糖尿病大鼠表皮角质形成细胞生物学变化的机制研究

目的 通过体内、外2部分实验,研究糖尿病状态下表皮角质形成细胞(KCs )增殖能力的变化及其信号转导途径.方法 STZ(streptozotocin,链脲佐菌素)诱导正常SD大鼠,成模后8周(晚期糖尿病大鼠模型),荧光自显影技术检测皮肤组织中晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products,AGEs)的沉积;ELSA法检测表皮层中EGF(epidermal growth factor表皮生长因子)含量;提取大鼠KCs,用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖速度;检测细胞周期;观察KCs核内NF-κB活性.分离培养正常SD大鼠KCs,加入不同浓度AGEs干预细胞,选择细胞反应敏感,差异显著的100mg/L AGEs干预组进行实验:测定细胞增殖速度;细胞对EGF的利用;检测KCs周期的变化,观察KCs核内NF-κB的活化状态.抑制NF-κB活性后观察细胞周期、细胞对EGF利用的变化.结果 晚期糖尿病大鼠KCs细胞周期循环阻滞,细胞的增殖能力受到了抑制;体外100mg/L AGEs可以明显抑制KCs的增殖.抑制NF-κB的活性后,部分恢复细胞的增殖能力.结论 AGEs可以通过NF-κB途径影响糖尿病大鼠表皮角质形成细胞的增殖能力.     

糖皮质激素抑制辐射诱导P388细胞NF-κB活化

目的 研究糖皮质激素对辐射诱导P388白血病细胞凋亡与NF－κB活化的影响。方法 采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）检测细胞凋亡；采用电泳迁移率变动分析（EMSA）检测P388细胞NF－κB活化水平。结果 2，4，6和8Gy辐射诱导P388细胞凋亡，同时使NF－κB活化。地塞米松（DXM）增强由2，4，6和8Gy辐射诱导的P388细胞凋亡，抑制由2，4，6和8Gy辐射诱导的P388细胞NF－κB活化，凋亡增加率分别为60％，100％，129％和67％，NF－κB活化抑制率分别为25％，45％，52％和40％。结论 辐射诱导P388白血病细胞凋亡的同时激活NF－κB；糖皮质激素可通过抑制NF－κB活化，增强其诱导白血病细胞凋亡的作用。     

PM2．5通过活化 NF－κB 途径诱导支气管上皮细胞中血管内皮生长因子的表达

目的：探讨细颗粒物（particulate matter 2．5,PM2．5）诱导支气管上皮细胞（bronchial epithelial cell,Beas－2B）表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的分子机制。方法 PM2．5粉末溶解于DMEM培养基中,倍比稀释成不同浓度（0、12．5、25、50、100μg／ml）的溶液,超声30 min后加入血清及双抗（链霉素和青霉素）,使终浓度为2％血清的体系,刺激人支气管上皮细胞;双荧光素酶报告基因分析系统检测核因子－κB （nuclear factor－kappa B,NF－κB）活化水平和vegf基因启动子的转录活化水平;Western印迹检测NF－κB组成亚基p65磷酸化水平、阻遏蛋白IκBα及VEGF蛋白表达水平。结果 PM2．5呈剂量依赖性诱导Beas－2B细胞VEGF表达;PM2．5诱导Beas－2B细胞中NF－κB活化,在浓度为100μg／ml活化强度最高,阻遏蛋白IκBα降解和p65亚基磷酸化水平升高;抑制NF－κB p65亚基表达后Beas－2B细胞VEGF蛋白表达水平下调,vegf基因启动子的转录活化水平下降。结论 PM2．5通过活化NF－κB途径诱导支气管上皮细胞中VEGF表达。     

