人原发性肝癌基因的实验研究───肿瘤坏死因子基因的初步应用

将含人肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ的不同逆转录病毒载体（ＬＮＳ－ｔｎｆα、Ｌ－ｔｎｆαＳＮ及ＬＮＣ－ｔｎｆα）和质粒型真核细胞载体（ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα），分别用磷酸钙法导入肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１中，观察ＴＮＦ的表达水平。结果：重组质粒型表达载体ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα表达好，２４小时开始分泌ＴＮＦα（５０Ｕ／ｍｌ），４８～７２小时达最高值（９０Ｕ／ｍｌ），９６小时后下降（４０Ｕ／ｍｌ）。将ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα重组ＤＮＡ用磷酸钙包裹后直接进行瘤内注射，发现裸鼠外周血ＴＮＦα水平有一过性增高，３周后测量瘤体大小，发现实验组的肿瘤体积明显小于对照组（２．５±１．６ｃｍ比３．２±１．８ｃｍ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０５），实验组荷瘤裸鼠的生存时间亦明显延长（４４．０±３．３ｄ比２８．２±２．０ｄ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０１）。结果表明，应用ＴＮＦα基因转移进行肝癌的基因治疗是一条值得探索的途径。     

新城鸡瘟病毒诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生肿瘤坏死因子的细胞毒活性研究

目的观察新城鸡瘟病毒Ｌ系（ＮＤＶ－Ｌ）诱导小鼠腹腔巨噬细胞（ＰＥＭΦ）产生的肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）对肿瘤细胞的细胞毒性作用。方法采用噻唑蓝（ＭＴＴ）和３Ｈ－脱氧胸苷（３Ｈ－ＴｄＲ）标记肿瘤细胞的方法。结果ＮＤＶ－Ｌ可诱导小鼠ＰＥＭΦ产生ＴＮＦ－α，其产生的量随ＮＤＶ－Ｌ感染量的增加而活性增强。当ＮＤＶ－Ｌ感染剂量一定时，ＴＮＦ－α释放量在ＮＤＶ－Ｌ作用ＰＥＭΦ２４ｈ时为最强（１００Ｕ／ｍｌ）。用３Ｈ－ＴｄＲ标记肿瘤细胞（小鼠乳腺癌细胞系Ｃａ７６１－８６和小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５）做ＴＮＦ－α的细胞毒试验，表明其具有明显的杀伤活性。结论ＮＤＶ－Ｌ诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生的ＴＮＦ－α具有明显的细胞毒活性。     

人急性早幼粒细胞性白血病细胞诱导分化生成树突状细？…

树突状细胞在激发机体抗白血病Ｔ细胞免疫应答中具有重要作用，有报道ＤＣ可以由单核主粒细胞分化生成，本研究应用细胞因子在体外诱导了急性早幼粒细胞性白血病（ＡＰＬ）细胞向ＤＣ的分化。从Ｍ３型ＡＰＬ患者外周血分离白血病细胞，加入ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）或ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）＿ｒｈＩＬ＝４（５００Ｕ／ｍｌ）ｗ体外培养１４天，并于培养结束前３天加入ＴＮＦ－α（１００ｎｇ／ｍｌ）。结果表明，     

肿瘤放射线诱导性TNF基因疗法的实验研究

肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）对机体具有一定的放射线保护作用，并能增强肿瘤的放疗效果。用可被放射线转录激活的Ｅｇｒ－１启动子与人ＴＮＦ的融合基因，构建成放射线诱导性的人ＴＮＦ双拷贝逆转录病毒载体ｐＥＴＤＣ，经包装细胞Ｐｓｉ－２和Ｃｒｉｐ的两次包装后，其病毒上清的病毒滴度达４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ。用此病毒上清感染小鼠成纤维细胞株ＮＩＨ３Ｔ３和黑色素细胞株Ｂ１６．Ｆ１０，经Ｇ４１８抗性筛选后，得到的阳性克隆分泌ＴＮＦ量分别为２．１ｎｇ／ｍｌ和１．１ｎｇ／ｍｌ，并经ＲＴ－ＰＣＲ证实了人ＴＮＦｍＲＮＡ的表达。经２０Ｇｙ的放射线体外照射后，其ＴＮＦ表达量分别升至１３．８ｎｇ／ｍｌ和５．７ｎｇ／ｍｌ，即分别为照射前的５．６倍和４．２倍。此结果为其将来瘤体内注射该ＴＮＦ基因表达载体并辅助局部放疗的体内实验打下了基础。     

