白杨素对人肝癌BEL-7402细胞表面超微结构和蛋白质磷酸化及相关通路的影响

背景：白杨素是保健食品和中草药中常见的具有防癌抗癌活性的食源黄酮类天然产物。白杨素是否有助于防治肝癌？其作用机制为何？是否促进肝癌干细胞的分化？对此尚缺乏系统研究。目的：以人肝癌细胞为对象,揭示白杨素的亚细胞和分子作用机制。方法：应用酸性磷酸酶实验、扫描电镜、免疫印迹技术探讨白杨素对BEL-7402细胞的作用及其机制。结果与结论：白杨素显著抑制BEL-7402细胞的体外增殖,半数抑制浓度IC50为24.9mol/L或6.3mg/L。白杨素与PI3K-AKT途径特异性抑制剂LY294002联用具有显著的协同抗癌效应。但白杨素本身并不改变AKT、磷酸化pAKT、AKT下游分子GSK-3和磷酸化pGSK-3的表达水平,虽然高剂量下β-catenin略有下调。白杨素导致细胞表面微绒毛样突起密度明显增加并形成纳米膜粒;细胞回缩,间隙加宽;出现形态上不同于凋亡的死亡细胞。白杨素显著改变多种蛋白质的丝/苏氨酸磷酸化水平;对酪氨酸磷酸化亦有广谱下调作用,接近于表柔比星对照。白杨素对CDK1、磷酸化pCDK1和pCDK2、CDC25A、CDC25B和CD133均无明显影响,但可剂量依赖性诱导PARP-1降解。总之,白杨素对BEL-7402细胞的抑制作用并非起因于PI3K-AKT和Wnt/β-catenin通路阻断或细胞周期核心调控因子阻断,而更可能起因于生物膜功能障碍所致细胞表面超微结构和蛋白质磷酸化的大范围改变,并以非经典方式诱导肝癌细胞死亡。     

重组TRAIL抑制7402肝癌细胞生长的实验研究

目的　重组TRAIL对BALB/c裸鼠肝癌细胞皮下移植模型的抑瘤作用。方法　建立裸鼠 740 2肝癌细胞皮下移植瘤模型 ,纯化后的质粒DNA与PEI混合后经肌肉注射进行基因转染 ,体内验证重组蛋白的抑瘤活性 ,采用原位缺如末端标记 (TUNEL)法 ,进行肿瘤组织凋亡检测。结果　肿瘤体积测定显示TRAIL对肝癌生长有明显抑制作用 ,凋亡检测表明实验组镜下有蓝紫色凋亡细胞。结论　荷瘤小鼠经肌肉注射TRAIL质粒DNA后 ,能引起肿瘤细胞的凋亡 ,有效抑制 740 2肝癌细胞在裸鼠体内的生长。     

瑞芬太尼抑制人肝癌细胞Notch信号通路及细胞生长的研究

目的 探讨瑞芬太尼对肝癌细胞增殖、周期和凋亡及其相关Notch信号通路的影响。方法 通过体外培养肝癌细胞HepG2,采取不同浓度(0、5、50、500 ng/mL)的瑞芬太尼处理细胞,并设为瑞芬太尼各剂量组。采用500 ng/mL瑞芬太尼和20μmol/L Notch通路抑制剂DAPT处理细胞,分别设为瑞芬太尼组、瑞芬太尼+DAPT组。采用CCK8检测细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Western blot检测p27、Cyclin D1、Bax、cleaved cas-3和Notch通路相关蛋白的表达。结果 0、5、50、500 ng/mL的瑞芬太尼均可以降低肝癌细胞的450 nm处的光密度值(OD_{450 nm}值)、S期细胞比率,增加G₀/G₁期细胞比率、细胞凋亡率,上调p27、Bax、cleaved cas-3蛋白表达,下调Cyclin D1、Notch1、Hes1蛋白表达,并呈浓度依赖性。瑞芬太尼+DAPT组的OD_{450 nm}值、S期细胞比率、Cyclin D1蛋白表达低于瑞芬太尼组,...     