核因子-κB圈套寡核苷酸对核因子-κB活性及创伤炎症反应大鼠肝脏功能损害的影响

目的 探讨核因子(NF)-κB圈套寡核苷酸(ODN)对NF—κB活性及创伤炎症反应大鼠肝脏功能损害的影响。方法 利用电泳迁移率改变实验(EMSA)，测定合成的环状哑铃形圈套ODN对NF—κB的DNA结合能力的竞争抑制作用；利用NF—κB反应性报告细胞株HEK-不稳定增强型绿色荧光蛋白(d2EGFP)，观察圈套ODN瞬时转染对报告基因表达的影响。Wistar大鼠96只，随机分为对照组、创伤性炎症组、圈套ODN组和无关ODN组。利用EMSA检测各组肝脏组织NF—κB的DNA结合活性，用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)检测大鼠肝脏组织TNF—α、白细胞介素-6(IL-6)mRNA水平，酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测大鼠肝脏组织肿瘤坏死因子-α(TNF—α)、IL-6的蛋白水平。结果 设计的环状哑铃形圈套ODN对NF—κB的DNA结合能力具有竞争抑制作用，1μg／ml和2μg／ml圈套ODN瞬时转染HEK—d2EGFP，可明显抑制p65蛋白诱导的d2EGFP表达。大鼠创伤性炎症后3h，肝脏NF—κB活性开始升高，伤后12h达高峰。肝脏组织TNF—α、IL-6mRNA水平和蛋白水平也明显上升，与NF—κB的活性改变一致。圈套ODN治疗后，大鼠肝脏组织TNF—α、IL-6的表达明显下降，肝脏功能明显好转，而无关ODN则没有治疗效果。结论 设计的靶向NF—κB的环状哑铃形圈套ODN可通过特异性抑制NF-κB活性，有效阻止创伤性炎症大鼠肝脏炎症介质TNF—α、IL-6的释放，从而改善肝脏功能。     

失血性休克缺血-再灌注损伤家兔肺泡巨噬细胞中IκK-β／NF—κB改变的实验研究

目的观察失血性休克缺血-再灌注（I／R）损伤时兔肺泡巨噬细胞（AM）中I-κB激酶-β／核因子-κB（IκK-βNF—κB）信号通路的改变，探讨肺部炎症损伤的细胞分子基础。方法建立失血性休克I／R家兔模型，分离、培养AM，用原位杂交方法检测AM中IκK—β的mRNA表达，用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）和酶联免疫吸附（ELISA）法分别检测AM中NF—κB的活性和AM培养上清液中TNF—α、IL-6的含量。病理学光镜观察肺组织的炎症损害。结果模型组IκK—β、NF—κB、TNF—α、IL-6指标较对照组显著升高（P〈0.01）；I／R损伤动物肺组织呈现明显炎症病理改变。结论AM是I／R损伤炎症信号通路的重要细胞基础；细胞内IκK—β激活／NF—κB核移位／细胞因子产生是I／R肺组织炎症病理损伤的重要分子机制。     

BMP-7对高糖诱导近端肾小管上皮细胞外基质及NF-κB表达的影响

目的探讨骨形态发生蛋白7（BMP-7）对高糖诱导近端肾小管上皮细胞（HKc）表达细胞外基质及核转录因子-κB（NF-κB）的干预作用。方法采用人近端肾小管HKc细胞株,将细胞分为正常对照组（NG,5．5mmol／L葡萄糖）、高糖组（HG,25mmol／L葡萄糖）、HG＋100ng／ml BMP-7组、NG＋100ng／ml BMP-7组、高渗组（HM,25mmol／L甘露醇）。应用免疫细胞化学和ELISA技术检测细胞Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）表达,用凝胶电泳迁移率竞争试验（EMSA）检测NF-κB的表达。结果高糖作用下NF-κB活性和Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白表达显著增高,加入100ng／ml BMP-7后可显著抑制NF-κB活性及Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结论BMP-7可能通过抑制NF-κB活性而从转录水平抑制高糖诱导的近端小管细胞细胞外基质的过度表达。     

