HLA新等位基因A~*9217家系调查分析

背景:目前所发现的HLA等位基因是在人类进化过程中,为了适应某种外界环境过程中逐渐产生的,新近产生而不曾被人们发现的为新等位基因,这些新的等位基因产生诱因千变万化,在诱发因素消除之后这些突变是否持续存在,尚需进一步观察.目的:采用DNA测序技术确认聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸分型检测中的可疑结果,确认新的HLA等位基因,分析新等位基因HLA-A~*9217(WHO注册号:WHS10004629)的遗传方式.设计、时间及地点:以DNA为观察对象的开放性试验.其中常规初检聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法于2007-11在河南省红十字血液中心中华骨髓库河南分库人类白细胞抗原组织配型实验室完成,测序实验于2008-02在戴诺生物技术(北京)有限公司人类白细胞抗原实验室完成.材料:中华骨髓库志愿捐献者(编号:371xxxxx)及其直系3代亲属血样,受试者共9人在实验室逐个登记,采集静脉血5 mL,EDTA抗凝.方法:用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸流式荧光微珠HLA分型方法、SBT测序分型方法,对A~*9217携带者家庭成员进行中低分辨,DNA测序高分辨检测分析,血清学方法检测ABO,MN,Rh血型系统,分析新基因的发现及遗传方式.主要观察指标:HLA新等位基因A~*9217携带者A位点外显子3序列对比.结果:通过受检者HLA分型结果和红细胞系统ABO,MN,Rh血型分析,先证者A~*9217应来自父方,但父方并没有检出A~*9217,而是检出了与之序列相近的A~*020301,与A~*9217在处显子3有3处碱基改变391 T>G,414 C>G,418 T >G,A~*9217携带者的2个孩子均检出A~*9217.结论:新基因A~*9217先证者父方产生突变所致,该突变能正常遗传给后代,该基因是否能稳定遗传下去有待进一步观察研究.     

3例携带HLA—DRB1^＊0114新基因的家系调查

目的调查3例携带HLA—DRB1＊0114新基因的家系遗传状况。方法HLA低分辨分型采用PCR—SS0流式分型技术,DNA测序采用等位基因特异性技术。结果新基因HLA—DRB1＊0114序列与DRB1＊010101相比,第2外显子区域有3个碱基发生突变,造成2个氨基酸发生改变。257位碱基A→C,导致86编码子的氨基酸由天冬氨酸（Asp）变成丙氨酸（Ala）。265位碱基T→C,89编码子的氨基酸由酪氨酸（Tyr）变成组氨酸（His）。3个携带HLA—DRB1＊0114新基因家系均为陕西籍,HLA—DRB1＊0114等位基因携带者都有单倍型A＊26-B＊37-DRB1＊0114,该单倍型均由父亲携带,且都遗传给子代的所有成员。结论A＊26-B＊37-DRB1＊0114是紧密连锁的单倍型,可以稳定遗传。     

HLA新等位基因HLA—A＊1127认定

目的发现和认定HLA新等位基因HLA—A＊1127。方法应用PCR—SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因,采用分子克隆和PCR产物直接测序方法得到核苷酸序列,通过软件分析基因序列及其与最同源HLA等位基因序列的差异。结果发现1个样品的HLA—A位点结果异常。其序列与已知所有HLA—A等位基因序列不一致,与同源性最高的等位基因A＊1104的差异是在第三外显子区域的570位碱基发生G→C的替换,并导致了相应的166密码子由GAG→GAC,编码的氨基酸由谷氨酸（Glu）变成天冬氨酸（Asp）;571位碱基发生T→G的替换,并导致相应的167密码子由TGG→GGG,编码的氨基酸由色氨酸（Trp）变成甘氨酸（Gly）。结论该等位基因为HLA新的等位基因,被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA—A＊1127。     

新等位基因HLA-DRB1＊1462的核苷酸序列分析

本研究验证一个新的HLA等位基因DRB1＊1462的核苷酸序列。应用MR-SSO和MR-SSP基因分型技术对HLA分型,对怀疑是HLA新等位基因进行DNA测序。结果发现,该序列与已知的所有HLA-DRB1等位基因序列不一致,与HLA—DRB1＊140101的序列差异仅表现在第2外显子区域中256位碱基发生了G-〉A的替换,导致相应的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸。结论：该基因是HLA-DRB1位点的一个新等位基因,已经被WHOHLA命名委员会于2006年1月30日正式命名为HLA-DRB1女1462。     

