食管癌组织STRBP8基因克隆及其生物信息学分析

目的:克隆食管癌组织核基质蛋白类视网膜母细胞瘤结合蛋白8(STRBP8)CDS编码序列,为建立其免疫学检测技术奠定基础。方法:从GenBank中获取STRBP8的基因序列,并根据其CDS区序列设计全长引物。利用Trizol法从食管癌组织中提取总RNA,通过逆转录获取STRBP8的cDNA,再利用梯度升温PCR方法对目标基因进行扩增。结果:本实验成功从食管癌组织中克隆出STRBP8的CDS序列。结论:STRBP8在食管癌组织均存在表达,为下一步建立其免疫学检测技术打下基础。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector Containing K8.1 Gene from Human Herpesvirus 8 and Its Expression in Eukaryotic Cell

目的 构建和表达人类疱疹病毒8型(HHV-8)K8.1基因真核表达载体.方法 聚合酶链反应(PCR)法从HHV-8感染细胞BCBL-1细胞总DNA中扩增HHV-8 K8.1全长基因;克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+);将重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体转染人胚肾细胞293细胞,提取总RNA,反转录PCR(RT-PCR)检测重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体在293细胞中的mRNA.结果 经测序,克隆的K8.1基因序列与GenBank中登记的K8.1基因100%同源;RT-PCR法检测在约370 bp位置出现条带,与预期的369 bp大小一致.结论 HHV-8 K8.1基因真核表达载体构建成功,并可在293细胞中表达.     

弓形虫MIC8基因对弓形虫病的免疫保护性研究

目的观察弓形虫MIC8基因对弓形虫病免疫保护性的效果。方法用PCR方法扩增弓形虫MIC8基因,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组表达载体pEGFP-MIC8;MIC8-EGFP转染293T细胞,荧光显微镜观察表达情况;然后分别用质粒pEGFP-MIC8、pEGFP-N1空载体及生理盐水肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,末次免疫3周后用弓形虫RH株速殖子感染免疫小鼠。结果 PCR扩增弓形虫MIC基因序列正确,构建的重组表达载体pEGFP-MIC8鉴定正确,荧光显微镜下观察到重组质粒能够在293T细胞中表达。弓形虫攻击感染后,质粒pEGFP-MIC8免疫小鼠与对照组相比,小鼠的存活时间有一定的延长。结论构建的真核表达重组质粒pEGFP-MIC8对抗击弓形虫攻击感染能够激发一定的免疫保护性。     

8-Br-cAMP对Eca-109细胞凋亡的影响

目的：探讨8—Br—cAMP对人食管癌Eca—109细胞凋亡的影响及其相关基因表达的变化。方法：采用TUNEL法检测细胞凋亡,应用原位杂交、组织化学、免疫组织化学以及RNA和蛋白质斑点印迹技术相对定量,观察8—Br—cAMP对Eca—109细胞凋亡相关基因及凋亡效应分子表达的影响。结果：8—Br—cAMP作用48h后可显著诱导Eca—109细胞凋亡,并见到野生型(wt)p53及iNOS基因表达上调,bcl—2、c—myc基因表达下调,iNOS活性增强,Fas—IR减弱。结论：8—Br—cAMP通过调控凋亡相关基因及凋亡效应分子的表达,使之相互作用、相互协同,诱导人食管癌Eca—109细胞的凋亡。其中,wtp53在该凋亡的诸多因素中起着关键作用。     

8-Cl-cAMP对人食管癌细胞EGFR表达的影响

目的 :探讨 8-Cl-cAMP对人食管癌细胞生长相关基因EGFR表达的影响。方法 :原代分组培养食管癌细胞后 ,采用完整细胞原位RNA斑点印迹技术对滴膜进行斑点印迹。结果 :经 8-Cl -cAMP处理的实验组EGFR的阳性信号较不加 8-Cl-cAMP处理的对照组EGFR的阳性信号弱 (P <0 .0 5 )。结论 :8-Cl-cAMP可下调与食管癌细胞生长相关的EGFR基因表达。     

肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用的研究

目的研究肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用。方法用脂质体法将人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子调控的肿瘤特异性表达载体hTERT-Caspase-8,瞬时转染端粒酶阳性的食管癌细胞株Eca109及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5。结果转染hTERT-Caspase-8对细胞Eca109的生长具有显著抑制作用,细胞凋亡水平显著升高;转染hTERT-Caspase-8对MRC-5的生长和凋亡均无明显影响。结论上述发现提示hTERT启动子可以调控Caspase-8基因在食管癌细胞中靶向性表达,选择性抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件。     