人脑外伤后皮层核因子-κB的表达

目的 探讨核因子-κB（nuclear factor—κB，NF—κB）在人创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）后挫伤皮层中的表达情况，包括表达位置、表达强度和表达时相。方法 挫伤区皮层的标本来自24例TBI患者，取样时间为伤后5h-5d，利用凝胶电泳迁移分析法（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）和免疫组化技术测定NF—κB的活性和表达强度。结果 在人TBI后的挫伤区皮层中，NF—κB表达明显上调，表达高峰为伤后48—72h，NF—κBP65主要在血管内皮细胞和神经胶质细胞中表达，NF—κBP50主要在神经胶质细胞和少量神经元中表达，NF—κBP65的表达强度高于NF—κBP50。结论 NF—κB在人TBI后的挫伤区皮层中表达上调，提示其可能在TBI后的病理生理过程中起着重要作用。     

核因子—κB在内毒素刺激大鼠肺泡巨噬细胞中的动态变化及其在肿瘤坏死因子—α表达中的作用

目的 观察内毒素(LPS)刺激对大鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AM)中核因子—κB(NF—κB)活性的影响，探讨NF—κB在LPS刺激大鼠AM表达肿瘤坏死因子—α(刀NF—α)中的作用。方法体外观察LPS刺激大鼠AM中NF—κB活性的动态变化，应用圈套策略观察NF—κB在LPS刺激大鼠AM表达刀NF—α中的作用。结果LPS刺激可使大鼠AM内NF—κB明显活化，并与LPS剂量正相关；抗体超迁移率实验结果显示p50、p65参与了NF—κB的活化；NF—κB的圈套硫代寡核苷酸(S—ODN)能明显抑制LPS刺激大鼠AM表达TNF—α，但不能完全阻断LPS诱导的TNF—α表达。结论 NF—κB(p50／p65)在LPS介导的炎症反应中发挥重要作用，LPS刺激大鼠AM表达TNF—α受NF—κB调控，但其他核转录因子可能也在TNF—α的表达中发挥重要作用。     

LPS的直接诱导对肺微血管内皮细胞内NF-κB的影响

目的：探讨LPS的直接诱导作用对肺微血管内皮细胞(PMVEC)核因子κB(NF—κB)的影响。方法：100ng/ml LPS刺激PMVEC 0h、0．5h、1h、2h、4h、6h、8h或10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml LPS刺激1h，凝胶电泳迁移率试验检测NF—κB的活化，免疫细胞化学观察其亚基p50、p65的核转位。并通过加入活化阻断剂TPCK观察对诱导的NF—κB活化的最响。结果：LPS的刺激迅速诱导p50、p65亚基核转位，活化NF—κB，1h达到简蜂，且呈剂量依赖关系，后逐渐下降。PDIC能显著抑制其活化，P＜0．01。结论：LPS的直接刺激诱导NF—κB的活化，这可能是LPS诱导炎症反应的一个重要环节。     

医用臭氧对宫颈癌细胞增殖和迁移抑制作用的初步研究

【摘要】 目的 探讨医用臭氧是否通过核因子（NF）-κB信号通路调控上皮-间质细胞转化（EMT）相关蛋白表达抑制宫颈癌细胞增殖和迁移。 方法 选用人宫颈癌Hela细胞,分别设空白组、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理组、NAC和臭氧共处理组、臭氧组。细胞在臭氧处理前以60 mmol/mL NAC溶液预处理20 min,随后将细胞悬液与等体积半最大效应浓度（EC50）臭氧混合15 min。细胞计数试剂盒（CCK）-8和细胞集落实验检测细胞增殖抑制。二氯二乙酸酯（DCFH-DA）探针通过流式细胞术检测活性氧（ROS）水平。划痕实验和Transwell实验验检测臭氧处理后Hela细胞迁移能力。蛋白质印迹法检测NF-κB和EMT相关蛋白表达水平。 结果 臭氧处理后Hela细胞增殖能力下降,臭氧EC50为10 mg/mL,同时其迁移能力也下降。臭氧处理后,Hela细胞NF-κB和κB抑制性蛋白激酶（IKK）α表达及其磷酸化水平均降低,同时EMT相关波形蛋白（vimentin）和β-连环蛋白（β-catenin）表达水平降低,而NAC预处理可逆转臭氧的作用。 结论 医用臭氧可能通过抑制NF-κB信号通路下调vimentin、β-catenin抑制宫颈癌Hela细胞增殖和迁移,ROS在其中发挥重要作用,表明医用臭氧有望成为宫颈癌新的辅助治疗手段。     