成纤维细胞介导的人α型干扰素基因疗法与过继免疫化疗联合治…

作者以皮下接种人肝细胞癌细胞ＳＭＭＣ７７２１的裸鼠为荷瘤模型，由人外周血单个核细胞经体外ＩＬ－２和丝裂霉素Ｃ灭活的人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１共同刺激培养后激活的杀伤细胞（ＡＫ），研究了将成纤维细胞介导的人ＩＦＮ－α基因疗法与ＩＬ－２／ＡＫ／阿霉素过继免疫化疗联合应用后对肝癌的治疗作用。结果表明：（１）给肝癌鼠单独腹腔埋植人ＩＦＮ－α基因转移的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α＾＋）就     

腹腔注射分泌粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子的重组痘苗病毒的…

通过体内途径直接注射各种载体进行细胞因子基因治疗，具有重要的临床意义，作观察了表达小鼠粒细胞－巨噬细胞落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因的重组痘苗病毒９ＶＶＧＭ－ＣＳＦ）对肺转移荷瘤小鼠模型的治疗作用。给Ｃ５７ＢＬ／６小鼠尾静脉注射２×１０＾５Ｂ１６Ｆ１０细胞３天后开始腹 内注射ＶＶＧＭ－ＣＳＦ１０＾８ＰＦＵ／０．１ｍｌ，２粗埽瘟疲仓堋＝峁允荆郑郑牵停茫樱颇芄幌灾跎俸闪鲂∈笙赴纳鄙恕     

肿瘤坏死因子,干扰素和免疫活性肽对癌瘤患者骨髓粒—巨造血祖细…

应用ＣＦＵ－ＧＭ软琼脂培养技术，在体外观察了不同浓度的ｒｈ－ＴＮＦ，ｒｈ－ＩＦＮα－２和ＩＡＰ对９例恶性淋巴瘤和１例睾丸癌患者的骨髓粒、巨造血祖细胞生长的影响。结果表明，在培养体系中，加入ｒｈ－ＴＮＦ５０和１００ｕ／ｍｌ，其ＣＦＵ－ＧＭ较空白对照均明显增多（Ｐ〈０．０５）。ｒｈ－ＩＦＮα－２１０００ｕ／ｍｌ可使ＣＦＵ－ＧＭ减少（Ｐ〈０．０５）。ＩＡＰ似乎对ＣＦＵ－ＧＭ无影响（Ｐ〉０．０５）。集落形     

成纤维细胞介导的人α型干扰素基因疗法与过继免疫化疗联合治疗人肝癌的实验研究

作者以皮下接种人肝细胞癌细胞ＳＭＭＣ７７２１的裸鼠为荷瘤模型，由人外周血单个核细胞经体外ＩＬ－２和丝裂霉素Ｃ灭活的人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１共同刺激培养后激活的杀伤细胞（ＡＫ），研究了将成纤维细胞介导的人ＩＦＮ－α基因疗法与ＩＬ－２／ＡＫ／阿霉素过继免疫化疗联合应用后对肝癌的治疗作用。结果表明：（１）给肝癌裸鼠单独腹腔埋植人ＩＦＮ－α基因转移的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α￣＋）就能显著抑制肝癌（皮下）体内生长，使荷瘤裸鼠存活期明显延长；（２）在腹腔埋植ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α￣＋之后再静脉注射ＡＫ细胞、腹腔内注射ＩＬ－２，发现荷瘤裸鼠的皮下肿瘤结节生长抑制作用更明显；（３）将ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α￣＋与ＩＬ－２／ＡＫ／阿霉素联合应用后，对肝癌裸鼠的治疗效果更佳。     

抗人小细胞肺癌T细胞受体嵌合基因的克隆

目的克隆人小细胞肺癌抗体／Ｔ细胞受体嵌合基因。方法应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术将人小细胞肺癌单克隆抗体的变区ＶＨ、ＶＫ与Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）恒区Ｃα、Ｃβ进行拼接，构建成ＶＨＣβ、ＶＫＣα嵌合ＴＣＲ，并分别克隆至ｐＭＡＭ、ｐＸＴ１真核表达载体。结果应用ＰＣＲ中重叠延伸剪接（ＳＯＥ）方法，能简化基因拼接步骤；该嵌合基因的克隆有助于对肿瘤免疫治疗新途径的探索。     