复方丹参药物血清对人BEL-7402细胞的抑制作用

目的:丹参提取物可诱导肿瘤细胞分化和凋亡,观察复方丹参药物血清对人BEL-7402细胞增殖的影响。方法:实验于2003-06/2004-04在甘肃省医学科学研究院药理毒理学实验室完成。药物:复方丹参药物血清。细胞系:人BEL-7402细胞系。采用流式细胞仪、噻唑蓝法和克隆形成法对复方丹参药物血清抗肿瘤细胞作用进行分析。分别给予3.6,7.2和15g/kg体质量药物血清48h,用噻唑蓝法测定其对人BEL-7402细胞的抑制率、克隆形成抑制率、凋亡率。结果:①分别给予3.6,7.2和15g/kg体质量药物血清后,对人BEL-7402细胞的抑制率为26.4%,35.6%,51.7%。②分别给予3.6,7.2和15g/kg体质量药物血清后,克隆形成抑制率为42.8%,47.9%,74.8%。③分别给予3.6,7.2和15g/kg体质量药物血清后,凋亡率为18.6%,22.4%,28.8%。结论:复方丹参药物血清对人BEL-7402细胞增殖具有明显的抑制作用。     

黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响研究

目的研究黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响,为临床肝癌的治疗提供科学的参照。方法选取人的SMMC-7721型肝癌细胞,分别在加入500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.25μM、0μM黄连素的培养液中进行体外培养。于0 h、24 h、48 h、72 h时使用MTT方法对细胞活性进行测定,基于统计学处理方法,分析黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响作用。结果黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞的生长具有显著的抑制作用,且随着作用时间和作用浓度的增加抑制作用呈上升趋势,但黄连素不会影响SMMC-7721人肝癌细胞的复制增殖周期。结论黄连素对能够显著抑制SMMC-7721人肝癌细胞的生长,并诱导细胞的凋亡,作用程度与作用时间和浓度呈正相关,但对细胞的增殖周期没有影响。     

低氧对化疗药物诱导的肝癌细胞凋亡的影响

目的：分析低氧条件对肝癌细胞化疗敏感性的变化,从细胞水平研究低氧环境对化疗药物诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法：测定不同浓度化疗药物（CDDP、EPI、GEM、MMC）对细胞死亡率的影响及IC50值,对人肝癌细胞SMMC-7721化疗药物处理,经过常氧及低氧不同环境培养下,分析肝癌细胞死亡率以及凋亡情况。结果：实验结果显示,化疗药物作用浓度与细胞死亡率正相关;低氧培养条件下化疗药物引起的细胞死亡率明显低于常氧培养组,两组有显著差异（P〈0.05）;低氧环境下化疗药物诱导的SMMC-7721细胞凋亡率明显降低（P〈0.05）。结论：低氧环境下肝癌细胞对化疗药物的不敏感与低氧引起肝癌细胞凋亡能力下调有关。     

莲房原花青素对人肝癌细胞HepG2生长及凋亡的作用

目的：通过莲房原花青素（LSPC）抑制人肝癌细胞HepG2的生长及诱导其凋亡探讨原花青素抗肿瘤作用的分子机制。方法：以四甲基噻唑蓝(MTT)来分析不同浓度LSPC对人肝癌细胞HepG2的存活率的影响；用流式细胞术(FCM)分析细胞周期和细胞凋亡；通过RT-PCR分析LSPC引起的生长抑制、DNA损伤基因GADD45β、GADD153、GADD34表达水平的变化。结果：原花青素可诱导HepG2细胞凋亡，药物组的生长明显受到抑制（P<0.05），且还呈浓度依赖性。生长抑制损伤基因GADD45β、GADD153、GADD34表达水平随着LSPC浓度增加表达量也增加。结论：原花青素可抑制人肝癌细胞HepG2凋亡，具有抗肿瘤的药理作用。     

