几种固定化苯丙氨酸解氨酶方法的比较

目的：对不同方法固定化苯丙氨酸解氨酶（PAL）的偶联率或包被率以及固定化对PAL活性和稳定性的影响进行比较,以期得到较为方便、有效的固定化PAL。方法：（1）采用不同T：C比例的聚丙烯酰胺凝胶（PAG）包埋PAL;（2）分别用戊二醛和碘化－I－[环己基－3－（3－二甲氨丙基）]碳二亚胺（CDC）将PAL固定于Bio-Gel P-300;（3）分别用超声法、脱水再加水法、复乳法将PAL包被于三种脂类组成不同的质脂体;（4）对诱变选育出的含PAL活性酵母细胞进行丙酮处理。结论：（1）包埋法采用T：C比为8：30时固定化酶活性明显高于PAL活性酵母细胞进行丙酮处理。结论：（1）包埋法采用T：C法为8：30时固定化酶活性明显高于T：C比为8：19,两活性保留率分别为50．6％和17．1％;（2）载体偶联法以戊二醛将PAL固定于Bio-Gel P300优于用DCD固定化的酶,两活性保留率分别为27．2％和13．9％;（3）质脂体包被中以脱水再加水法对酶活性影响较小,脂类组成以磷脂酰胆碱;胆固醇：磷脂酰丝氨酸比值7：21：1最好;（4）固定化PAL活性酵母细胞能较好地抵抗人工肠液中胰蛋白酶的水解作用,亦能明显降低苯丙氨酸的浓度。     

苯丙氨酸解氨酶固定化的初步研究

本文报道制备固定化苯丙氨酸解氨酶(PAL)的初步结果。采用包埋和共价结合两种方法将PAL固定化。结果表明前者的偶联率高于后者。冷冻干燥,4°下贮存6个月后,活性存留分别为89％和76％,说明固定化后稳定性良好。包埋法采用不同T/C比(T为凝胶总浓度;C为交联百分比)的聚丙烯酰胺凝胶(PAG)包埋,结果证明按T/C比为3:30时固定化的酶活性明显高于T/C比为8:19者,二者的相对活性分别为58％和6％。用戊二醛将PAL固定于Bio—Gel P—300上的酶活性高于用碘化—1—[环已基—3—(3—二甲氨丙基)]碳二亚胺(CDC)固定化的酶,相对活性分别为63％和18％。     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的 对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法 应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因。结果 所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Genbank登录号为EF567076。序列分析表明,AmPAL全长为2 650 bp,含有一个完整的2 154 bp开放读码框。AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×104,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%。结论 首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。     

基因工程苯丙氨酸解氨酶对多发性骨髓瘤U266细胞的作用研究

目的 为寻找对多发性骨髓瘤新的治疗方法 ,从基因工程乳酸乳球菌提纯苯丙氨酸解氨酶(PAL),探讨PAL酶对多发性骨髓瘤U266细胞系的影响作用.方法 利用已构建成功的高表达PAL的基因工程乳酸乳球菌,结合物理、化学、生物学等方法 ,设计一种简便、高效提纯PAL酶的方法.培养人多发性骨髓瘤U266细胞系,在不同浓度基因工程PAL酶作用后.以MTT法检测细胞增生;流式细胞仪检测细胞凋亡;HPLC检测细胞培养液中苯丙氨酸(phe)浓度.结果 ①用本研究所设计方法 从基因工程乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-palart中提取的PAL酶比活性可达同量原菌的92.5%;②0.1～2.0U/ml的PAL提取液作用24h后能显著抑制U266细胞生长,并呈剂量依赖性;③只添加提取过程所用试剂的对照组细胞生长无明显抑制;④0.1U/ml、0.2U/ml、2.0 U/ml的PAL酶作用24h后的MM细胞早期凋亡率分别为(21.92±0.95)%、(50.64±0.86)%、(90.86±2.91)%;⑤PAL酶作用24h后细胞培养液中phe浓度随PAL酶活性增加而降低.结论 本研究所设计方法 可从基因工程乳酸菌高效提取PAL酶;提取过程中的添加试剂对MM细胞生长无明显抑制作用;PAL酶能显著抑制MM细胞体外生长,诱导细胞早期凋亡;PAL酶可降低培养液中的phe水平,且phe浓度与MM细胞生长的抑制作用具有相关性.     