肿瘤坏死因子-α促进乳腺癌细胞ＭＣＦ-７迁徙的机制探讨

目的：探讨肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ-α,ＴＮＦ-α）诱导黏附分子ＣＤ４４表达的机制。方法：以０、２、２０、２００ｎｇ／ｍｌ浓度处理ＭＣＦ-７细胞,了解对ＭＣＦ-７细胞增殖以及迁徙的影响。Ｗｅｓｔｅｒｎ-ｂｌｏｔ方法检测ＭＡＰＫ（ＪＮＫ、Ｐ３８、ＥＲＫ）信号通路中蛋白磷酸化水平的变化;用ＭＡＰＫ抑制剂预处理后,检测ＣＤ４４表达水平。结果：ＴＮＦ-α可以改变ＣＤ４４亚型表达,并促进ＭＣＦ-７细胞的迁徙能力;ＴＮＦ-α可以激活ＪＮＫ信号转导通路,对Ｐ３８和ＥＲＫ信号通路无明显激活效应;用特异性的ＪＮＫ信号通路抑制剂可以阻断ＴＮＦ-α诱导的ＣＤ４４蛋白表达水平。结论：ＴＮＦ-α通过ＪＮＫ信号通路调节ＣＤ４４并促进ＭＣＦ-７细胞的迁徙能力。     

重组人肿瘤坏死因子抗卵巢癌的体内外实验研究

以ＭＴＴ法测试发现重组人肿瘤坏死因子（ｒＨＴＮＦ－α）对体外培养的人卵巢癌细胞系ＯＶＣＡＲ３和ＣＡＯＶ３有较强的细胞毒效应。同时还测试了五种化疗药物５－Ｆｕ、ＣＴＸ、ＶＣＲ、ＤＤＰ、ＫＳＭ对这两种细胞的细胞毒性。在化疗药物浓度参照临床用药剂量制定的条件下，五种化疗药物对这两种细胞的细胞毒性均明显低于ｒＨＴＮＦ－α。因此，ｒＨＴＮＦ－α抗卵巢癌的潜力值得重视。形态学研究表明，ｒＨＴＮＦ－α首先引起卵巢癌细胞的线粒体和内质网的破坏，继之才出现细胞膜损伤和细胞裂解。实验还证实，ｒＨＴＮＦ－α与ＤＤＰ或ＫＳＭ联合均有一定的协同抗癌效应。在体外实验的基础上，作者对人卵巢癌细胞ＯＶＣＡＲ３的裸鼠移植瘤模型进行了实验性治疗。结果显示，ｒＨＴＮＦ－α单独应用有显著的抗移植瘤作用，与ＫＳＭ合用有较强的协同效应。     

B7-1基因转染后对小鼠体内的免疫增强作用

目的 研究转染Ｂ７－１基因后的小鼠宫颈癌Ｕ１４细胞在体内的免疫原性变化。方法 （１）分别用病毒感染法和电穿孔法将ＬＮＳｍＢ７和ｐＣＥＰｍＢ７导入Ｕ１４细胞,用流式细胞仪检测阳性混合克隆细胞Ｕ１４／ＬＮＳｍＢ７和Ｕ１４／ｐＣＥＰＭＢ７的Ｂ７－１分子表达率;（２）取不同数量的Ｕ１４,Ｕ１４／ＬＮＳｍＢ７和Ｕ１４／ｐＣＥＰｍＢ７细胞分别下皮接种昆明种小鼠,４周后观察各组小鼠肿瘤大小和病理结果;（３）取１     

