抗乙肝病毒前S(2)蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用

本文用聚合人血清白蛋白亲和层析柱纯化的含前S(2)-HBsAg,脾内接种BALB/c/小鼠,取其脾细胞与Sp2/0-Ag骨髓瘤细胞进行常规方法融合,以4种酶联法进行筛选,并经多次有限稀释亚克隆培养,最终选出3株为分泌抗前S(2)单克隆抗体的细胞株。再经亚克隆培养和多次传代与冻存,并用抑制酶联法检测其抗体,均为抗前S(2)抗体阳牲。接种BALB/c小鼠     

人颗粒蛋白前体F片段结构域单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人颗粒蛋白前体F片段(GrnF)的单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其生物学特性。方法通过分子生物学技术构建含人GrnF编码序列的酵母表达载体,表达并纯化酵母来源的融合人血清白蛋白(HSA)的GrnF片段HSA-GrnF。用纯化的HSA-GrnF免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,用ELISA筛选阳性克隆,并采用有限稀释法进行亚克隆;采用免疫荧光染色及Westernblot法对所获得的mAb的特异性进行鉴定,并用抗体亚类测定试剂盒检测所获得单克隆抗体亚类。结果成功获得2株可分泌特异性抗GrnF的杂交瘤细胞株(1G6及4E8),经鉴定这2株抗体重链亚类均为IgG1亚类。结论成功制备了抗人GrnF片段结构域的单克隆抗体。     

人颗粒蛋白前体F片段结构域单克隆抗体的制备与鉴定北大核心CSCD

目的制备抗人颗粒蛋白前体F片段(GrnF)的单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其生物学特性。方法通过分子生物学技术构建含人GrnF编码序列的酵母表达载体,表达并纯化酵母来源的融合人血清白蛋白(HSA)的GrnF片段HSA-GrnF。用纯化的HSA-GrnF免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,用ELISA筛选阳性克隆,并采用有限稀释法进行亚克隆;采用免疫荧光染色及Westernblot法对所获得的mAb的特异性进行鉴定,并用抗体亚类测定试剂盒检测所获得单克隆抗体亚类。结果成功获得2株可分泌特异性抗GrnF的杂交瘤细胞株(1G6及4E8),经鉴定这2株抗体重链亚类均为IgG1亚类。结论成功制备了抗人GrnF片段结构域的单克隆抗体。     

抗α-苦瓜素单克隆抗体的制备与鉴定

用α-苦瓜素(α-MMC)免疫小鼠(BALB/c),分离免疫脾细胞,采用聚乙二醇(PEG)法将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选出分泌抗α-MMC素的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株;采用小鼠体内诱生法制备腹水,Mabselect亲和层析纯化McAb,所得McAb经亚类鉴定为IgG2b亚类,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测,所得McAb与α-MMC特异反应,与相同来源的MAP30无交叉反应,为深入研究α-MMC的结构与功能提供了检测手段。     

CpG ODN对rHBsAg免疫小鼠Th1/Th2型免疫应答的影响

目的：初步探讨CpC寡脱氧核苷酸(CpG ODN)与重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)联合免疫小鼠的Th1／Th2型免疫应答效应。方法：BALB／c小鼠经后腿胫骨前肌免疫2次，ELISA法检测血清乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)IgG亚类IgG2a/IgG1的比值；生物活性法检测脾细胞诱生上清中的IFN-γ和IL-2含量；ABC-ELISA法检测小鼠血清中IL-4、IL-10及IL-12含量。结果：加CpG ODN组与单独注射rHBsAg组相比：抗-HBs IgG亚类IgG2a／IgG1比值明显高；Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的表达增强，抑制Th2型细胞因子IL-4和IL-10的产生。结论：CpCODN能够明显增强rHBsAg免疫小鼠Th1型抗体亚类IgG2a的产生，并且诱导Th1型细胞因子的表达，抑制Th2型细胞因子的表达。     