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白编码基因K8.1的分离、克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8．1编码基因，并置于大肠杆菌中作融合表达。方法：设计一对PCR引物，在引物的5′端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点，以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增出K8．1编码基因，克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含K8．1基因重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞，以异丙基硫代-β—D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：分离、克隆的411bp序列与基因数据库中所登记的HHV-8 K8．1序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个41ku的融合表达蛋白产生。结论：HHV-8K8．1编码基因在E.coli中初步获得正确表达。     

8—Cl—cAMP对人食管癌细胞EGFR表达的影响

目的：探讨8－Cl-cAMP对人食管癌细胞生长相关基因EGFR表达的影响。方法：原代分组培养食管癌细胞后，采用完整细胞原位RNA斑点印迹技术对滴膜进行斑点印迹。结果：经8－Cl-cAMP处理的实验组EGFR的阳性信号较不加8－Cl-cAMP处理的对照组EGFR的阳性信号弱（P＜0.05）。结论：8－Cl-cAMP可下调与食管癌细胞生长相关的EGFR基因表达。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核重组表达质粒的体外表达分析

目的:分析弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核表达质粒的体外表达。方法:大量提取纯化重组真核表达质粒pVAX1-GRA8,瞬时转染培养的vero E-6细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测GRA8在细胞中的表达。结果:从转染pVAX1-GRA8后的vero E-6细胞的RNA中扩增出GRA8的特异条带,转染细胞存在弓形虫感染血清识别的特异蛋白质条带。结论:真核表达质粒pVAX1-GRA8在vero E6细胞中获得表达。     

人疱疹病毒8型K12基因在大肠杆菌中的克隆和表达

目的：将人疱疹病毒8型（HHV－8）K12基因在大肠杆菌中进行融合表达。方法：设计一对PCR引物，在引物的5'端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点，用此引物从质粒pCR-K12中扩增出HHV－8的K12基因，PCR产物经双酶切后按正确阅读框连接到原核表达载体pGEX-6p-1上相应酶切位点，并转化BL21感受态细胞。结果：重组菌经异丙基硫代－β-D-半乳糖芏（IPTG）诱导后，菌体SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）显示有一个大小为33ku的融合表达蛋白产生。结论：初步表明K12基因在大肠杆菌中获得正确表达。     

miR-522促进食管癌增殖和转移的作用机制研究

目的 研究微小RNA-522(miR-522)对食管癌细胞增殖和转移能力的影响及作用机制.方法 选择2014年1月—2015年6月辽宁省健康产业集团阜新矿总医院心胸外科行食管癌根治性手术患者60例,qRT-PCR检测miR-522在食管癌组织和癌旁组织中的表达;培养食管癌细胞,qRT-PCR检测食管癌细胞系TE-1、T...     

靶向survivin基因小干扰RNA设计及鉴定

目的:利用生物信息学技术预测设计特异抑制survivin蛋白表达的siRNA序列,瞬时转染食道癌细胞KYSE-70,并观察对survivin蛋白表达的沉默效果。方法:依据NCBI数据库获得的survivin mRNA序列,利用Whitehouse,Sidirect和Rational SiRNA Design软件预测设计siRNA干扰序列,并利用BLAST分析干扰序列与人类全基因组的同源性;转染食管癌细胞KYSE-70,Western blot法鉴定蛋白表达。结果:初步预测出3条含21个核苷酸的survivin干扰序列,瞬时转染食道癌细胞KYSE-70后survivin蛋白表达明显下降。结论:运用生物信息学技术可快速便捷预测出抑制survivin表达的siRNA序列,为研究survivin在食管癌发生发展中的作用奠定了基础。     

抑制性消减杂交筛选食道癌相关基因

目的筛选食道癌发生、发展和转移过程中表达变化的基因。方法使用基于抑制性PCR技术的消减杂交方法,对食道鳞状上皮细胞癌组织与癌旁正常黏膜组织cDNA进行消减杂交,并对食道癌组织表达发生变化的基因克隆、测序及同源性分析。结果对等量的食道鳞状上皮细胞癌组织与癌旁正常黏膜组织cDNA进行消减杂交后,获得4个与食道癌发生与转移有关的序列标签,经测序和同源性检索证实为食道癌相关基因2、胱抑素B、膜联蛋白A1、钙粒蛋白A,它们的表达变化可能与食道癌的去分化、恶性增殖转化有关。结论抑制性消减杂交技术可高通量地分析食道癌发生、发展和转移过程中基因表达的变化。     