NF-κB在TNF-α和血管紧张素Ⅱ致内皮细胞凋亡中的作用

目的:了解NF-κB在TNF-α和血管紧张素Ⅱ导致内皮细胞凋亡中的作用。方法:用浓度为10 ng/ml TNF-α和浓度为1μmol/L血管紧张素Ⅱ分别干预内皮细胞,TUNEL法检测细胞的凋亡情况、EMSA检测NF-κB的活性和Western-blot检测IκBα的表达;用浓度检测细胞的凋亡、NF-κB的活性和IκB的表达。结果:TNF-α和血管紧张素Ⅱ显著引起了细胞的凋亡、IκBα蛋白的裂解和NF-κB的激活,用PDTC预处理后,在NF-κB活性减弱的同时抑制了细胞的凋亡。结论:在内皮细胞中,TNF-α和血管紧张素Ⅱ通过裂解胞浆内的IκBα蛋白进而激活NF-κB引起的细胞凋亡。     

猕猴桃根提取物抗肝细胞癌作用及相关机制研究

目的探讨猕猴桃根提取物抗肝细胞癌(HCC)的作用及相关机制。方法选取HCC细胞系HepG2和HUH7,根据猕猴桃根浓度分为0μg/ml(对照组)、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml组。采用噻唑蓝(MTT)和克隆实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;划痕实验和Transwell实验研究细胞的侵袭和转移;Real-time PCR和Western blot检测相关基因和蛋白表达。结果猕猴桃根对HCC增殖的抑制作用存在剂量和时间依赖性。克隆实验发现,与对照组比较,不同浓度猕猴桃根抑制HepG2和HUH7细胞增殖,且随浓度的增加,抑制作用逐渐增强,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测结果发现,与对照组比较,50μg/ml、100μg/ml猕猴桃根促进细胞由G1期进入S期,抑制DNA复制,促进HepG2和HUH7细胞凋亡,差异均有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果发现,与对照组比较,猕猴桃根显著促进HepG2和HUH7细胞迁移,具有剂量依懒性(P<0.05)。猕猴桃根促进Akt基因和蛋白表达,抑制p-Akt表达,抑制Akt磷酸化比例,促进PTEN基因和蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论猕猴桃根通过p-Akt/PTEN调控HCC细胞增殖、周期停滞及细胞凋亡。     

α-生育酚对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的影响及机制

目的研究α-生育酚对TRAIL凋亡诱导作用的影响及机制。方法采用碘化丙啶（PI）染色和流式细胞仪检测胃癌细胞SGG7901和MKN28的细胞周期及凋亡率;Western blot检测凋亡相关基因NF-κB、bcl-2和Survivin的表达。结果单用TRAIL 300ng／ml作用24h,胃癌细胞SGC-7901和MKN28的凋亡率分别为11．80％和36．05％;单用廿生育酚60μmol／L作用24h,SCG-7901和MKN28细胞的凋亡率分别为8．5％和9．0%。α-生育酚60μmol／L与TRAIL 300ng／ml联用24h后,SGG-7901和MKN28细胞的凋亡率分别升高至48．1％和63．7％。Western blot显示TRAIL可使SGC-7901和MKN28细胞survivin及NF-κB表达下调,但对bcl-2的表达无影响;α-生育酚对bcl-2和survivin的表达无明显影响;TRAIL与α-生育酚联用可使细胞中NF-κB、survivin和bcl-2的表达均明显下调。结论α-生育酚可增强TRAIL对胃癌细胞的凋亡诱导能力,其机制可能与survivin、NF-κB和bcl-2的表达下调有关。     

