胞组作为对照,采用RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达量.结果:酶切鉴定法、PCR鉴定法、DNA序列测定皆证实pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒构建成功.使用pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染骨髓间充质干细胞后,荧光显微镜检测提示hVEGF121/EGFP蛋白在骨髓间充质干细胞中存在表达.在体外模拟心肌缺氧的环境下分别培养6,12,24h后,RT-PCR检测示转染重组质粒的骨髓间充质干细胞组各时间段缺氧后的血管内皮牛长因子mRNA表达量均高于对照组(P<0.01),且不同时间段间差异无显著性意义(P0.05);空白骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子mRNA表达量随缺氧时程的延长而增加.结论:[1]成功构建携带人VEGF121/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒,并在骨髓间充质干细胞中获得表达.[2]证实表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能在24h以内的不同时长缺氧下,维持较空白骨髓间充质干细胞更强、更稳定的血管内皮生长因子表达.     

hVEGF165在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的培养和鉴定兔骨髓间充质于细胞，基因转染后观察hVEGF165在其中的表达。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞，以流式细胞仪检测其表面抗原（CD29、CD44、CD45、HLA—DR）的表达。通过腺病毒载体转染hVEGF165后，采用RT—PCR、Western blot法检测hVEGF165在细胞中的表达。结果通过流式细胞仪检测表明培养的细胞为兔骨髓间充质干细胞，RT—PCR法、Western blot法检测结果均表明hVEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞后能在其中表达。结论成功培养兔体外骨髓间充质干细胞，基因转染后细胞能有效表达hVEGF165。     

hVEGF165基因转染后骨髓间充质干细胞蛋白分泌功能及成骨活性的检测

目的：血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用。观察hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能及转染后细胞的成骨活性。 方法：实验于2004—07／2005—12在江苏省血液研究所国家重点实验室完成。①体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，传代培养后以1μg PcDNA3．1-hVEGF165：3μL阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染，通过免疫组织化学SP方法检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。②体外分离、培养大鼠肾微血管内皮细胞，分别加入hVEGF165基因转染48h及1周后细胞上清、空载体转染及未转染组细胞上清，MTT法观察细胞增殖情况，以了解转染后细胞培养上清中VEGF的生物学活性。③测定在正常条件培养和成骨条件培养下，转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。 结果：①hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF蛋白。②hVEGF165基因转染48h组大鼠肾微血管内皮细胞A值高于空载体转染及未转染组（P〈0．05），但低于hVEGF165基因转染1周组。③成骨条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）；而在正常条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。 结论：①采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF，且这种生物学活性呈剂量依赖性。②在成骨条件培养下，转染hVEGF165基因后骨髓间充质干细胞的成骨能力增强。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞分离提纯及鉴定

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、传代培养方法,并对培养细胞进行鉴定。方法贴壁培养法分离SD大鼠骨髓细胞,传代扩增,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞术鉴定细胞。结果原代细胞较多细胞集落,细胞规则,呈梭形、椭圆形,传代细胞多成纤维形状,第3代培养细胞表面分子CD44,CD90,CD105呈阳性表达,但不表达CD34。结论贴壁培养法培养的大鼠骨髓原代细胞可稳定表达干细胞表面的标记分子。     

骨髓间充质干细胞体外分化过程中端粒酶活性表达及意义

目的：探讨体外诱导兔骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞覆其扩增过程中端粒酶活性的表达及其意义。方法：联合应用密度梯度离心和贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞，继而诱导其向内皮细胞方向分化并传代培养。用TRAPezeELISA法和TRAP银染法分别检测骨髓问充质干细胞体外诱导分化前后端粒酶活性。结果：兔骨髓问充质干细胞体外培养时具有快速增殖能力，在特定环境中诱导分化细胞具有内皮细胞特征；增殖前的骨髓阃充质干细胞端粒酶活性低水平表达，一旦经过诱导分化其端粒酶活性表达上调，在5代内其端粒酶活性不因细胞传代而下降或消失。结论：骨髓间充质干细胞在体外有限扩增和诱导分化时保持端粒酶活性，维持组织干细胞特性，为内皮祖细胞的临床研究奠定理论基础。     