人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变的研究

目的：研究人食管癌组织中DNA聚合酶β（POLB）基因的突变情况。方法：利用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）、单链构象多态性（SSCP）和序列分析对30例人食管癌标本组织中DNA聚合酶β基因进行了检测。利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据。结果：手术切除浸润癌组30例食管癌标本中有13例POLB发生变异,突变率为43．3％（13／30）;而癌旁对照29例正常,仅1例异常。早期原位癌组14标本中有5例POLB发生变异,突变率为35．7％（5／14）;另外,在1例食管鳞状上皮增生中也发现有POLB变异发生。在7例癌组织中存在相同58bp(177位到234位）的基因片段缺失;共有8种点突变形式：（1）375位A→G（Ile→Val),(2)454位T→C（Phe→Ser),(3)462位G→T（Tlu→终止码）,（4）466位G→A（Gly→Glu）,（5)613位A→T（Lys→Ile),(6)648位G→C（Gly→Arg),(7)660位A→G（Arg→Gly)(8)670位A→G（Glu→Gly)。结论：本研究首次在食管癌中发现POLB基因突变;该酶基因突变可能与食管癌的发生、发展相关。     

沉默线粒体核糖体蛋白L35基因对人食管癌TE-1细胞生长的影响

目的：探讨慢病毒介导沉默线粒体核糖体蛋白L35（MRPL35）基因对人食管癌TE-1细胞生长的影响,并阐明其机制。方法：选择3种人食管癌TE-1、ECA109和KYSE150细胞,采用实时定量PCR法检测3种细胞中MRPL35 mRNA相对表达水平。食管癌TE-1细胞分为shMRPL35组和shCtrl组,分别加入沉默靶基因带有嘌呤霉素抗性的si-RNA慢病毒和带有嘌呤霉素抗性的阴性对照si-RNA慢病毒进行感染,建立稳定沉默MRPL35基因的食管癌细胞系,实时定量PCR及Western blotting法检测各组细胞中MRPL35基因沉默效率,采用CCK-8法检测各组细胞生长曲线,Annexin Ⅴ-PE/7AAD双染色后流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：3种食管癌细胞均表达MRPL35基因,3种细胞中MRPL35 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。实时定量PCR法和Western blotting法检测,shMRPL35组TE-1细胞中MRPL35 mRNA和蛋白表达水平明显低于shCtrl组（P<0.05）。与shCtrl组比较,shMRPL35组TE-1细胞生长速度明显降低（P<0.05）,凋亡率明显升高（P<0.01）。结论：沉默MRPL35基因可抑制食管癌细胞TE-1增殖,并通过凋亡途径发挥作用。     

食管癌组织中线粒体DNA突变检测

目的：检测食管癌组织中线粒体DNA(mtDNA)的突变。方法：提取8例食管癌组织的mtDNA；PCR扩增mtDNA的控制区，纯化PCR产物、与T载体连接，转化人肠杆菌，筛选出阳性克隆，用引物T7／SP6做PCR鉴定后测序，与GenRank序列对比。结果：8例标奉mtDNA的控制区共有36个位点发生突变，其中转换32个，颠换4个；同义突变13个，错义突变23个。结论：mtDNA突变很可能在食管癌的发生中发挥一定作用。     

γ-谷氨酸转肽酶的测定在食管癌诊断中的意义

本文对36例食管拉网涂片作r-谷氨酰转肽酶(r GT)染色,并与病理检查结果相对照:其中病理检得癌细胞者14例,其r-GT皆为阳性反应;14例未检出癌细胞者,其r-GT亦为阴性反应:但有8例病理未检出癌细胞,而其r-GT反应则为阳性。对病理未检出癌细胞而r-GT呈阳性的患者,进行定期随访,则有利于食管癌的早期诊断。     

食管癌上皮细胞分化与张力原纤维角蛋白表达的相关性

中间纤维、微管与微丝是胞质中的纤维状细胞器,对维持细胞外形、细胞器在细胞内的位置、调节细胞内与细胞间的运动等具有重要作用。角蛋白是直径为8～12nm的中间纤维。本文应用免疫荧光法研究了培养的正常人食管上皮,食管癌细胞与诱导分化前后食管癌细胞中间纤维角蛋白纤维的表达及其与张力原纤维的变化,以探讨角蛋白在肿瘤细胞分化与在肿瘤细胞生物学特性中的意义。