白英水提物诱导人卵巢癌A2780细胞bcl-2基因表达的影响

目的：观察白英水提物诱导人卵巢癌A2780细胞凋亡的作用,初步探讨其分子机制。方法：常规方法制备白英水提物,体外培养人卵巢癌A2780细胞,MTT法提示其有较强的体外抑制A2780细胞作用。采用半定量RT—PCR法检测凋亡相关基因bcl-2表达。实验组设白英水提物12．5、25．0、50．0mg／ml 3种浓度,以顺铂（25．0μg／ml）为阳性对照组。结果：白英水提物对A2780细胞增殖有抑制作用,且呈明显的量效关系,半定量RT—PCR法检测显示bcl-2 mRNA表达下调,诱导其发生凋亡。结论：白英水提物对A2780细胞有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用,其诱导A2780细胞凋亡的分子机制可能与下调bcl-2基因表达有关。     

洛伐他汀对兔血管平滑肌细胞转录因子活性的影响

目的 观察洛伐他汀对兔血管平滑肌细胞转录因子AP-1和NF-κB结合活性及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。方法 用[γ—^32P]—ATF标记寡聚核苷酸，采用电泳迁移率变动分析(EMSA)法测AP-1和NF—κB结合活性，用酶谱分析法检测MMP-9表达水平。结果 洛伐他汀抑制血管平滑肌细胞MMP-9的生成且呈剂量—效应依赖关系，该抑制作用可被甲羟戊酸和焦磷酸二香叶酯而非角鲨烯所逆转；洛伐他汀减低AP-1和NF—κB的结合活性。结论 洛伐他汀可抑制血管平滑肌细胞AP-1和NF—κB结合活性，减少MMP-9的生成。     

藻蓝蛋白-光动力疗法治疗小鼠HeLa细胞瘤的免疫和凋亡机制研究

目的探讨藻蓝蛋白介导的光动力疗法治疗小鼠HeLa细胞瘤的免疫和凋亡机制。方法将HeLa细胞接种于小鼠肋缘皮下脾区构建荷瘤小鼠模型。实验分成3组：对照组、激光照射组、光动力治疗组（PDT组）。PDT组：肿瘤局部皮下注射藻蓝蛋白液0.25ml（约2g）2h后以He-Ne激光照射。实验第7d测瘤块重量,取胸腺、脾脏检测NK细胞活性和T细胞增殖活性。取瘤块制成石蜡包埋切片,采用原位核酸杂交技术、免疫组织化学技术检测肿瘤细胞内CD44、P53、NFκB、Fas基因的表达。结果与对照组相比,激光照射组NK细胞和免疫T细胞的增殖活性有所增强,肿瘤细胞内抗凋亡基因（Fas）表达量显著增多,而瘤块的重量、肿瘤形成率和抗凋亡基因（P53、NFκB、CD44）明显减少。以上各项指标PDT组与激光组比较,差异亦具有显著或非常显著意义（P〉0.05或P〈0.01）。结论藻蓝蛋白介导的光动力疗法通过增强机体的免疫力同时启动HeLa细胞内的凋亡信号转导通路诱导细胞凋亡,从而达到杀死肿瘤的目的。     

青蒿琥酯对乳腺癌细胞的生长抑制作用及其机制

目的探讨青蒿琥酯对乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长抑制作用及其可能机制。方法利用CCK-8法检测青蒿琥酯对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用,并计算IC₅₀值。根据IC₅₀值选择后续实验的青蒿琥酯浓度(0、25、50、100 μg/ml),0 μg/ml青蒿琥酯组作为对照组。采用不同浓度(0、25、50、100 μg/ml)的青蒿琥酯干预MDA-MB-231细胞24 h,利用流式细胞术检测细胞凋亡情况及线粒体膜电位;0、25 μg/ml青蒿琥酯干预MDA-MB-231细胞24 h,利用细胞划痕试验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果青蒿琥酯对MDA-MB-231细胞具有增殖抑制作用,且呈浓度依赖性,对MDA-MB-231细胞的IC₅₀为54.24μg/ml。不同浓度的青蒿琥酯干预MDA-MB-231细胞24 h,MDA-MB-231细胞凋亡率显著增高(P<0.01);与对照组相比,青蒿琥酯组细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.01),且呈浓度依赖性。细胞划痕实验结果显示,青蒿琥...     