腹腔注射分泌粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的重组痘苗病毒的抗肿瘤肺转移作用

通过体内途径直接注射各种载体进行细胞因子基因治疗，具有重要的临床意义。作者观察了表达小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因的重组痘苗病毒（ＶＶＧＭ－ＣＳＦ）对肺转移荷瘤小鼠模型的治疗作用。给Ｃ５７ＢＬ／６小鼠尾静脉注射２×１０５Ｂ１６Ｆ１０细胞３天后开始腹腔内注射ＶＶＧＭ－ＣＳＦ１０６ＰＦＵ／０．１ｍｌ，２次／周，连续治疗２周。结果显示，ＶＶＧＭ－ＣＳＦ能够显著减少荷瘤小鼠肺转移结节的数目，并明显延长荷瘤小鼠的存活期。研究发现，经过ＶＶＧＭ－ＣＳＦ治疗，小鼠腹腔巨噬细胞的杀伤、吞噬及其释放一氧化氮的能力明显提高，结合其它实验结果，荷瘤小鼠持续表达ＧＭ－ＣＳＦ并导致以上巨噬细胞功能改变，可能是ＶＶＧＭ－ＣＳＦ的抗肿瘤转移作用机理之一。     

人His6—IFNhγ／TNFβ（His6—γTNFβ）融合蛋白（包涵体）的 …

应用ｐＥＴ２８（含Ｔ７ｌａｃ启动子和Ｈｉｓｔ－ｔａｇ）质粒，将人γＴＮＦβ融合基因之组建成ｐＥＴγＬＴ表达质粒，并转化于Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。本文对ｐＥＴγＬＴ／ＢＬ２１（ＤＥ３）工程菌的Ｈｉｓ６－γＴＮＦβ重组产物进行了诱导表达，分离纯化的研究。结果表明，该工程菌用ＬＢ培养基在３７℃扩增至ＯＤ５９０为０．５左右，加ＩＰＴＧ（终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ）诱导５小时，此时Ｈｉｓ６－γＴＮＦβ的     

TNFα影响LAK细胞、化疗药物抗胃癌细胞作用的实验研究

观察ＴＮＦα对ＬＡＫ细胞、化疗药物抗胃癌作用的影响。方法以不同浓度ＴＮＦα与ＩＬ┐２配伍培养ＬＡＫ细胞，并使ＴＮＦα单抗阻断试验；以ＴＮＦα预处理胃癌细胞，观察ＴＮＦα影响ＬＡＫ抗瘤活性的特性及胃癌细胞对ＰＢＭＣ及ＬＡＫ的敏感性变化；以ＴＮＦα联用５┐ＦＵ，ＡＤＭ或ＭＭＣ观察体外、ＴＮＦ联用ＭＭＣ观察荷胃癌裸鼠体内的抗胃癌效应。结果ＴＮＦα在低浓度ＩＬ┐２下增加ＬＡＫ活性，使ＩＬ┐２诱导同等ＬＡＫ活性的浓度下降约１０倍；ＴＮＦα预处理胃癌细胞使ＰＢＭＣ、ＬＡＫ对其的抗瘤活性提高约１０％、９％。ＴＮＦα与５┐ＦＵ、ＡＤＭ或ＭＭＣ联合组体外、ＴＮＦ与ＭＭＣ联用组体内抑制胃癌细胞生长效应明显优于单用组，差异显著。结论ＴＮＦα在低浓度ＩＬ┐２下增加ＬＡＫ抗胃癌活性，ＴＮＦα预处理使胃癌细胞对ＰＢＭＣ及ＬＡＫ的敏感性增加；ＴＮＦα联合化疗药物５┐ＦＵ、ＡＤＭ或ＭＭＣ可使抗胃癌效应提高     

肿瘤坏死因子、干扰素和免疫活性肽对癌瘤患者骨髓粒－巨造血祖细胞的影响

应用ＣＦＵ－ＧＭ软琼脂培养技术，在体外观察了不同浓度的ｒｈ－ＴＮＦ，ｒｈ－ＩＦＮα－２和ＩＡＰ对９例恶性淋巴瘤和１例睾丸癌患者的骨髓粒－巨造血祖细胞生长的影响。结果表明，在培养体系中，加入ｒｈ－ＴＮＦ５０和１００ｕ／ｍｌ，其ＣＦＵ－ＧＭ较空白对照均明显增多（Ｐ＜０．０５）。ｒｈ－ＩＦＮα－２１０００ｕ／ｍｌ可使ＣＦＵ－ＧＭ减少（Ｐ＜０．０５）。ＩＡＰ似乎对ＣＦＵ－ＧＭ无影响（Ｐ＞０．０５）。集落形态学显示，ｒｈ－ＴＮＦ和ＩＡＰ均能增加巨噬细胞为主形成的集落（Ｐ＜０．０１）。我们认为，该实验为骨髓移植及肿瘤患者在选择应用这些细胞因子上提供了一定的佐证。     