深红酵母菌苯丙氨酸解氨酶的诱导及纯化

经Ｌ－苯丙氨酸诱导在深红酵母产生高于非诱导培养时６倍的苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）活性，并加以分离纯化，纯化９２．９倍，产率８．９８％。纯化过程中采用不同的亲和洗脱方式，结果表明：在Ｌ－苯丙氨酸－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ进行ＰＡＬ的亲和层析时，用５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．８Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液平衡上柱后以Ｄ－苯丙氨酸洗脱为好。     

基因工程菌CTB2的固定化及其制备L—苯丙氨酸的研究

对以卡拉胶为载体固定化基因工程菌ＣＴＢ２制备Ｌ－苯丙氨酸进行了研究。比较了固定化细胞的最适温度和最适ＰＨ,考察了该固定化细胞的柱以应特性以及产物Ｌ－苯丙氨酸的分离方法。结果表明,固定化细胞的最适温度为３０℃,最ＰＨ为７．０,柱反应最佳空时速度ＳＶ＝０．１９ｈ＾－１底转化率为２０％,固定化酶半衰期大于３０ｄ。     

银杏苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因克隆

目的通过克隆银杏苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因并深入研究其结构,利用生物技术改良叶用银杏品质.方法利用PAL氨基酸序列中的保守区设计的简并引物,应用PCR等分子克隆技术,首次成功地从银杏基因组中克隆出了PAL基因片断.结果及结论 PAL基因长度为1140bp,所得序列已登录在NCBI的GenBank中,核酸序列和推测的氨基酸序列的Accession分别为AY231176和AAO73468.     

苯丙氨酸脱氨酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

目的 筛选一株苯丙氨酸脱氨酶高产菌株.方法 从肥沃菜园土样中分离得一株苯丙氨酸脱氨酶产生菌,通过形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析,对菌株进行鉴定,并对其酶学性质初步研究.结果 初步鉴定该菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus Cereus),所产苯丙氨酸脱氨酶的最适反应pH5.8,最适反应温度40℃,60℃以下热稳定性较好,此条件下酶活达1 218 U/mg细胞.结论 所获得的蜡样芽孢杆菌NJU110具有一定的苯丙氨酸脱氨酶生产能力,并为该菌株的菌种改良及高效基因工程菌的构建奠定了基础.     

斑点-ELISA检测AFP

目的 探讨硝酸纤维素膜为固相载体的酶免疫测定法检测甲胎蛋白(AFP).方法 以硝酸纤维素膜代替常规ELISA中的固相载体聚苯乙烯板,其余步骤按ELISA方法操作.结果 以AFP标准品作试验,进行方法学探索,测出最佳包被抗体浓度为100 mg.L-1,酶标抗体稀释度为1∶4 000.不同来源不同孔径的硝酸纤维素膜无差异;同时发现包被过程中的封闭处理能减少非特异性反应;保存试验证明包被抗体的硝酸纤维素膜至少可保存2周.结论 该法具有特异性强、重复性好、灵敏度高的特点,通过与常规ELISA检测血清标本AFP含量值的比较,表明该法可半定量测定AFP的含量,尤其适用于标本的初步筛选.     

季铵盐CTMB—正辛醇——氯仿有机液膜传输苯丙氨酸

以季铵盐ＣＴＭＢ为流动载体，考察了有机液膜对苯丙氨酸的舆行为。实验结果表明，苯丙氨酸的传输速率随载体、添加剂及水相组份浓度的变化而不同，并给出了该体系传输苯丙氨酸的适宜条件。     