5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素对体外培养人卵巢癌细胞作用的初步探讨

目的 探讨5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素（ADFMChR）对体外培养人卵巢癌细胞系COCl细胞的作用。方法 体外培养中国仓鼠正常卵巢上皮细胞系（CHO-K1）、人卵巢癌细胞系（COCl），每种细胞实验组中分别加入不同浓度ADFM-ChR，对照组加入等量PBS。采用改良MTT比色法分别检测ADFMChR作用CHO-K1、COCl不同时间后的细胞增殖抑制率，用流式细胞仪分析法分别检测CHO-K1、COCl细胞的细胞周期分布度凋亡率。结果 ADFMChR对COCl细胞的增殖具有抑制作用，呈剂量依赖性和时间依赖性，对CHO-K1细胞的增殖抑制作用弱，差异有显著性（P〈0．01）。ADFMChR作用于COCl细胞后细胞周期分布及凋亡率与CHO-K1细胞比较，G0/G1期细胞明显增多，且G1期细胞前出现明显的亚G1凋亡峰。结论 ADFMChR对卵巢癌细胞系COCl的增殖具有明显的抑制作用，呈剂量-效应关系和时间-效应关系。     

和厚朴酚对人结肠癌细胞及Wnt信号通路的影响及调控作用

目的探讨和厚朴酚(HNK)对人结肠癌细胞及Wnt信号通路的影响和调控作用。方法采用结晶紫染色法和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达检测HNK对人结肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用;利用流式细胞仪和Caspase-3蛋白表达观察HNK对人结肠癌LoVo细胞凋亡的影响;利用荧光素酶报告质粒检测HNK对Wnt信号通路中β-catenin/Tcf4转录活性的影响;蛋白的表达采用Western blot检测。结果 HNK剂量依赖性地抑制细胞增殖(P0.05),并诱导细胞凋亡。荧光素酶报告质粒检测结果显示,HNK在10.0μmol/L时就能明显降低LoVo细胞中β-catenin/Tcf4转录活性(P0.05)。结论 HNK能抑制人结肠癌细胞增殖,诱导其凋亡,该作用可能与HNK抑制Wnt信号通路的转导有关。     

扫描电镜显示人胎肝和肝癌细胞表面微绒毛样突起与胞外膜粒及隧道纳米管的关系

背景:肝脏来源的胞外膜粒可介导细胞间通讯、调控肝细胞的增殖与分化,在肝病诊断、肝癌防治、肝脏再生和细胞移植等技术的研究应用中均有重要价值.但由于对膜粒的发生和类型归属缺乏认识,制约了该领域的进展.隧道纳米管是介导细胞间通讯的另一新发现的结构,是否存在于肘细胞间尚无报道.目的:通过对比人正常胎肝细胞和肝癌细胞表面超微结构的特点,寻找两种细胞的差异,揭示胞外膜粒的生物发生过程,判断其类型归属,明确隧道纳米管是否存在.方法:用扫描电镜观察处于增殖周期中的贴壁培养胎肝L02和肝癌BEL-7402细胞样品,分析其细胞表面超微结构的共性和差异.结果与结论:首次显示人胎肝L02和肝癌BEL-7402细胞表面均具有大量微绒毛样突起,其特征与静止期细胞的典型微绒毛有显著差异.L02细胞上微绒毛样突起的平均长度和密度均超过BEL-7402细胞,可作为区分两种细胞的指标.两种细胞上的微绒毛样突起均既可产生纳米膜粒,又可转化为隧道纳米管.纳米膜粒的产生方式有出芽和串珠样缢缩两种类型.总之,高分辨率扫描电镜图像可作为鉴定肝脏来源细胞表面超微结构特征和胞外膜粒来源的金标准.     

