大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。目的：建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。方法：采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。结果与结论：二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞是骨组织工程的重要种子细胞之一。但是成骨细胞培养难度大,不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的：验证及比较成骨细胞原代培养常用的3种方法,探索一种操作简便,既经济又高效的原代培养成骨细胞的方法,为进一步的实验研究奠定基础。方法：取新出生72 h 内SD大鼠乳鼠颅骨,以胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法分离成骨细胞,进行细胞形态观察、细胞化学染色、CCK-8法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。结果与结论：分离培养的成骨细胞增殖良好,具备典型成骨细胞特性,细胞化学染色结果明显。胶原酶消化法比分段胶原酶消化法提取的成骨细胞数量多,细胞存活率高(P<0.05);且比分段胶原酶消化法操作简单,耗时短。组织块法操作最为简单,对细胞损伤较小,但是细胞数量低、耗时长,很难用于大规模成骨细胞培养。胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。     

Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养及鉴定

目的　探讨Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养方法 ,在形态学方面及晶体蛋白的特异性表达方面 ,对原代和第二代细胞进行鉴定。方法　在无菌条件下 ,取新生Wistar大鼠乳鼠晶体 ,解剖镜下剔除粘附的虹膜及悬韧带 ;室温条件下 ,于终浓度 0 0 8%的胰蛋白酶液中消化 5～ 10min后离心 ,用 199培养液调细胞至适当浓度 ,37℃ 5 %CO2 条件下培养 ,3～ 4d换液 1次 ;待细胞长成连续单层后 ,以 1∶2或 1∶3传代。结果　原代及第二代细胞形态呈典型的上皮细胞表型 ,从第三代起细胞形态发生了较大变化 ,提示细胞已开始分化。以Northern印渍杂交对培养细胞晶体蛋白的特异性表达进行了鉴定 ,发现原代及第二代细胞内仅存在α晶体蛋白mRNA。结论　原代和第二代细胞尚未进入分化状态 ,可用作进一步实验的材料。     

组织块法培养SD大鼠的成骨细胞及鉴定

背景：获得足够量高纯度的成骨细胞比较困难,因此掌握简单而快速提取成骨细胞并进行培养鉴定势在必行。目的：应用组织块法对SD大鼠成骨细胞的体外培养与鉴定。方法：取新生（〈24h）SD大鼠颅骨,去除周围多余的组织,将剔净颅骨剪成1mm3大小的碎块,分别用常规方法和组织块法（改良）方法进行成骨细胞培养,从形态学、碱性磷酸酶和茜苏红染色等方法鉴定。结果与结论：利用改良方法培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶呈阳性染色,茜素红染色后有矿化结节的形成。组织块法培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞成分单一、细胞培养时间短、数量、纯度、密度均一致,从而的得到稳定的成骨细胞系,为进行体外实验建立了良好的平台。     

中国实验用小型猪成骨细胞的培养与鉴定

目的：分离、诱导培养中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞，并进行形态学与生物学性能鉴定，为骨组织工程研究提供新型种子细胞。方法：实验于2002—08／2004—08在天津市口腔医院暨天津市整形外科医院中心实验室组织工程实验室完成。采用胶原酶消化法和诱导条件培养法自新生中国实验用小型猪四肢骨松质分离成骨细胞，经细胞生活形态观察、细胞倍增时间测定、透射电镜超微结构分析、裂解上清碱性磷酸酶检测、矿化结节形成测定等方法进行成骨细胞的生物学性能鉴定，以获取中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞的必备的增殖活性与成骨活性数据。结果：①原代培养中国实验用小型猪成骨样细胞具有很强的贴壁率，细胞分裂旺盛，2～3d即可达到完全融合。细胞形态呈多角形和星形、胞体大、胞核圆，核仁丰富，通常为两三个核仁；胞浆中核周见散在黑色颗粒。②条件培养液诱导后的猪成骨样细胞培养6d左右可见细胞呈旋涡状复层生长，胞突伸展互相连接并集结成细胞簇团，中心区形成褐色结节；细胞核周围胞浆中出现大量黑色颗粒。③细胞增殖曲线显示猪成骨样细胞在播种3d后进入对数生长期，15d左右达到生长峰值；经细胞倍增时间公式计算猪成骨样细胞倍增时间为67．2h。④透射电镜观察显示：中国实验用小型猪成骨样细胞表面突起极丰富；核大，有较多和较深的内陷；核仁大而多窗孔，胞质内细胞器常常分布于核的一侧，扩张的粗面内质网池内有中等电子密度的蛋白质沉淀，其膜表面的核糖体密集分布。Golgi氏复合体发达，并见胞质内微丝及多量的游离核糖体。核仁特征为高转录活动的核仁。细胞外形、核谱型、核位置以及咆质内细胞器的特征性分布符合成骨细胞的超微结构特征。⑤猪成骨样细胞的碱性磷酸酶活性在β-磷酸甘油和地塞米松刺激后3d开始上升，18d达到高峰，21d时开始下降。⑥Von Kossa染色显示从培养6d开始，小型猪成骨样细胞培养细胞层出现散在的小矿化结节，以后数量渐多，体积渐大，21d达高峰，体外成骨活性显著。结论：中国实验用小型猪骨松质成骨细胞具备骨组织工程种子细胞必备的增殖活性与成骨活性，适合作为骨组织工程的种子细胞。     