子宫内膜异位症核转录因子和血管内皮生长因子表达与预后的关系

目的：探讨核转录因子（NF—κB）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达与子宫内膜异位症（内异症）预后的关系。方法：采用免疫组化SP法检测83例内异症患者在位及异位组织标本中的NF—κB和VEGF的表达水平，并结合患者临床病案记录及随访资料进行分析。结果：NF—κB在内异症患者的异位和在位内膜中的表达率分别为73．49％及59．04％，VEGF表达率分别为69．88％及和55．42％。NF—κB和VEGF在两种内膜中表达一致性均良好，且两者表达具有正相关性（在位内膜：κappa=0．78，r=0．78，P〈0．01；异位内膜：κappa=0．69，r=0．67，P〈0．01）。NF—κB和VEGF高表达的异位症患者复发率明显高于低表达患者（P〈0．05）。结论：NF—κB和VEGF的表达对估计内异症的预后有重要的意义，可做作为判断内异症预后的指标。     

IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2表达及其分子机制

目的观察白介素-1β（IL-1β）诱导人气道上皮细胞人13防御素2（hBD-2）的表达及抑制因子I-κBα蛋白、核转录因子KB（NF-κB）活性的变化，探讨人气道上皮hBI〉2表达的分子机制。方法用IL-1β和（或）NF-κB抑制剂PDTC处理人原代气道上皮细胞，RT-PCR法检测hBD-2mRNA的表达，Western blot检测胞浆I-κBa蛋白，凝胶迁移实验（EMSA）检测NF-κB活性的变化。结果加入IL-1β 1μg／L刺激0．5h，可见I-κBa活性降低；刺激1．5h可见hBD-2 mRNA表达。NF-κB抑制剂PDTC可抑制hBD-2 mRNA的表达，EMSA显示NF-κB的异型二聚体p65-p50参与了hBD-2表达的转录。结论一定剂量的IL-1β可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达，NF-κB p65／pS0异型二聚体参与了IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达的转录调控。     

不同剂量美托洛尔对家兔缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响

目的探讨不同剂量美托洛尔对家兔缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响。方法48只家兔随机分为4组．假手术组、模型组、小剂量美托洛尔组、大剂量美托洛尔组。采用高脂饮食并免疫损伤制作动脉粥样硬化模型。用药4周后结扎家兔左冠状动脉前降支（LAD）,建立家兔缺血再灌注动物模型。测定家兔血脂指标（TG、TC）及心率,取左心室病理,应用11℃染色的方法检测各组心肌梗死面积,采用免疫组化染色半定量检测心肌核因子KBp65（NF—KBp65）及Fas蛋白的表达量．采用TUNEL法计数心肌凋亡指数：结果药物干预组心率较不用药组心率减慢（P〈0．01）,大剂量美托洛尔组比小剂量美托洛尔组心率减慢（P〈0．05）;手术组的凋亡指数、Fas和NF—κB蛋白表达较假手术组明显增加（P〈0．01）,大小剂量美托洛尔组凋亡指数、Fas和NF—κB蛋白的表达较模型组明显减少（P〈O．01）,大剂量美托洛尔组凋亡指数、Fas和NF—κB蛋白的表达较小剂量美托洛尔组明显减少（P〈0．05）;大小剂量美托洛尔组心肌梗死面积较模型组明显减小（P〈0．01）,大剂量美托洛尔组较小剂量美托洛尔组心梗面积明显减少（P〈0．01）。结论美托洛尔对缺血再灌注心肌有保护作用,减少心梗面积,可能与它减慢心率、减少心肌细胞Fas和NF—κB蛋白的表达抗凋亡有关,美托洛尔对缺血再灌注损伤心肌的保护作用呈剂量依赖性。