炭疽中性蛋白酶部分片段的重组表达、纯化及免疫效果研究

构建表达炭疽杆菌中性蛋白酶基因部分片段N蛋白(位于248~532氨基酸),并对其免疫效果进行研究;设计引物采用PCR法自炭疽杆菌扩增中性蛋白酶部分片段N,T-A克隆后构建原核表达质粒pET28a(+)-N,通过Western blot检测重组蛋白的免疫原性。以Al(OH)3为佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法测血清总IgG水平,MTT比色法测定脾T淋巴细胞增殖,采用流式分选法对脾T淋巴细胞亚群分类;Western blot显示重组蛋白具有免疫原性,rN免疫BALB/c小鼠后,ELISA检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生;T淋巴细胞亚群试验表明,重组N蛋白以诱发Th2型免疫反应为主;MTT试验表明,rN蛋白对小鼠脾细胞在体外有促进生长和增殖能力,说明该重组蛋白具有生物学活性。纯化的rN可诱导高水平的抗体反应,为进一步的功能研究奠定了基础。     

抗人AFP单抗及多抗与丝裂霉素联接物对肝癌细胞的杀伤作用

用本室制备的分泌IgG AFP McAb的杂交瘤株G2及G10,接种于BALB/c小鼠腹腔,取其腹水经硫酸铵及Sepharose 4B柱亲和层析纯化,获得抗人AFP单抗。将马抗人AFP血清经硫酸铵及Sepharose 4B柱亲和层析提取AFP抗体IgG,得到AFP多抗。将纯化     

抗人肺腺癌单克隆抗体放射免疫显像的动物实验研究

本文介绍用单克隆抗体进行裸鼠移植瘤的放射免疫定位的实验结果。用人肺腺癌细胞株(LTEP-a_2)免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0细胞融合,筛选出产生抗LTEP-a_2抗体的杂交瘤细胞,经3次亚克隆后,注入BALB/c小鼠腹腔,产生腹水。Zetaprep离子交换     

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立抗伏马菌素B1（FB1）的单克隆杂交瘤细胞株,制备抗FB1的单克隆抗体（McAb）。方法采用FB1-KLH偶联物小剂量长周期免疫BALB/c小鼠后,采用细胞融合方法获得分泌抗FB1的杂交瘤细胞株,采用多次亚克隆的方法建立了4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株。腹水诱生法获得大量McAb,采用抗体亚类测定试剂盒鉴定抗体的亚类,SDS-PAGE测定抗体分子量,McAb的特异性和灵敏度用间接竞争抑制ELISA。结果免疫小鼠血清检测结果显示经过5次免疫后血清的效价稳定在1×10-6,经过4次亚克隆后建立4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株,获得腹水,纯化抗体,抗体亚类属于IgG2a类,轻链为κ,轻链和重链的相对分子质量分别是55000和32000,ELISA检测抗体特异性显示可与FB1发生特异性反应,采用此抗体建立间接竞争抑制ELISA方法的线性范围在2～500ng/ml。结论制备了特异性和灵敏度较高的抗FB1单克隆抗体,为建立伏马菌素免疫学检测方法打下良好基础。     

用免疫荧光法筛选抗人μ链单克隆抗体(McAb)的研究

用人血清IgM球蛋白重链-μ链免疫的BALB/c小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤Sp 2/0细胞在PEG作用下融合,用免疫荧光法筛选出6种分泌McAb的杂交瘤细胞,其中5株确定为抗人μ链McAb,一株未定。杂交瘤细胞经四次克隆,半年多传代,接种BALB/c鼠可稳定的产生腹水抗体。     

抗猪囊虫单克隆抗体的制备及应用

目的利用杂交瘤技术制备抗猪囊虫单克隆抗体,建立抑制性酶联免疫吸附法I-ELISA并应用于临床.方法运用自提的猪囊虫囊液与福氏不完全佐剂加干扰素混合免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,反复筛选及克隆化;用低温无水乙醇沉淀法分离纯化单抗IgG(腹水抗体效价13200);用改良的过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标单抗;用I-ELISA检测患者脑脊液和血清中囊虫特异性抗体.结果获得了3株稳定分泌抗猪囊虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗的免疫球蛋白亚类鉴定为2株IgG3,1株IgM.标记的HRP-IgG酶标单抗,经临床病例标本验证,确诊的脑囊虫病患者脑脊液63例,抗体阳性61例,阳性率为96.83%;血清标本60例,抗体阳性53例,阳性率为88.33%;其他颅内感染性疾病患者脑脊液标本240例、血清标本240例,肝肺包虫病患者血清10例,正常脑脊液25例(阑尾炎手术腰麻患者),健康志愿者血清32例,检测结果均为阴性.结论本研究制备的HRP-IgG酶标单克隆抗体经临床应用,证实对脑囊虫病有良好诊断价值.     