中国实验用小型猪成骨细胞的培养与鉴定

目的:分离、诱导培养中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞,并进行形态学与生物学性能鉴定,为骨组织工程研究提供新型种子细胞。方法:实验于2002-08/2004-08在天津市口腔医院暨天津市整形外科医院中心实验室组织工程实验室完成。采用胶原酶消化法和诱导条件培养法自新生中国实验用小型猪四肢骨松质分离成骨细胞,经细胞生活形态观察、细胞倍增时间测定、透射电镜超微结构分析、裂解上清碱性磷酸酶检测、矿化结节形成测定等方法进行成骨细胞的生物学性能鉴定,以获取中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞的必备的增殖活性与成骨活性数据。结果:①原代培养中国实验用小型猪成骨样细胞具有很强的贴壁率,细胞分裂旺盛,2～3d即可达到完全融合。细胞形态呈多角形和星形、胞体大、胞核圆,核仁丰富,通常为两三个核仁;胞浆中核周见散在黑色颗粒。②条件培养液诱导后的猪成骨样细胞培养6d左右可见细胞呈旋涡状复层生长,胞突伸展互相连接并集结成细胞簇团,中心区形成褐色结节;细胞核周围胞浆中出现大量黑色颗粒。③细胞增殖曲线显示猪成骨样细胞在播种3d后进入对数生长期,15d左右达到生长峰值U经细胞倍增时间公式计算猪成骨样细胞倍增时间为67.2h。④透射电镜观察显示:中国实验用小型猪成骨样细胞表面突起极丰富;核大,有较多和较深的内陷U核仁大而多窗孔,胞质内细胞器常常分布于核的一侧,扩张的粗面内质网池内有中等电子密度的蛋白质沉淀,其膜表面的核糖体密集分布。Golgi氏复合体发达,并见胞质内微丝及多量的游离核糖体。核仁特征为高转录活动的核仁。细胞外形、核谱型、核位置以及胞质内细胞器的特征性分布符合成骨细胞的超微结构特征。⑤猪成骨样细胞的碱性磷酸酶活性在β-磷酸甘油和地塞米松刺激后3d开始上升,18d达到高峰,21d时开始下降。⑥VonKossa染色显示从培养6d开始,小型猪成骨样细胞培养细胞层出现散在的小矿化结节,以后数量渐多,体积渐大,21d达高峰,体外成骨活性显著。结论:中国实验用小型猪骨松质成骨细胞具备骨组织工程种子细胞必备的增殖活性与成骨活性,适合作为骨组织工程的种子细胞。     

成骨细胞的体外培养与鉴定

背景:成骨细胞的体外培养方法均存在一定的局限性.目的:对体外培养成骨细胞的来源,成骨细胞的培养方法及培养条件,鉴定成骨细胞的标志进行总结.方法:以"Osteoblast,cell culture,identification"为检索词,检索PubMed 数据库(2000/2010),以"成骨细胞、细胞培养、鉴定"为检索词,检索万方数据库(2000/2010),文献检索语种限制为英文和中文.纳入与成骨细胞的体外培养及鉴定密切相关的研究,排除重复性研究和Meta 分析后对文献进行综述.结果与结论:随着体外细胞培养技术的发展,人们已经从许多动物的骨、骨膜、骨髓及骨外组织中成功培养了成骨细胞,经鉴定具有典型成骨细胞的特征及良好的生物学特性,目前体外培养成骨细胞为常用的体外实验模型,成为研究骨生理、病理及修复的重要手段,也成为研究成骨细胞生长代谢及骨组织工程的基础.     