中国北方汉族人群A204等位基因的发现及家系调查

目的了解中国北方汉族人群ABO血型系统A2亚型的基因型分布特点及A204的家系遗传规律。方法应用血清学试验筛选出A亚型标本,采用PCR-SSP法对ABO血型A2亚型作基因分型检测,随后直接DNA测序;对A204先证者作家系调查。结果从3 395名献血者中筛选出23例A亚型:13例为A205、8例为A201、1例为A204、1例不能确定;A205、A201、A204基因测序结果均与genebank的参考序列相同,1例基因分型不能确定者,基因测序结果与genebank的参考序列比对,确定其基因型为A102;A204先证者的A204是由其母亲遗传而来。结论 A2等位基因在所调查的人群(中国北方汉族)中以A205为主,其次为A201,存在A204,且A204可以在家系内遗传。     

HLA新等位基因HLA-B~＊5145的确认

背景：作者在用美国onelamba试剂公司生产的HLA低分辨试剂进行分型实验时,将反应结果导入HLA数据分析软件,发现HLA-B位点反应格局异常,且阴性磁珠和阳性磁珠反应情况良好,但是分析软件并未给出相应结果,怀疑有新基因的可能。目的：发现和认定1个HLA新等位基因。方法：采集中华骨髓库造血干细胞捐献者血样,应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的新等位基因,PCR产物测序和DNA基因克隆测序,分析基因序列。结果与结论：PCR-SSO基因分型显示,供者HLA-A位点基因型为A＊02XX,A＊33XX;HLA-DRB1位点基因型为DRB1＊1202,DRB1＊1302,HLA-B位点反应格局异常,不能指定任何HLA-B位点的等位基因,提示B＊44XX,B＊53XX;90FN,91FP,调整不合理,故进一步用其他试剂（Dynal,PCR-SSO）分型方法进行分析,也显示无法判定的结果。等位基因HLA-B＊5145是HLA-B＊5106的变异体,该基因和B＊5106的差异在第3外显子的339位碱基A→G,引起相应编码氨基酸113位上的N（天冬酰胺,Asn）→D（天冬氨酸,Asp）,346位碱基A→C,引起相应编码氨基酸115位上的Y（酪氨酸,Tyr）→S（丝氨酸,Ser）,362位碱基A→G,则不引起相应编码氨基酸120位上的K（赖氨酸,Lys）的变化。该基因为新等位基因,2006-10被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名HLA-B＊5145。     

10个HLA新等位基因的测序确认

目的用DNA测序方法确认HLA新等位基因。方法对常规流式荧光微珠HLA分型方法无法给出确切结果的标本,采用序列特异性引物测序、单倍型测序、克隆测序等方法确认新的等位基因序列,将测得的序列与已知的最相近序列进行比对,可疑新等位基因序列提交GenBank进行注册,向WHOHLA因子命名委员会申报确认。结果2004年5月—2005年12月共进行常规检测12193人份,发现可疑标本21份,测序确认为新等位基因的有10份,申报确认为新的HLA等位基因,已经被正式命名。结论测序是确认HLA基因序列的金标准,但常规直接测序并不能解决全部问题,需要借助组序列特异性引物(GSSP)测序、单倍型测序、克隆测序等方法加以解决。     

RHD845A/1227A基因型个体家系调查分析

本研究对1例RHD845A/1227A基因型个体进行家系调查分析,并分析他们的遗传特性。通过盐水法和间接抗人球蛋白试验（IAT）检测RH（D）抗原,PCR—SSP法检测RHD1227A和RHD845A等位基因以及RHD合子型,基因测序方式分析RIHD基因编码区序列。研究结果表明：血清学检测发现1例RH（D）抗原盐水法检测阴性、IAT法检测阳性样本,经RHD基因编码序列分析发现,RHD第845位与第1227位均出现G／A碱基杂合现象,推测该个体基因型可能为RHD845A／1227A。家系调查显示,先证者父亲为RHD阴性,母亲为RHD阳性。PCR-SSP检测结果显示,父亲携带RHDl227A等位基因,基因型为RHD845A／RHD-;母亲携带RHD845A等位基因,基因型为RHD845A／RHD＋,证明先证者分别从父亲和母亲遗传RHD1227A和RHD845A等位基因,基因型为RHD845A／1227A。结论：经过家系调查分析发现了1例罕见的RHD845A／1227A基因型个体。根据家系调查证明,RHD845A和RHD1227A等位基因分别由遗传获得,而非由个体基因变异形成。     