阻断己糖激酶-Ⅱ基因表达对结肠癌化疗的影响及其机制

目的：观察阻断己糖激酶-Ⅱ（ＨＫ-Ⅱ）基因表达对结肠癌ＬｏＶｏ细胞化疗敏感性的影响及其机制。方法：应用质粒介导的短发夹ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）真核表达法特异性阻断ＨＫ-Ⅱ基因表达。通过半定量逆转录 聚合酶链反应（ＲＴ-ＰＣＲ）和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析ＲＮＡ干扰效应。ＭＴＴ法检测氟尿嘧啶（５-ＦＵ）和奥沙利铂（Ｌ-ＯＨＰ）对ＬｏＶｏ细胞的半数抑制浓度（ＩＣ５０）;底物比色法测定半胱氨酸蛋白水解酶（ｃａｓｐａｓｅ）-３活性;Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测胸苷酸合成酶（ＴＳ）表达变化。结果：ＲＮＡ干扰技术特异性下调结肠癌ＬｏＶｏ细胞ＨＫ-Ⅱ基因表达,ｍＲＮＡ和蛋白质水平的表达抑制率分别为７２.１％和７１.２％。阻断ＨＫ-Ⅱ基因表达后,结肠癌ＬｏＶｏ细胞５-ＦＵ和Ｌ-ＯＨＰ的ＩＣ５０值分别为（４.７０±０.４０）μｇ／ｍｌ和（６.２７±０.５９）μｇ／ｍｌ,均明显低于正常培养细胞的（１１.９３±０.１５）μｇ／ｍｌ和（９.７７±０.６０）μｇ／ｍｌ（Ｐ＜０.０１）;与正常培养细胞相比,ＲＮＡ干扰的ＬｏＶｏ细胞ｃａｓｐａｓｅ-３活性明显增高,ＴＳ蛋白表达下降。结论：阻断ＨＫ-Ⅱ基因表达可能通过活化ｃａｓｐａｓｅ-３和降低ＴＳ表达的途径来增加结肠癌ＬｏＶｏ细胞化疗敏感性。     

新城鸡瘟病毒诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生肿瘤坏死因子的细胞毒…

目的 观察新城鸡瘟病毒Ｌ系（ＮＤＶ－Ｌ）诱导小鼠腹腔巨噬细胞（ＰＥＭΦ）产生的肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）对肿瘤细胞的细胞毒性作用。方法 采用噻唑蓝（ＭＴＴ）和＾３Ｈ－脱氧胸苷（＾３Ｈ－ＴｄＲ）标记肿瘤细胞的方法。结果 ＮＤＶ－Ｌ可诱导小鼠ＰＥＭΦ产生ＴＮＦ－α其产生的量随ＮＤＶ－Ｌ感染量的增加而活性增强，当ＮＤＶ－Ｌ感染剂量一定时，ＴＮＦ－α释放量在ＮＤＶ－Ｌ作用ＰＥＭΦ２４ｈ时为最强（１００     

增强子结合蛋白家族一个新基因的3‘—非编码区序列对肝癌细胞7721生长的...

目的 观察所获得的增强子结合蛋白家族一个新基因ＨＰ８的３＇－非编码区（３＇ＵＴＲ）对肝癌细胞生长的影响。方法 将３＇ＵＴＲ序列亚克隆至真核表达载体ｐＢＫＣＭＶ中，运用磷酸钙沉法转染肝癌细胞７７２１。 结果 观察到细胞的生长受到较明显抑制。结论 表明该基因参与真核细胞转录调控，结合以前的实验结果（该基因在肝癌细胞中普遍高表达），提示该基因与细胞生长调控密切相关。     

直接注射含人Ⅸ因子cDNA质粒在小鼠体内的表达

本文报道了２种分别由人巨细胞病毒（ｈＣＭＶ）启动子和ＳＶ４０早期启动子控制的人Ⅸ因子ｃＤＮＡ质粒ｐＣＭＶ─Ⅸ，ｐＫＧ５─Ⅸ直接注射小鼠骨骼肌内，在肌细胞中可产生Ⅸ因子蛋白，并分泌至血液中，在注射后约第１０ｄ表达量最高，最高含量可达２５ｎｇ／ｍｌ。为采用直接注射法进行遗传病基因治疗提供１种可能。