SARS冠状病毒棘突蛋白的S1蛋白诱导小鼠产生中和抗体的研究

目的 研究SARS冠状病毒棘突蛋白受体结合部位S1的免疫原性，为SARS的实验诊断和新型疫苗的研究提供依据。方法 用克隆有哺乳动物细胞密码子优化的SARS-CoV S1基因的质粒pcDNA3．1／S1或P-S1Ig转染293T细胞，用细胞的上清液纯化S1蛋白。以pcDNA3．1／S1质粒对BALB／c小鼠进行2次基因免疫，以纯化的S1蛋白进行加强免疫。用ELISA法检测小鼠抗SARS-CoV的特异性IgG抗体，并在Vero E6细胞上做体外中和实验，检测中和抗体。结果 S1蛋白诱导小鼠产生抗SARS-CoV的特异性抗体；1：1499．68稀释的S1蛋白免疫的小鼠血清可保护50％的细胞对1000TCID50的病毒攻击，而阴性对照血清不能保护细胞对病毒的感染。结论 SAPS冠状病毒棘突蛋白受体结合部位S1能有效诱导机体产生具有高效保护作用的中和抗体免疫反应，可望发展成为理想的SARS棘突蛋白亚单位疫苗。     

肿瘤细胞组蛋白的免疫原性研究

为了寻找肿瘤患者血清中多种抗核抗体 (antinuclearantibodies,ANA )生成的新的可能免疫原 ;进一步论证细胞活化是核抗原性发生改变并诱导抗体产生的根本因素。提取SP2 / 0瘤细胞组蛋白免疫同系BALB/c小鼠 ,用ELISA方法检测IgG类抗组蛋白、抗dsDNA抗体 ,免疫荧光法检测ANA核型 ,免疫印迹法测定可溶性核抗原 (ENA )抗体。结果 :SP2 / 0瘤细胞组蛋白诱导同系BALB/c小鼠产生了IgG类抗组蛋白、抗dsDNA、抗Sm、抗SS A/SS B等多种自身ANA ,其核型有周边型、均质型、颗粒型等。推测肿瘤细胞组蛋白是诱导ANA生成的免疫原之一。     

抗人生长转化因子15单克隆抗体制备及鉴定

目的:制备抗人生长转化因子15(GDF15)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,诱导表达并纯化GST-GDF15融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆,最终获得稳定分泌抗GDF15 mAb杂交瘤细胞株。以间接ELISA法检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测在肝癌患者血清中GDF15表达水平。结果:获得1株稳定分泌抗人GDF15 mAb杂交瘤细胞株,命名为9G3;抗体免疫球蛋白亚类为IgG1,轻链为κ型;免疫共沉淀及质谱分析证实抗GDF15 mAb9G3能与肝癌患者血清中GDF15蛋白特异性结合并且GDF15水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。结论:成功制备了抗人GDF15mAb,为后期肝癌早期诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

一株抗双链DNA单克隆抗体的制备及其特性研究

制备抗双链DNA(dsDNA)单克隆抗体并对其生物学特性进行初步研究。以活化淋巴细胞的DNA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体;用体内诱生法制备腹水,以间接酶链反应吸附试验(ELISA)法分析抗体的亚类、特异性和亲和力;用免疫荧光法检测抗体的荧光核型;用考马斯亮蓝法检测注入杂交瘤细胞的小鼠的尿蛋白含量。结果显示,成功获得了1株持续稳定分泌抗dsDNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为6C2;该细胞株所分泌的抗体亚类为小鼠IgG2a,能特异性结合dsDNA,亲和力常数为2.67×10~8mol/L,免疫荧光核型为均质型;将6C2细胞注入正常BALB/c小鼠腹腔后,小鼠的尿蛋白含量较对照组明显增高。结果表明,抗dsDNA单克隆抗体6C2是致病性抗体,对于进一步研究抗dsDNA抗体的致病机制具有重要的价值。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb).方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆, 直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体, 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定.结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选, 共获得5株抗pET28a-3D的mAb, 其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b, 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位.Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合, 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白.结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb , 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础.     