中国汉族个体HLA全长序列新等位基因A＊74：02：01：02的鉴定

目的对中国汉族个体人类白细胞抗原（HLA）-A基因全长序列进行测定,发现和鉴定突变位于常规检测区域以外的全长序列新等位基因。方法应用已对常规检测区域第2～4外显子进行测序分型、结果已知的中国汉族个体的样本进行HLA—A基因全长4．3kb序列的高保真扩增、克隆及测序;利用序列比对、进化树等方法分析突变所在位置及其产生的原因。结果发现1个HLA—A全长序列新等位基因,序列与国际IMGT／HLA数据库中最接近的等位基因A＊74：02：01：01的全长序列相比共有5个位于内含子的变异,其中第3内含子1个：NT1427C〉T,第7内含子5个,分别为NT2842G〉A,NT2850C〉T,NT2862T〉C,NT2863G〉A以及NT2868T〉C。该HLA—A新等位基因于2010—07—31被世界卫生组织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为HLA—A＊74：02：01：02。结论新等位基因A＊74：02：01：02的变异产生的机制可能是随机突变和等位基因之间的交换重组。     

克隆测序确认HLA新等位基因B^＊3712

目的：由于技术原理的限制，目前尚不能对所有的HLA等位基因进行严格的区分，特别是以往没有发现的新基因序列只能通过测序的方法解决，然而，当遇到等位基因杂合时，测序给出的结果仍然无法确认新的序列改变发生在等位基因的哪一侧，这时需要用分子生物学方法分离杂合子然后进行测序才能确定新的基因序列。采用基因克隆方法确认HLA新等位基因。 方法：实验于2006-01／05在河南省红十字血液中心HLA实验室，美国海军骨髓库HLA实验室完成。造血干细胞血样由中华骨髓库提供。采用荧光微珠HLA分型方法对中华骨髓库捐献者血样进行HLA分型检测，无法给出确切结果的摸棱两可结果标本用基因克隆（TOPO TA Cloning）、DNA测序的方法确认新的HLA基因序列。 结果：通过克隆分离杂合等位基因，再进行测序确认发现新的序列与B^＊3709相比，出现4个核苷酸改变：1．355nt C〉A，2．363nt C〉G，3．412nt G〉A，4．477ntC〉G，而且均发生在H哺B基因外显子3（exon3）。4处改变引起氨基酸编码改变：①编码95CTC〉ATC，氨基酸改变L〉1（亮氨酸〉异亮氨酸）。②97AGC〉AGG．S〉R（丝氨酸〉精氨酸）。③114GAC〉AACD〉N（天门冬氨酸〉天冬酰胺）。（9135GCC〉GCGA=A无氨基酸改变。 结论：①新的基因序列已经在GenBnak注册，被WHO的HLA因子命名委员会得到正式命名为HLA-B^＊3712基因。②基因克隆是确认HLA新基因的根本方法。     

HLA新等位基因DRB103:80的鉴定及其序列分析

本研究旨在分析鉴定中国人群HLA—DR位点1个新等位基因。应用LuminexPCR—SSO流式分型技术发现1例罕见等位基因组合样本,应用PCR-测序分型（sequence—basedtyping,SBT）及单等位基因特异性测序分型技术进行鉴定分析。结果表明,该样本DR位点1个等位基因序列与同源性最高的DRB1＊03：06等位基因相比,其第2外显子第239位核苷酸碱基由C→G,结果导致相应51位密码子编码的苏氨酸变为精氨酸。结论：确定了该样本含有1个HLA-DRB1新等位基因。该等位基因被WHOHLA因子命名委员会正式命名为DRB1＊03：80．     

中国彝族人群p表型家系分析及新A4GALT等位基因鉴定

目的 研究一个彝族家系P1Pk血型系统中罕见p表型的分子遗传机制.方法 对34例家系成员样本进行血型血清学鉴定;红细胞稀有血型基因分型采用荧光定量PCR法;同时采用Sanger测序法分析α1,4-半乳糖基转移酶(α-1,4-galactosyltransferase,A4GALT)基因和β1,3-N乙酰半乳糖胺转移酶(...     