外源性PDGF-DD蛋白对肝癌细胞株BEL-7402的体外作用

目的:探讨外源性PDGF-DD蛋白对PDGF-D和β-PDGFR阳性表达的人肝癌细胞株BEL-7402增殖和转移相关基因VEGF及CXCR4表达的影响.方法:浓度为0 ～ 100 pg/mL PDGF-DD蛋白作用于肝癌细胞株BEL-7402 48 h,MTT检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期;RT-PCR检测VEGF mRNA和CXCR4 mRNA表达.结果:外源性PDGF-DD蛋白干预细胞后,可促进细胞增殖,且在0 ～ 100 pg/mL范围内呈剂量依赖性;周期分布显示G0/G1期细胞比例下降,S期细胞比例增多;且上调VEGF mRNA和CXCR4 mRNA的表达.结论:外源性PDGF-DD能促进BEL-7402细胞增殖,上调VEGF、CXCR4 mRNA的表达.提示PDGF-D及其信号传导系统在肝癌的发生、发展及转移中可能发挥重要的作用,可作为肝癌预后预测指标和治疗靶点.     

小柴胡汤逆转人肝癌细胞BEL-7402／5-FU 的多药耐药作用

目的:研究小柴胡汤对BEL-7402/5-FU细胞多药耐药的逆转作用,并初步探讨其作用机制。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同化疗药物以及小柴胡汤对BEL-7402/5-FU细胞的半数抑制浓度(IC50),计算耐药指数和小柴胡汤的逆转倍数;流式细胞仪检测细胞内阿霉素的荧光强度;RT-PCR检测mdr1基因表达;western blot检测p-gp蛋白表达。结果:BEL-7402/5-FU耐药株对5-FU和阿霉素顺铂均具有耐药性,耐药指数分别是6 501.99和31.73;0.5 mg/ml小柴胡汤和5-FU、阿霉素联合应用,其逆转倍数分别是1.66、1.50;1.0 mg/ml小柴胡汤和5-FU、阿霉素联合应用,其逆转倍数分别是3.44、5.58;小柴胡汤增强阿霉素的荧光强度;小柴胡汤降低mdr1基因表达和p-gp蛋白表达,各个浓度均具有统计学意义。结论:小柴胡汤可以抑制mdr1基因编码蛋白产物p-gp的表达,增加细胞内化疗药物的浓度,从而逆转了肝癌细胞的多药耐药性。     

健脾化瘀复方中药血清影响人肝癌BEL7402细胞增殖的作用

目的：观察健脾化瘀中药复方对人肝癌BEL7402细胞增殖的抑制作用，并与已知阳性药物5-氟尿嘧啶进行比较。 方法：实验于2005—03／06在中山大学动物实验中心完成。①服药前及含药血清获得：健康志愿者1名（了解实验目的并签订知情同意书）空腹12h后按0．83，1．67，2．5mL／kg剂量口服健脾化瘀复方960合剂（由莪术、白术、苦参、白花蛇舌草等组成；广州市中医院提供；先将莪术、白术剪碎后用净水浸泡30min，提取挥发油和芳香成分，其渣再与用净水浸泡30min的苦参、白花蛇舌草等水煎提取水溶性成分，各种有效成分混匀制成口服液，每毫升相当于生药1．0g），分别于服药前、服药后1h抽取外周血液，得到服药前和含有健脾化瘀复方有效作用成分的含药血清。②观察服药前血清与小牛血清对BELT402细胞的作用：分别将服药前血清和小牛血清（购于四季青公司）加入RPMI-1640培养液，血清终浓度50，100和200g／L。⑧观察药物血清对BEL7402细胞的作用：将人肝癌细胞BEL7402（引自中山大学动物实验中心）随机分为7组（每组细胞接种lO孔）：对照组（服药前血清加入RPMI—1640培养液，血清终浓度100g／L），5-氟尿嘧啶组[用含100g／L服药前人血清的RPMI-1640培养液配制，5-氟尿嘧啶（上海旭东海普药业有限公司，批号050106，规格10mL／支）终质量浓度为0．3，0．6，0．9mg／L1和健脾化瘀复方组（将按0．83，1．67和2．50mL／kg剂量服药后人血清加入RPMI-1640培养液，血清终浓度100g／L）。④人肝癌细胞增殖能力检测：用四甲基偶氮唑盐比色法检测人肝癌细胞增殖能力，以吸光度似值）表示。计量细胞增殖抑制率[（观察组A值-对照组A值）／观察组A值]。 结果：①相同质量浓度服药前血清与小牛血清对BEL7402细胞增殖能力影响比较，差异不明显（P〉0．05）。200g／L服药前血清和小牛血清促进BEL7402细胞增殖能力最强，明显强于50g／L时（P〈0．01）。②0．3，0．6，0．9mg／L5-氟尿嘧啶药物血清和1．67，2．50mL／kg健脾化瘀复方药物血清抑制人肝癌细胞增殖的能力和抑制率明显高于对照组（P〈0．05～0．01），且药物血清浓度越高，对癌细胞增殖能力的抑制作用越强。1．67mL／kg健脾化瘀中药复方血清对人肝癌细胞增殖能力的抑制率与0．3mg／L5-氟尿嘧啶药物血清相近（30．0％，35．9％，P〉0．05）。 结论：①服药前人血清与小牛血清一样具有促进BEL7402细胞增殖的作用。②健脾化瘀中药复方具有抑制BEL7402细胞增殖作用，且呈剂量依赖性，其中中剂量（1．67mL/kg）含药血清对人肝癌细胞增殖抑制作用与小剂量（0．3mg／L）5-氟尿嘧啶相近。     