分泌抗HBeAg单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立和初步应用

应用血清纯化的HBeAg免疫BALB/c小鼠,取该鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,获得两株分泌抗HBe的杂交瘤细胞系(HE_(20)1B_8,HE_(21)2C_(11))。接种同系小鼠腹腔诱生的腹水中用ELISA测定抗HBe效价达3.2×6.4×10~6。因相捕捉HBeAg,HBsAg和HBcAg特异性试验以及中和试验均证明是针对HBeAg的特异性抗体。临床应用作为ELISA检测HBeAg和抗HBe试剂包被抗体,配合人抗HBe-HRP,结果与Abbott试剂非常一致。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒pVAX-S2S的构建及DNA免疫

目的为探索更安全的乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒,并观察其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫应答情况.方法采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出乙肝表面抗原中蛋白(preS2+S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,酶切鉴定,按不同剂量一次性肌内注射免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗-HBs.结果酶切鉴定重组质粒pVAX-S2S为正向插入的阳性克隆.HBVDNA疫苗(pVAX-S2S)高(100μg/只)、中(50μg/只)、低(10μg/只)三组剂量一次性免疫健康BALB/c小鼠,均能在2 w诱导抗-HBs产生,抗体效价随时间延长而增长.血清抗体水平比较,高剂量组(97.83±38.78)mU/ml较中剂量组(45.13±21.12)mU/ml、低剂量组(19.74±11.92)mU/ml差异均具显著性(P＜0.05),以后的4,8 w高、中剂量组间差别缩小,但两者较低剂量组差异均具显著性(P＜0.05)和非常显著性(P＜0.01).结论卡那霉素抗性的重组质粒pVAX-S2S能有效诱导正常小鼠产生体液免疫应答.     

抗苗勒管激素免疫磁珠的制备及其初步应用

目的制备人的抗苗勒管激素(AMH)免疫磁珠及酶标抗体,初步建立一种基于纳米磁珠的双抗体夹心ELISA快速检测方法。方法构建人AMH重组蛋白表达载体,表达和纯化AMH重组蛋白,将获得的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。通过聚乙二醇将脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,采用ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内腹水诱生法制备抗体,结合Western blot法评价单克隆抗体。利用蛋白A(Protein A)对抗体进行亲和层析纯化,将多克隆抗体作为捕获抗体偶联至纳米级羧基聚合物磁珠,以高碘酸钠法对单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记作为抗体探针,建立并优化基于纳米磁珠的双抗体夹心ELISA。结果获得一株具有良好特异性的抗AMH单克隆抗体,其亚型为IgG2b,纯化的多克隆抗体和单克隆抗体的效价均可达1∶51 200。与磁珠偶联后的捕获抗体以及酶标记后的探针抗体仍然具有较好的活性。建立的方法可在1 h左右检测出AMH抗原,检测下限在50 ng/mL左右。结论制备的AMH免疫磁珠能够用于重组AMH的检测,具有快速、可视化的优点。     

CCK-8对KLH免疫小鼠脾细胞Th1/Th2平衡的影响

目的： 探讨八肽胆囊收缩素（CCK-8）对Th1/Th2平衡的调节作用。方法: 给予BALB/c小鼠钥孔戚血蓝蛋白（KLH）免疫同时体内给予不同剂量的CCK-8,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其脾细胞培养上清中Th1型细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2（IL-2）和Th2型细胞因子白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）水平,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5 mRNA表达;ELISA法检测血清中Th1型抗KLH抗体IgG2a和Th2型抗KLH抗体IgG1水平。结果: ①KLH免疫使小鼠脾细胞分泌Th1/Th2型细胞因子水平明显增高,mRNA表达增高,KLH免疫同时给予CCK-8可使脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-2含量进一步增加和IFN-γ、IL-2mRNA表达增高,而使IL-4、IL-5含量降低,IL-4、IL-5 mRNA表达减低和降低IL-4/IFN-γ比值。②KLH免疫小鼠血清中IgG2a、IgG1发生不同程度增高,CCK-8可使其血清中IgG1水平减低而使IgG2a水平增高。结论: CCK-8可促进KLH免疫小鼠体内Th1反应,使Th2优势反应向Th1方向转变。