苯丙氨酸及其衍生物对未成熟神经元胞质游离钙的影响

目的:探讨苯丙酮尿症患者脑损伤的病理生理机制,分析苯丙氨酸和胞质游离钙有无关系.方法:用钙成像技术检测氨基酸及其衍生物对胚鼠皮层未成熟神经元胞质游离钙浓度的影响.结果:高浓度苯丙氨酸降低胞质游离钙,苯乙酸使胞质内钙浓度降低后升高最后又降低,苯乳酸使胞质内钙降低更明显.使用无钙离子无钠离子的细胞外液,苯乳酸降低胞质内钙的作用无明显影响;使用Thapsigargin阻断内质网上钙泵,苯乙酸虽仍能降低胞质内钙,但没有降低后又升高的现象.当苯丙氨酸、苯乙酸和苯乳酸相同浓度时,苯乙酸、苯乳酸较苯丙氨酸的作用更强.结论:结合我们以前的观察结果,苯丙氨酸可能激活plasma membrane Ca2 -ATPase,促进神经元胞质内钙外排,进而导致神经元胞质内钙浓度降低.     

癫痫患者血浆及红细胞中抗氧化剂水平的测定

目的：探讨癫痫疾病状态下血浆及红细胞（RBC）中抗氧化剂水平的变化。方法：测定39例正常对照组、32例癫痫疾病组和26例癫痫治疗组的RBC内谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)、红细胞膜过氧化脂质代谢产物丙二醛（MDA）、红细胞溶血百分率以及血浆中铜蓝蛋白（CER）、维生素A,C,E(VitA、VitC、VitE)等。结果：疾病组的红细胞MDA,溶血百分率,GSH-Px,CAT及血浆CER显著高于对照组（P<0.05），红细胞GR、SOD和血浆VitA，VitC，VitE显著低于对照组（P<0.05,其中红细胞GR，血浆维生素C,P<0.01）；治疗组的红细胞GR,SOD，血浆VitC,VitE均显著高于疾病组(P<0.05,其中GR,P<0.01)。结论：提示采取抗氧化保护措施对患者的治疗有重要意义。     

四氢生物蝶呤不同反应性的苯丙氨酸羟化酶缺乏症的临床分析

目的：探讨四氢生物蝶呤（BH4）不同反应性苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏症的临床表现型特点。方法：37例PAH缺乏症患者均经尿蝶呤谱分析和红细胞二氢蝶啶还原酶（DHPR）测定排除BH4缺乏症后确诊。根据BH4负荷试验结果诊断BH4反应性PAH缺乏症13例和BH4无反应性PAH缺乏症24例；全部患者治疗前行脑电图检查并采用Gesell发育量表对其进行智力测定。随诊低苯丙氨酸（Phe）饮食治疗的Phe耐受量。结果，BHd反应性PAH缺乏症患者初诊血Phe浓度652．5±236．8μmol／L，为轻、中度高苯丙氨酸血症；BH4反应性PAH缺乏症患者发育商（DQ）显著高于BH。无反应性PAH缺乏症（P〈0．01），脑电图异常率显著低于BH4无反应性PAH缺乏症（P〈0．01）。两者的Phe耐受量亦有不同。结论：BHd不同反应性PAH缺乏症的生化代谢表型组成、DQ、神绎系统受累稗度和Phe耐蛋量方面均存在差异．     

串联质谱检测苯丙氨酸浓度在筛选新生儿苯丙酮尿症中的应用

探讨串联质谱法(MS/MS)在检测苯丙氨酸浓度在诊断新生儿遗传代谢性疾病——苯丙酮尿症中的临床应用价值。利用MS/MS分析了9000 例新出生婴儿全血标本中苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)的浓度,计算两者的比值。MS/MS分析的Phe的线性范围为25.3~898.5 mol/L, Phe的平均回收率为97.8%, 批内变异系数(CV)为3.85%,批间变异系数CV为4.53%;Tyr的线性范围为39.60~260.07 mol/L, Tyr的平均回收率为96.5%,批内变异系数(CV)为4.25%,批间变异系数CV为5.83%。MS/MS法能够比较灵敏,特异的检测血中 Phe和Tyr的浓度,可以满足对新生儿苯丙酮尿症的筛查及诊断的需要,具有极高的临床应用价值。     