健脾化瘀复方中药血清影响人肝癌BEL7402细胞增殖的作用

目的:观察健脾化瘀中药复方对人肝癌BEL7402细胞增殖的抑制作用,并与已知阳性药物5-氟尿嘧啶进行比较。方法:实验于2005-03/06在中山大学动物实验中心完成。①服药前及含药血清获得:健康志愿者1名(了解实验目的并签订知情同意书)空腹12h后按0.83,1.67,2.5mL/kg剂量口服健脾化瘀复方960合剂(由莪术、白术、苦参、白花蛇舌草等组成;广州市中医院提供;先将莪术、白术剪碎后用净水浸泡30min,提取挥发油和芳香成分,其渣再与用净水浸泡30min的苦参、白花蛇舌草等水煎提取水溶性成分,各种有效成分混匀制成口服液,每毫升相当于生药1.0g),分别于服药前、服药后1h抽取外周血液,得到服药前和含有健脾化瘀复方有效作用成分的含药血清。②观察服药前血清与小牛血清对BEL7402细胞的作用:分别将服药前血清和小牛血清(购于四季青公司)加入RPMI-1640培养液,血清终浓度50,100和200g/L。③观察药物血清对BEL7402细胞的作用:将人肝癌细胞BEL7402(引自中山大学动物实验中心)随机分为7组(每组细胞接种10孔):对照组(服药前血清加入RPMI-1640培养液,血清终浓度100g/L),5-氟尿嘧啶组[用含100g/L服药前人血清的RPMI-1640培养液配制,5-氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司,批号050106,规格10mL/支)终质量浓度为0.3,0.6,0.9mg/L]和健脾化瘀复方组(将按0.83,1.67和2.50mL/kg剂量服药后人血清加入RPMI-1640培养液,血清终浓度100g/L)。④人肝癌细胞增殖能力检测:用四甲基偶氮唑盐比色法检测人肝癌细胞增殖能力,以吸光度(A值)表示。计量细胞增殖抑制率[(观察组A值-对照组A值)/观察组A值]。结果:①相同质量浓度服药前血清与小牛血清对BEL7402细胞增殖能力影响比较,差异不明显(P>0.05)。200g/L服药前血清和小牛血清促进BEL7402细胞增殖能力最强,明显强于50g/L时(P<0.01)。②0.3,0.6,0.9mg/L5-氟尿嘧啶药物血清和1.67,2.50mL/kg健脾化瘀复方药物血清抑制人肝癌细胞增殖的能力和抑制率明显高于对照组(P<0.05～0.01),且药物血清浓度越高,对癌细胞增殖能力的抑制作用越强。1.67mL/kg健脾化瘀中药复方血清对人肝癌细胞增殖能力的抑制率与0.3mg/L5-氟尿嘧啶药物血清相近(30.0%,35.9%,P>0.05)。结论:①服药前人血清与小牛血清一样具有促进BEL7402细胞增殖的作用。②健脾化瘀中药复方具有抑制BEL7402细胞增殖作用,且呈剂量依赖性,其中中剂量(1.67mL/kg)含药血清对人肝癌细胞增殖抑制作用与小剂量(0.3mg/L)5-氟尿嘧啶相近。     