HLA新等位基因HLA-A~*2451的认定

目的发现和认定1个HLA新等位基因。方法应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因,PCR产物测序和基因克隆DNA测序,通过软件分析基因序列及与最同源HLA等位基因序列的差异。结果检出1样本,其HLA-A位点显示出多种不一致的结果,其中包括与已知所有HLA-A等位基因谱型不一致的新谱型,其HLA-A位点第3外显子序列与所有已知HLA-A等位基因序列不一致。软件分析表明该基因序列与同源性最高等位基因A*2415的差异只是在外显子3区域中的363位碱基发生了G→A1个碱基替代,并导致相应的121密码子由ATG(M)→ATA(I)。结论该等位基因为HLA-A位点的1个新等位基因,已被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*2451。     

基因测序鉴定新等位基因A＊33：03：14

目的：鉴定一个广东省结直肠癌患者人群中发现的 HLA 新等位基因并检测分析其核苷酸序列。方法采用 Qiagen 试剂盒提取样本 DNA,聚合酶链式反应-直接测序分型技术（PCR-SBT）获得 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的核苷酸序列及 HLA 高分辨率分型结果,并分析其与 HLA-A＊33：03：01基因序列的异同。结果发现1个与 HLA-A＊33：03：01核苷酸序列高度相似的新等位基因,与已知 HLA-A＊33：03：01相比,该等位基因在外显子3的碱基位置492出现 T→A 点突变,密码子位置149由 GCT→GCA,所对应编码的氨基酸均为丙氨酸,为同义突变。结论基因测序结果表明该基因序列为新的 HLA 等位基因,已提交 GeneBank,并于2013年2月被世界卫生组织 HLA 因子命名委员会正式命名为 HLA-A＊33：03：14。Genbank 注册号为 HWS10017874。     

HLA新等位基因的确认与研究及其在我国的开展

HLA为人类白细胞抗原英文缩写,也被称为白细胞血型或移植抗原,学名又称为主要组织相容性复合物(MHC),是受人体第6号染色体短臂上1组基因控制、在细胞膜上表达的1组糖蛋白。HLA系统是人类最为复杂的多态系统,在机体的免疫中起着不可替代的作用。在人类的进化过程中HLA逐渐形成了     

人类白细胞抗原新等位基因A＊2636的确认

背景:目前中华骨髓库主要采用分辨率较高的聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法检测人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1,该方法在高分辨率的同时,有些检测结果难以一次性确定,可采用DNA测序技术确认.目的:识别和确认一个人类白细胞抗原新等位基因.设计、时间及地点:以DNA为观察对象的开放性实验.常规初检聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法于2007 11在河南省红十字血液中心中华骨髓库河南分库人类白细胞抗原组织配型实验室完成,测序实验于2008-02在戴诺生物技术(北京)有限公司人类白细胞抗原实验室完成.材料:中国造血干细胞捐献者初检结果可疑为新基因的重采血样5 mL.方法:采用聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法进行常规人类白细胞抗原分型,发现A位点反应格局异常,提示有2个无法解释的假阳性探针反应(10FP、88FP)和1个假阴性探针反应(56FN)、不能正常判读给出确切结果时,采用DNA测序技术测定人类白细胞抗原A位点外显子2,3,4(Exon2,3,4)的核苷酸序列,并与已知相近等位基因进行序列对比分析.主要观察指标:测序结果与已知人类白细胞抗原等位基因序列的比较分析.结果:聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法基因分析结果显示,受检者人类白细胞抗原基因分型为A*02xx,26xx(10 FP、88FP 58FN),B·15(75),55xx,DRB1 08xx,11xx,A位点反应格局异常,提示有2个无法解释假阳性反应(10 FP、88FP),有1个似阴性探针反应(58FN),不能指定为任何人类白细胞抗原A位点等位基因.对本例人类白细胞抗原A基因第2,3,4外显子双向之直接测序结果分析显示:A*02010101,A*260101 292 S/C.分析测序结果峰图,292位置应为C,分析软什提示该基因改变在A*26new一侧.该序列与人类白细胞抗原A*260101进行比对,同源性99%,在第2外显子区域292位碱基发生了G→C,74位的密码了GAC>CAC最终导致了氨基酸的改变,即天冬氨酸(Asp)→组氨酸(His).结论:该序列为A位点的一个新等位基因,已在GenBank注册(注册号EU785343),并于2008-04被WHO-HLA因子命名委员会正式命名为A*2636.(HWS10005530).     