苯丙氨酸羟化酶基因突变分析及与临床严重度相关性的研究

目的:检测苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变谱,探讨其突变率与临床严重度的相关性.方法:53例PKU患者根据其治疗前的血苯丙氨酸浓度进行临床分型,同时提取其基因组DNA,PCR扩增PAH基因外显子3、5、6、7、10、11和12,用单链构像多态分析、变性高效液相层析(DHPLC)和直接测序3种方法筛查PAH基因突变.用Kendall等级相关分析临床严重度和突变基因型的相关性.结果:4种突变(R176X、E280K、L367R和S349A)在中国PKU人群中未见报道,其中2种突变(L367R和S349A)为国际首次报道.基因型和临床严重度之间具有较好的相关性(r=0.696,P＜0.01).结论:新发现的PKU患者的4种基因新突变,丰富了PKU患者PAH基因突变谱.基因型和临床严重度间较好的相关性为临床上PKU的基因诊断提供了重要的理论依据.DHPLC法是一种快速、准确、经济的筛选PAH基因突变的新方法.     

苯丙氨酸对慢性缺氧性肺动脉高压大鼠的保护作用

目的:探讨苯丙氨酸(PHE)对慢性缺氧所致的肺动脉高压的影响及其可能机制.方法:28只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(n=9)、缺氧组(n=10)、缺氧 PHE组(n=9).缺氧组与缺氧 PHE组每d给予缺氧处理.缺氧 PHE组每d于缺氧前腹腔注射PHE 400 mg/(kg·d),对照组与缺氧组腹腔注射等量生理盐水,共21 d.采用右心导管法测定右心室平均压(pMRV)及肺动脉平均压(pMPA),同时用多导生理记录仪测定心率和血压.测定右心室(RV)质量/(左心室(LV)质量 室间隔(S)质量)(mRV/(mLV ms))比值,并观测肺血管形态结构的变化和各组血清血管内皮生长因子(VEGF)的变化.结果:缺氧组的pMRV、pMPA、(mRV/(mLV mS)明显高于对照组(P＜0.01)与缺氧 PHE组(P＜0.05);缺氧组的肺细小动脉管壁厚度、管壁横截面积、管壁厚度占血管外径的百分比及管壁横截面积占血管横截面积的百分比均明显高于对照组与缺氧 PHE组(P＜0.01).缺氧 PHE组大鼠血清VEGF水平明显低于缺氧组(P＜0.01),但仍高于对照组(P＜0.05).结论:PHE可能是通过降低VEGF的表达而降低慢性缺氧大鼠的右心室压及肺动脉高压,逆转右心室肥厚及血管结构的重建.     

Antihypertension and anti-cardiovascular remodeling by phenylalanine in spont aneously hypertensive rats: effectiveness and mechanisms

Objective To investigate mechanisms of anti-hypertensi on and anti-cardiovascular remodeling by phenylalanine (phe) in spontaneously h ypertensive rats (SHRs).Methods The comparison of blood pressure (BP) increment with the ages and cardiovascular changes of SHRs was made between the 3% phe-intervented group (SHR-phe) and t he control SHRs group. Detection of the structural changes with the VID AS digital vedio-fre quency processing technique and light and electron microscopy were made. The ce ll growth and proliferation of cultured smooth muscle cells (CSMCs) of the thora cic aortas or myocardial fibroblasts were evaluated by measuring the (3)H -th ymidine counts per minute (cpm) incorporated into the new synthesized desoxyribo nucleic acid (DNA) and determining the cell number with the crystal violet stain technique. The Ca((2+)) influx was measured in counts/min of (45)CaCl(2) after incubating it with 5 different concentrations of phen ylalanine and the intracellular ［Ca((2+))］(i) by Fura-Ⅱ/Am indicator. The total messenger ribonucleic acid (mRNA) of the myocardium was extracted and Northern blot analysis was performed with the probe collagen α(2)(Ⅰ)cDNA . The tyrosine hydroxylase (TH) activity was measured by high -performance liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detector after h aving reacted with its substrate tyrosine and other reagents. The catecholamine contents in brain homogenat were detected by HPLC method. The comparison of p harmacokinetics of phenylalanine among SHR-phe, SHRs and control Wistar Kyoto (WKY) rats was made after intravenous injection of (3)H-L-phe (1 ml/k g) by PK-GRAPH Program for kinetic calculation. The (3)H-L-pheuptake by CSMCs after incubating for difinite intervals was also detected and compa red. Results Phenylalanine could prevent the increase of BP with ages and the heart weight (h eart/body weight index). The aortic media thickness and the collagen content in the myocardium were decreased significantly in SHR-phe. Whereas the dearrange d cardiovascular structure was much improved. The mechanisms might be direct and specific inhibition of the DNA synthesis and proliferation of cardiovascular cells which may be related to the inhib ition of collagen α(2)(Ⅰ)cDNA, c-fos and c-myc expression. Other mechan isms may include decrease of intracellular ［Ca((2+))］(i) and an inhibition of central sympathetic activity due to the results of higher TH activity in the caudate nucleus and higher adrenaline conte nt in the posterior hypothalamus. Besides, partial recovery of p henylalanine metabolic aberrants existed in SHRs seems to be another possibility for its effectiveness. Conclusions Phenylalanine intervention could exert a definite anti-hypertension and anti-c ardiovascular remodeling effects on SHRs like seen in human essential hypertensi on. Its mechanisms might be related to direct inhibition of growth in the cardi ovascular cells, decrease of central sympathetic activity, the reverse of the exhibited phenylalanine metabolic aberrants in SHRs, and a decrement of intracellu lar ［Ca((2+))］］(i).     