热化疗逆转人肝癌细胞系BEL-7402/ADM多药耐药性的实验研究

目的　研究热化疗对多药耐药人肝癌细胞系BEL- 74 0 2 /ADM耐药性的影响并探讨相关的机制。方法　通过MTT法测定热化疗对多药耐药人肝癌细胞系BEL -74 0 2 /ADM耐药性影响;利用流式细胞仪检测多药耐药相关基因(MDR)的表达产物P糖蛋白(P- gp)、多药耐药相关蛋白(MRR)、谷胱甘肽转移酶(GSH/GST)的表达。结果　热化疗使多药耐药人肝癌细胞系BEL- 74 0 2 /ADM耐药性降低;P -gp、MRP和GSH/GST的表达均有所下降。结论　热化疗具有逆转多药耐药人肝癌细胞系BEL -74 0 2 /ADM耐药性的作用,可能与多药耐药相关基因表达水平下调有关。     

猫儿眼植物酸对人BEL-7402细胞抑制作用的实验研究

目的:分离提取猫儿眼植物酸并探讨其对人BEL-7402细胞抑制作用机制。方法:采用流式细胞仪、噻唑蓝(简称MTT)法和锥虫蓝染色法对猫儿眼植物酸抗肿瘤细胞作用进行分析。结果:MTT法显示,给予0.1,1.0和10.0mg/L猫儿眼植物酸48h,其对人BEL-7402细胞的抑制率分别为52%,54%和57%;锥虫蓝染色法显示,给药后48h,猫儿眼植物酸对细胞生长抑制率分别为72%,81%和84%;凋亡率分别为24%,26%和33%。结论:猫儿眼植物酸对人BEL-7402细胞生长具有显著的抑制作用,其效果随给药浓度的增加和作用时间的延长而递增。     

复方丹参药物血清对人BEL-7402细胞的抑制作用

目的：丹参提取物可诱导肿瘤细胞分化和凋亡，观察复方丹参药物血清对人BEL-7402细胞增殖的影响。方法：实验于2003-06／2004-04在甘肃省医学科学研究院药理毒理学实验室完成。药物：复方丹参药物血清。细胞系：人BEL-7402细胞系。采用流式细胞仪、噻唑蓝法和克隆形成法对复方丹参药物血清抗肿瘤细胞作用进行分析。分别给予3．6，7．2和15g／kg体质量药物血清48h，用噻唑蓝法测定其对人BEL-7402细胞的抑制率、克隆形成抑制率、凋亡率。结果：（1）分别给予3．6，7．2和15g／kg体质量药物血清后，对人BEL-7402细胞的抑制率为26．4％，35．6％，51．7％。②分别给予3．6,7．2和15g／kg体质量药物血清后，克隆形成抑制率为42．8％，47．9％，74．8％。③分别给予3．6，7．2和15g／kg体质量药物血清后，凋亡率为18．6％，22．4％，28．8％。结论：复方丹参药物血清对人BEL-7402细胞增殖具有明显的抑制作用。     

RNA干扰抑制人肝癌细胞N-ras基因表达的研究

目的研究RNA干扰(RNAi)对BEL7402细胞的N-ras基因表达的干扰效应。方法建立装载靶向N-ras基因小干扰性RNA(siRNA)的表达载体;用脂质体法将此表达载体转染BEL7402细胞株,以转染空载细胞作为对照;采用RT-PCR和Western blot检测N-ras基因的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果转染siRNA的表达载体可以抑制内源N-ras基因在转录和转译上的表达。N-ras基因的表达抑制与BEL7402细胞的凋亡相关联。结论转染siR-NA的表达载体可明显抑制肝癌细胞株BEL7402N-ras基因的表达,并伴有细胞的凋亡。其工作的开展将为RNAi治疗、肝癌N-ras基因功能研究、新药开发提供研究基础。