不同缺氧状态下骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的差异

背景:骨髓间充质干细胞在植入心肌缺血,梗死区域后,面临缺氧缺血微环境,其如何通过旁分泌细胞因子来发挥重建侧支微循环、修复心肌的作用,是目前存在争论的焦点之一.目的:探讨骨髓间充质干细胞在不同时程缺氧环境下血管内皮生长因子的表达规律.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/1 1在南昌大学第二附属医院分子医学实验中心完成.材料:清洁级新西兰大白兔2只,由南昌大学医学院实验动物中心提供.方法:常规差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞.细胞缺氧微环境在AnaeroPack密闭方盒中产生,盒中置入一次性缺氧催化袋GENbox anaer(可吸收O2,产生CO2),指示条监测氧的耗竭,根据缺氧培养时程分为缺氧0,6,12,24 h组.主要观察指标:RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达,Western Blot法检测血管内皮生长因子蛋白的表达.结果:血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达水平均为缺氧0 h组<6 h组<12 h组<24 h组(P<0.01).结论:缺氧24 h以内的培养环境下,骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的水平呈缺氧时程依赖性增加.     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景:骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的:观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法:体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1:3比例的混合液转染,并分为3组:转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论:转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P<0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P>0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P<0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的：观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1：3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义（P〈0.05）,但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义（P〉0.05）,转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义（P〈0.05）,hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

目的探索体外培养和鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcell,MSC）的方法,为人骨髓间充质干细胞移植于受损心脏、改善心脏功能的研究打下基础。方法采用Percoll（1．073g／ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞,用含10％的胎牛血清低糖DMEM培养液体外培养扩增骨髓MSC,并通过FCM对其纯度进行鉴定。结果Percoll液能成功分离出骨髓间充质干细胞。原代及传代培养显示人骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。体外扩增的人骨髓间充质干细胞表达CD29、CD166等表面抗原,不表达CD34、CD45等表面抗原。结论人骨髓间充质干细胞作为一种具有多分化潜能的多能干细胞,具有强大的分裂增殖能力,体外培养无明显的分化倾向．     

血管内皮生长因子对人骨髓和脐带间充质干细胞中内皮细胞组分的影响

本研究旨在比较人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)和脐带间充质干细胞(UC-MSC)中的内皮细胞(EC)比例,并探讨血管内皮生长因子(VEGF)对MSC中EC比例的影响。利用流式细胞术检测EC标志CD34+CD133+和vWF+CD31+双阳性细胞的比例,用瑞氏染色观察经VEGF作用的MSC细胞形态变化,免疫荧光技术观察CD34、CD133、CD31、VWF的表达,最后采用实时荧光定量PCR检测VEGF对EC标志性基因表达的影响。结果表明:BM-MSC和UC-MSC中存在少量EC及内皮祖细胞(EPC),经VEGF 10 ng/ml作用24 h后,MSC的长宽比变大,EC比例上升而EPC比例下降,EC相关标志基因Tie-2和ecNOS等的表达均上调,其中UC-MSC对VEGF的反应更明显。结论:BM-MSC和UC-MSC中存在少量的EC及EPC,VEGF可以提高EC的比例和细胞功能。     

转基因骨髓间充质干细胞移植与组织工程皮肤的血管化

背景:组织工程化皮肤移植后常因缺乏足够的血管化而导致低灌注和缺血损伤.利用转基因技术,可将血管生成调控因子摹因导入目的细胞,使其表达某些调控因子,进而利于血管生成.目的:观察转基因骨髓间充质干细胞移植促进组织工程皮肤血管化基因治疗的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-03/11在江西省南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:人骨髓间充质干细胞由试验者取自临床骨髓穿刺检查骨髓正常的患者.pShuttle-CMV/VEGF165质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠.16只新西兰大白兔用于皮肤缺损模型的制作,分为基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组进行移植.方法:采用密度梯度离心结合贴壁法分离培养入骨髓间充质干细胞,以pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞.于兔背部两侧制备2 cm×2 cm的正方形全层皮肤缺损3个,并分别以人血管内皮细胞生长因子165转染骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、不含细胞的真皮支架材料植入全层皮肤缺损创面.主要观察指标:观察局部组织微血管密度变化及移植物成活率.结果:术后7 d,3组创口周围皮肤均无明显红肿及炎症反应,移植物与创面接触紧密,基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组可见部分真皮泛红,真皮支架材料组不明显,术后3周创面基本愈合,基因转染骨髓间充质干细胞组创面的毛细血管密度较骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组明显增高(P<0.01),14 d时3组中基因转染骨髓间充质干细胞组血管密度仍最高,但3组数据无统计学差异.术后二三周基因转染骨髓间充质干细胞组移植物成活率最高(P<0.01).结论:血管内皮细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植可改善和促进局部血管再生,促使新的毛细血管从创面长入移植的组织工程皮肤,从而促进组织工程皮肤的早期血管化及创面愈合.     

丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白及骨髓间充质干细胞复合新型组织工程骨脊柱融合的生物力学实验

背景：植入材料的载体作用、细胞因子的缓释作用以及植入后利于血管、软骨、骨的长入,适当的孔隙度及材料内部的三维结构都是影响支架材料选择的因素。目的：拟运用丝素蛋白、牛骨形态发生蛋白及骨髓间充质干细胞来构建新型组织工程骨,通过脊柱融合实验对其进行生物力学分析。材料：清洁级4周龄雄性新西兰大耳白兔70只,丝素蛋白由苏州大学材料工程学院提供,牛骨形态发生蛋白由中国医学科学院提供。方法：取10只兔体外扩增骨髓间充质干细胞,接种复合于丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白复合物上,构建组织工程骨。剩余60只兔随机分成5组：丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白/骨髓间充质干细胞组、丝素蛋白/骨髓间充质干细胞组、丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白组、单纯丝素蛋白组、空白对照组,12只/组。各组均咬除L5棘突建立植骨床,前4组植入对应移植物进行椎板间融合,空白对照组仅去皮质骨,不给予任何外植物。主要观察指标：X射线、三维CT及手触法检测脊柱融合情况;苏木精-伊红染色观察移植物骨组织生成情况;在轴向压缩、前屈、后伸、侧屈4种不同生理运动情况下生物力学性能测试结果。结果：①植入12周时,丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白/骨髓间充质干细胞组100%融合,丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白组、丝素蛋白/骨髓间充质干细胞组、单纯丝素蛋白组融合率分别为83.3%,25.0%,16.7%,空白对照组为0。②丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白/骨髓间充质干细胞组丝素蛋白完全降解,新生骨组织已进入塑形期,向板层骨发展;丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白丝素蛋白完全降解,新生骨组织以编织骨为主;丝素蛋白/骨髓间充质干细胞组骨岛数目较前增多,未见连续性新生骨;单纯丝素蛋白组新生骨增加不明显;空白对照组始终未见新生骨生成。③丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白/骨髓间充质干细胞组、丝素蛋白/牛骨形态发生蛋白组体内植入的融合脊柱具有明显的稳定性,刚度、强度较好,与其余3组比较差异有显著性意义。结论：丝素蛋白是一种良好的细胞外基质材料,通过丝素蛋白体外构建的组织工程化骨植入体内进行脊柱融合是可能的。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化

背景:目前骨髓间充质干细胞已经应用于多种组织血管的修复,但涉及尿道血管组织的报道甚少.目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在苏州大学附属儿童医院儿科研究所完成.材料:清洁级4周龄SD大鼠4只,由苏州大学实验动物中心提供.作为诱导剂的血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子为Sigma公司产品.方法:密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞达80%～90%融合时消化传代.传至第3代,细胞按1×109L-1密度接种,加入含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子的DMEM培养基向血管内皮细胞诱导分化.主要观察指标:MTT测定细胞生长曲线,免疫荧光法检测细胞表面CD44与Vimentin的表达,光学倒置显微镜下观察诱导后细胞形态变化,电镜观察细胞超微结构.结果:骨髓间充质干细胞生长曲线呈倒"S"型,第3代细胞表面CD44和Vimentin表达阳性率分别为89.3%和85.6%.向血管内皮细胞诱导1～3 d细胞争梭形或纺锤形,7 d后变成不规则的圆形或椭圆形,胞浆淡染,胞核较大,核染色质粗,且部分细胞死亡,14 d后整瓶细胞呈漩涡状生长,21～25 d后细胞密集处呈内皮细胞特有的铺路石样排列.诱导后第21天,细胞浆内可见微管、微丝及W-P小体.结论:血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞因子联合诱导条件下,骨髓间充质干细胞在体外可分化为血管内皮细胞.     

骨髓间充质干细胞的研究

骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓中的非造血细胞,构成造血微环境,支持造血,具有向成骨细胞、软骨细胞、成肌/心肌细胞、脂肪细胞、神经元等分化的潜能,表达多种表面标记物,但不具特异性.骨髓、外周血的MSCs是一循环的整体,具有其自身代谢、更新的循环,终末分化可能跨越胚层界限.MSCs应用前景广阔.     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;诱导7d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义（P〈0.05）,第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。     

Notch信号和血管内皮生长因子基因对大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化后内皮细胞功能的影响