成骨细胞的体外培养与鉴定

背景：成骨细胞的体外培养方法均存在一定的局限性。目的：对体外培养成骨细胞的来源,成骨细胞的培养方法及培养条件,鉴定成骨细胞的标志进行总结。方法：以＂Osteoblast,cell culture,identification＂为检索词,检索PubMed数据库（2000/2010）,以＂成骨细胞、细胞培养、鉴定＂为检索词,检索万方数据库（2000/2010）,文献检索语种限制为英文和中文。纳入与成骨细胞的体外培养及鉴定密切相关的研究,排除重复性研究和Meta分析后对文献进行综述。结果与结论：随着体外细胞培养技术的发展,人们已经从许多动物的骨、骨膜、骨髓及骨外组织中成功培养了成骨细胞,经鉴定具有典型成骨细胞的特征及良好的生物学特性,目前体外培养成骨细胞为常用的体外实验模型,成为研究骨生理、病理及修复的重要手段,也成为研究成骨细胞生长代谢及骨组织工程的基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

大鼠肌源性干细胞的培养与鉴定

背景:肌源性干细胞是一种成体多能干细胞,已成为基因治疗和细胞介导的组织工程领域内的研究热点,临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁具有广泛前景。目的:探讨大鼠肌源性干细胞体外原代培养的方法,为临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁提供实验依据。设计:重复观察测量。单位:武汉大学人民医院生殖中心与泌尿外科。材料:实验于2003-12/2004-05在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。选取4～6周龄雌性SD大鼠20只,XI型胶原酶、胰酶、多聚赖氨酸(Sigma公司),dispase酶(Gibco公司),鸡胚提取液(自制)。方法:①将大鼠以质量浓度为10g/L的戊巴比妥钠30g/kg腹腔麻醉后,无菌条件下取腓肠肌,置入冷DMEM培养基中,D-Hank’s液洗涤组织块,除去筋膜、肌腱、神经和血管,剪成1.0～3.0mm3小块,移入离心管。向组织中加入0.2%XI型胶原酶及0.1%的胰酶,采用胶原酶分离大鼠骨骼肌细胞。②应用差速贴壁法大鼠骨骼肌细胞进行纯化。细胞筛网过滤后接种至多聚赖氨酸包被的培养瓶中,37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育1h,未贴壁细胞移入新的培养瓶中,加入新的培养基37℃培养1h后,未贴壁细胞再次转瓶换液,37℃培养过夜,如此反复,每次间隔24h转瓶换液,培养第5～6天贴壁的细胞即肌源性干细胞。③细胞生长到70%融合后,胰蛋白酶消化,以1∶2的比例进行传代。传代细胞消化后接种于放有盖玻片的6孔培养板中,加入生长培养基,24h后制备细胞爬片,采用免疫组织化学方法鉴定所培养细胞上特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1的表达。主要观察指标:肌源性干细胞的形态及其鉴定结果。结果:①肌源性干细胞的形态观察:从骨骼肌组织中分离出来的肌源性干细胞呈球形,折光性强。培养12h后开始贴壁仍为圆形,48h后贴壁完全并开始增生,细胞逐渐延展成梭形或纺锤形,有两极,体积小。随培养时间的延长,细胞相互融合形成成熟的多核肌管。②肌源性干细胞的鉴定结果:细胞特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1染色呈阳性,荧光显微镜可见细胞浆发出红色荧光,阳性率达90%。结论:肌原性干细胞属于成体干细胞,具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点。高纯度的肌原性干细胞可通过体外原代培养获取,免疫组化技术可鉴定其肌源性和干细胞特性,在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。     

大鼠肌源性干细胞的培养与鉴定

背景：肌源性干细胞是一种成体多能干细胞，已成为基因治疗和细胞介导的组织工程领域内的研究热点，临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁具有广泛前景。目的：探讨大鼠肌源性干细胞体外原代培养的方法，为临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁提供实验依据。设计：重复观察测量。单位：武汉大学人民医院生殖中心与泌尿外科。材料：实验于2003-12／2004-05在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。选取4～6周龄雌性SD大鼠20只，XI型胶原酶、胰酶、多聚赖氨酸（Sigma公司），dispase酶（Gibco公司），鸡胚提取液（自制）。方法：①将大鼠以质量浓度为10异／L的戊巴比妥钠30s／ks腹腔麻醉后，无菌条件下取腓肠肌，置人冷DMEM培养基中，D—Hank’s液洗涤组织块，除去筋膜、肌腱、神经和血管。剪成1．0-3．0mm^3小块，移入离心管。向组织中加入0．2％XI型胶原酶及0．1％的胰酶。采用胶原酶分离大鼠骨骼肌细胞。②应用差速贴壁法大鼠骨骼肌细胞进行纯化。细胞筛网过滤后接种至多聚赖氨酸包被的培养瓶中，37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中孵育1h，未贴壁细胞移人新的培养瓶中，加入新的培养基37℃培养1h后，未贴壁细胞再次转瓶换液，37℃培养过夜，如此反复，每次间隔24h转瓶换液，培养第5-6天贴壁的细胞即肌源性干细胞。③细胞生长到70％融合后，胰蛋白酶消化，以1：2的比例进行传代。传代细胞消化后接种于放有盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基，24h后制备细胞爬片，采用免疫组织化学方法鉴定所培养细胞上特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1的表达。主要观察指标：肌源性干细胞的形态及其鉴定结果。结果：①肌源性干细胞的形态观察：从骨骼肌组织中分离出来的肌源性干细胞呈球形，折光性强。培养12h后开始贴壁仍为圆形，48h后贴壁完全并开始增生，细胞逐渐延展成梭形或纺锤形，有两极，体积小。随培养时间的延长，细胞相互融合形成成熟的多核肌管。②肌源性干细胞的鉴定结果：细胞特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞浆发出红色荧光。阳性率达90％。结论：肌原性干细胞属于成体干细胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点O高纯度的肌原性干细胞可通过体外原代培养获取．免疫组化技术可鉴定其肌源性和干细胞特性，在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。     