中国人苯丙氨酸羟化酶基因的10种新突变

目的 研究中国人苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变的分子基础。方法 应用PCR／SSCP、序列分析等技术,分析中国北方地区120个经典型苯酮尿症(PKU)核心家系,对PAH基因外显子3、5、7、10、11、12进行突变基因的筛查和确定。结果 在确定的31种突变中(另文报道)有10种突变首次在中国PKU人群中发现：165T、S70del、G239D、R241fsdelG、L255S、P281L、G346R、L367fsinsC、R400S和Ivsllnt2t→c。其中4种突变G239D、R241fsdelG、R400S和Ivsllnt2t→c在国际PAH数据库末见公布(至投稿日期)。新突变显示中国人PAH基因虽以点突变为主,但存在小的碱基插入、缺失以及移码突变。新突变主要发生在外显子7中(4／10),每种突变的发生频率均很低(0．42％。1．3％)。结论 中国人PAH基因存在高度异质性和突变的多样性,外显子7是PAH基因的突变热点区域。     

Inherited disturbances of phenylalanine metabolic kinetics in essential hypert ension

Objective To clarify whether the disturbances in metabolic kinetics of the essenti al aminoacid, phenylalanine (phe), are implicated in the genetic pathogenesis of essential hypertension (EH). Methods 1. L- (2, 3D3)- leucine, L- (2, 3D3)- isoleucine, L- ［15］N- lysine, L- (2 , 3D3)- valine and L- (2, 3D3)- phe were used for simultaneously studying co mparative metabolic kinetics using stable isotope tracer methods with a GC- MS s ystem. Study groups were the offspring with both parents suffering EH (n=10, FH (+)), 2 or more than 2 parents and grand- parents with EH and stroke (n=12, FS (+)) and those without genetic predisposition of EH and stroke (n=12, F(-)) group s. 2. By comparing the radioactive counts of [(3)H]- phe, and their weight t ransformation in blood after 1. 5 Ci/kg i. v. administration at defined interv als and in tissues obtained after being sacrified among spontaneously hypertensi ve rats (SHR), 2 kidney- 1 clip hypertensive rats (2K1C) and their normotensive controls (WKY). 3. The time transport and concentration transport of [(3)H] - L- phe in cpm between the cultured vascular smooth muscle cell of 5th generati on in SHR and WKY were compared. Results A single and unique disturbance of metabolic kinetics in phe were found in FH(+) , FS(+) and SHR. The plasma pool or apparent volume of distribution was enlarg ed, and the turnover rate constants between plasma and cell tended to show a dec rease. The pharmacokinetics of phe in 2K1C was not changed. Only phe content i n heart and aorta, the vital organs for predicting BP, were higher in SHR than i n WKY tissues studied. Both the time and concentration transport were higher i n SHR, e. g. , an increment in the net- uptake of L- phe by vascular tissue. Conclusion A unique aberrant of metabolic kinetics of phe might be implicated in the inheri ted pathogenesis of EH and stroke both from clinical and animal studies.