人类白细胞抗原新等位基因DRB11*15402的发现及确认

背景：目前国内骨髓库主要采用分辨率较高的聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法，该方法在提高分辨率的同时，使部分隐藏新基因的标本的检测结果表现为摸棱两可，对该可疑标本进行确认最简便的方法是DNA测序HLA分型检测。 目的：应用DNA测序方法确认HLA—DRB1位点1个新等位基因。 设计、时间及地点：常规初检于2005-11在河南血液中心中国骨髓库河南分库HLA组织配型实验室完成，测序实验于2006-04在美国海军骨髓库HLA实验室完成。 材料：中国造血干细胞捐献者初检结果可疑为新基因的重采血样5mL。 方法：采用聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型流式微珠杂交技术对中华造血干细胞捐献者进行HLA中低分型检测，对可疑为新等位基因的样本进行DNA测序分析，通过EBI（http：／／www．ebi．ac．uk／）和NCBI（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）将测序结果与已知的人类白细胞抗原（human leukoyte antigen，HLA）等位基因序列进行比较分析，以确认是否为新的基因序列。 主要观察指标：测序结果与已知HLA等位基因序列的比较分析。 结果：样本HLA—DRB1位点中低分型结果的初检、复检反应格局与分析软件数据库中HLA—DRB1等位基因的模板谱型均不匹配。样本DRB1＊11XX第2外显子序列与所有已知等位基因序列均不一致，与DRB1＊110401的同源性高达9970，外显子2区域中的308位碱基发生了C〉A碱基替代，并导致了相应氨基酸丙氨酸〉谷氨酸的改变。 结论：该等位基因为HLA-DRB1：11组中的1个新等位基因，2006-07被WHO的HLA因子命名委员会正式命名为HLA—DRB1＊115402。     

等位基因频率在鉴别模棱两可HLA基因型中的应用价值分析

本研究探讨采用等位基因频率直接鉴别模棱两可HLA基因型的应用价值。应用聚合酶链式反应（PCR）-测序分型方法（SBT）对658名汉族供者HLA-A、B、DRB1基因进行测序分型，并分别采用PCR-序列特异性引物法（SSP）和杂合性歧义引物分离法（HAPRs）对其中的模棱两可标本进行精确分型，进而利用等位基因频率计算真基因型的相对概率并与真实结果进行比对。结果表明：222个HLA-A，238个HLA-B和107个HLA-DRB1基因的模棱两可标本中，真基因型的相对概率高于95％的比例分别为99．5％（221／222）、95．8％（228／238）和97．7％（104／107）；与PCR—SSP和HAPRs分型结果相比，3个基因座的吻合率分别为100％（222／222）、99．6％（237／238）和99．1％（106／107），仅有B％3501／5501和DRB1＊1201／1504不同，其相对概率值分别为40．3％和2．1％。结论：在大规模供者HLA基因的PCR—SBT分型中，应用等位基因频率直接鉴别模棱两可基因型的方法不仅具有较高的准确率和可信度，而且更加经济、简便、快捷，但在移植前供、患者HLA基因的确认试验中必须慎重应用。     

新等位基因HLA-B^＊5812的认定

应用流式反向PCR-SSO和PCR-SSP基因分型技术发现可能的HLA新等位基因,对PCR产物进行HLA基因分型、DNA序列分析及克隆测序。发现一个样本的HLA-B位点结果异常,其核苷酸序列与已知所有HLA-B位点等位基因序列均不一致,与同源性最高的等位基因B*5801的差异在于第2外显子区域中的第69位碱基发生了G→T的替换,即"GCA→TCA",结果改变了第24位密码子编码的氨基酸,即"丙氨酸→丝氨酸"。判断该等位基因为HLA-B位点的一个新等位基因,已于2006年4月被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*5812。     

新等位基因HLA-A*24:233与HLA*-A26:89的分析确认

背景:分子生物学新技术的发展和大量应用加快了中国发现HLA新等位基因的步伐。新等位基因的发现不仅给HLA家族增加了新成员,同时也为研究民族或地区的优势基因或消失基因(不适合客观环境的基因)找到了突破点。目的:确认2个新的HLA等位基因,并分析其核苷酸序列。方法:应用PCR-SBT、GSSP测序基因分型技术对两份中华骨髓库供者样本进行HLA高分辨分型,发现2个样本HLA-A位点均为异常基因,与已知同源性最高的等位基因型进行序列比对,分析核苷酸序列的差异。结果与结论:2个样本HLA-A位点与目前已知的相应HLA-A等位基因序列均不一致,样本1与其同源性最高的A*24:02:01的差异表现在第3外显子区域中的第360位碱基由G>C,导致第96位密码子由谷氨酰胺变为组氨酸,样本2与其同源性最高的A*26:01:01比较差异表现在第2外显子区域中第97位碱基由T>C,导致编码的第9位密码子由酪氨酸变为组氨酸。结果表明两个样本为HLA-A位点的新等位基因,已提交GenB ank进行注册,并已被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*24:233与HLA-A*26:89。