目的 探讨Notch信号和血管内皮生长因子(VEGF165)基因对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化后内皮细胞功能的影响.方法 分离、培养大鼠MSCs,用含VEGF165和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的细胞培养液培养大鼠MSCs 2周诱导其向内皮细胞分化;用脂质体将携带有VEGF165基因的质粒转染诱导内皮细胞并对转染效果进行鉴定,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后细胞上Notch信号受体Notch 1和配体Jagged 1的表达变化;用γ-内分泌酶抑制剂L-685458阻断细胞Notch信号通路的转导,划痕实验检测细胞迁移能力;将细胞接种在半固体培养基上,观察其形成毛细血管样结构的能力.结果 转染VEGF165基因的内皮细胞上表达有VEGF165 mRNA,说明实验成功地将VEGF165基因导入诱导后内皮细胞中.转染VEGF165基因后,细胞上Notch信号配体Jagged1 mRNA表达增强(1.08±0.01比1.01±0.02,P＜0.01),Notch1 mRNA表达无明显变化(0.60±0.02比0.59±0.01,P＞0.05);细胞的迁移能力增强(划痕空白处细胞个数:46.45±4.46比41.61±1.42,P＜0.05),形成毛细血管样结构能力无明显变化(细胞分级:3.00±0.89比2.00±0.89,P＞0.05).内皮细胞转染VEGF165基因后,以γ-内分泌酶抑制剂L-685458阻断细胞Notch信号通路的转导,则细胞迁移能力(划痕空白处细胞个数:51.72±3.47比46.45±4.46)和形成毛细血管样结构能力(细胞分级:4.17±0.75比3.00±0.89)均进一步增强(均P＜0.05).结论 转染VEGF165基因可增强大鼠MSCs诱导分化内皮细胞的功能,在此基础上阻断Notch信号通路转导可进一步增强细胞功能.     

壳聚糖介导真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景:发展一种安全有效的方法来促进骨缺损是修复重建外科面临的重要问题,自体骨移植仍是目前优先考虑的选择,但供区有限且不可避免地对供区造成新的损害;同种异体骨移植存在免疫排斥反应;非骨性材料移植物在临床实践中的并发症仍居高小下.目的:探讨壳聚糖介导真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNNhBMP-4转染兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞基因工程学体外实验,于2007-09/2008 04在安徽医科大学与中国医科大学完成.材料:清洁级新西兰大白兔8只,南安徽医科大学实验动物中心提供.壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNNhBMP-4为课题组自行构建.方法:无菌条件下抽取兔骨髓,Percoll法体外分离培养骨髓间充质干细胞,通过换液和贴壁吹打法进行纯化扩增.第3代骨髓间充质干细胞80%融合后,按1×108L1密度接种,实验组采用壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4进行转染,对照组不转染质粒,继续以含10%FBS的L-DMEM普通培养基进行培养21 d.主要观察指标:碱性磷酸酶及茜素红染色检测细胞分化情况,扫描电镜观察细胞结构变化.结果:转染14 d后实验组碱性磷酸酶染色呈强阳性表达,茜素红染色出现大量棕红色的钙结节,电镜观察细胞内含有大量碱性磷酸酶的小泡,细胞周围大量基质分泌;对照组碱性磷酸酶与茜素红染色均呈阴性,电镜干细胞内几乎没有含碱性磷酸酶的小泡.结论:兔骨髓间充质干细胞在体外经壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染后,可定向分化为成骨细胞.     

骨髓间充质干细胞防治心肌细胞凋亡的基因及蛋白研究

背景:骨髓间充质干细胞移植后可作用于心肌细胞,防止心肌细胞损伤的发生或继发性的病变.目的:分析骨髓间充质干细胞对心肌细胞凋亡的基因蛋白表达影响.方法:由第一作者检索1997/2010 PubMed数据及万方数据库有关骨髓间充质干细胞、心肌细胞凋亡以及基因蛋白表达等方面的文献.结果与结论:骨髓间充质干细胞以其获取方便、分化能力强、低免疫原性、无排斥反应等特点成为研究的重点.骨髓间充质干细胞能够作用于心肌细胞,防止心肌细胞损伤的发生或继发性的病变,主要是通过调控Bcl-2、Bax、Fas、FasL、Caspase等基因蛋白的表达,抑制心肌细胞凋亡的发生,对于运动过程中出现的因心肌细胞凋亡而影响其成绩下降的现象具有一定的保护作用和应用价值.     

骨髓间充质干细胞防治心肌细胞凋亡的基因及蛋白研究

背景：骨髓间充质干细胞移植后可作用于心肌细胞,防止心肌细胞损伤的发生或继发性的病变。目的：分析骨髓间充质干细胞对心肌细胞凋亡的基因蛋白表达影响。方法：由第一作者检索1997/2010PubMed数据及万方数据库有关骨髓间充质干细胞、心肌细胞凋亡以及基因蛋白表达等方面的文献。结果与结论：骨髓间充质干细胞以其获取方便、分化能力强、低免疫原性、无排斥反应等特点成为研究的重点。骨髓间充质干细胞能够作用于心肌细胞,防止心肌细胞损伤的发生或继发性的病变,主要是通过调控Bcl-2、Bax、Fas、FasL、Caspase等基因蛋白的表达,抑制心肌细胞凋亡的发生,对于运动过程中出现的因心肌细胞凋亡而影响其成绩下降的现象具有一定的保护作用和应用价值。