大鼠脂肪干细胞的分离培养及鉴定的初步研究

目的探讨大鼠脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）分离、培养及纯化方法,并对其表面标志进行鉴定。方法以Wistar大鼠为研究对象,取其腹股沟皮下脂肪组织,经冲洗、剪碎成浆状后,以Ⅱ型胶原酶消化。消化液经滤网过滤后,离心悬浮细胞,并接种于培养瓶内。经差速贴壁法纯化细胞。以免疫荧光方法对其表面标志CD44,CD29及CD106,CD34进行鉴定。激光共聚焦显微镜下观察评估。结果原代培养的ASCs呈星型或多角型,经传代后的ASCs形态比较均一,呈长梭形,漩涡样生长。冻存复苏后的ASCs仍保持较好的活力,存活率较高。经差速贴壁法可获得较纯的ASCs。免疫荧光检测ASCs表面标志鉴定结果显示CD44,CD29阳性表达,CD106,CD34阴性表达。结论本研究进一步改进的了ASCs分离培养及纯化方法,为ASCs最终应用于临床提供了有意义的实验依据。     

改进酶消化法培养SD大鼠成骨细胞及其鉴定

摘要 目的：改进SD大鼠成骨细胞的体外分离、培养方法并进行功能鉴定。方法：将新生SD大鼠处死，无菌条件下取出颅骨，剔净骨膜后剪成1mm3大小组织块。组织块经0.25%胰蛋白酶消化20min，继以0.1% II型胶原酶消化60 min，收集上清离心，所得成骨细胞接种于培养瓶中并行“多次贴壁法”纯化。观察细胞形态学，选用ALP Gomori 钙钴法染色，钙结节茜素红法染色及I型胶原免疫组化染色等方法进行鉴定。 结果：培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征，在体外培养时可维持其在体内的功能:合成碱性磷酸酶、形成矿化结节，I型胶原染色阳性。结论：用改进后的酶消化法分离、培养SD大鼠成骨细胞，更能减少胰蛋白酶在消化过程中对细胞造成的损伤，所获成骨细胞量多、纯度高，操作简易可行，可作为骨组织工程种子细胞常规的培养方法。     

成骨细胞不同体外培养方式的耗氧速率检测

背景:近年来组织工程种子细胞结合微胶囊技术在细胞治疗、基因治疗和药物控制释放等方面的应用越来越广泛,检测成骨细胞的耗氧量和耗氧速率,可为成骨细胞在不同培养模式中的体外培养、扩增和工程化骨组织的三维构建以及以上方面的实验提供相关的理论依据.目的:实验拟对比成骨细胞在体外静态直接培养和包囊培养两种不同方式中的耗氧量和耗氧速率.设计、时间及地点:对比观察,于2007-03109在大连理工大学精细化工国家重点实验室于细胞与组织工程研发中心完成.材料:出生二三天SD大鼠10只,SPF级,雌雄不拘:海藻酸钠溶液购自天津远航化学品有限公司.方法:无菌条件下取大鼠颅骨,剔净后剪成1 mm×1mm碎组织块,经2.5 g/L胰蛋白酶溶液和1g/L Ⅱ型胶原酶溶液分别消化后,加入含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养基,调节细胞浓度为109 L-1后接种在T-25培养瓶内.取二三代细胞分别接种子培养瓶中直接静态培养和经海藻酸钙微胶囊包囊后培养.主要观察指标:倒置相差屁微镜下观察成骨细胞在静态培养瓶中和包囊培养过程中的黏附、伸展、分布情况,并测定细胞生长曲线.检测成骨细胞的生物学性能及不同体外培养方式中成骨细胞消耗氧的速率.结果:①原代培养的成骨细胞为贴学生长,形态多为梭形或多边形.经包囊培养后成骨细胞在海藻酸钙微胶珠中呈圆形,细胞分布均匀.②体外培养的成骨细胞各种生物学性能良好.③体外静态培养瓶与包囊培养效果良好,耗氧速率分别为5.56×10-6μmol/min 和 1.25×10-4 μmol/min.结论:体外静态直接培养的耗氧量和耗氧速率高于包囊培养法,体外静态培养与包囊培养的成骨细胞各种生物学性能都良好,适于作为组织工程的种子细胞进行下一步的实验.