抗胃癌单抗3H11的单链抗体表达载体的构建和表达

目的构建抗胃癌鼠单抗３Ｈ１１的单链抗体（ＳｃＦｖ）,以利于临床应用。方法采用噬菌体抗体库技术和ＰＣＲ介导的定位点突变技术,构建和改造抗胃癌ＳｃＦｖ基因。结果从３Ｈ１１杂交瘤制备抗体库,以胃癌细胞系（ＭＧＣ８０３）进行筛选,未获阳性克隆。再对３Ｈ１１可变区基因以ＰＣＲ错配技术进行随机突变,构建次级突变抗体库,仍未筛出阳性克隆。最后用ＰＣＲ定点突变技术,将ＳｃＦｖ可变区基因氨基端序列恢复成３Ｈ１１的原始序列,终于得到可与胃癌细胞结合的ＳｃＦｖ克隆。结论说明ＰＣＲ引物引入的可变区氨基端序列的改变有时可对ＳｃＦｖ的活性有很大影响     

抗膀胱癌单抗Fab段基因的克隆及表达

目的：克隆抗膀胱癌单抗BDI的Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法：用逆转录－聚合酶链反应技术（RT－PCR），从分泌抗人膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆k链和Fd段基因，克隆到Fab表达载体中，在大肠杆菌表达噬菌体抗体和可溶Fab；运用PCR介导的定位点突变改造VH氨基端序列；用ELISA、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果：从分泌抗膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆了重链Fd段和k链基因，在大肠杆菌中获得有抗原结合活性的噬菌体抗体和可溶性Fab的表达，但活性很弱，将VH氨基端序列矫正为亲本单抗原始序列后，明显改善了其活性，通过ELISA、免疫组化及模拟抗体库筛选证实了所获抗体片段的特异性结合及在抗体库技术中的可用性。结论：获得了功能性抗膀胱癌小分子抗体，并再次提示抗体氨基端序列对抗体活性的影响的重要性。     

抗人肺腺癌单抗5F-11噬菌体抗体库的构建及表达

目的　构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法　利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬菌体表达文库。结果　制备了库容为 8× 10 7pfu/ml的噬菌体展示文库。随机抽取未经筛选的克隆进行酶切 ,酶切图谱呈多样性 ,富集后的酶切图谱则显示特异构型的噬菌体得到富集。检测 30个噬菌体克隆上清 ,其中 2 3个与A2 细胞有较强反应。结论　本研究获得了抗人肺腺癌单抗 5F 11的单链抗体 ,为拓展抗体的应用创造了条件。     

构建人源抗体库并筛选高亲和力抗大肠癌单链抗体

鼠源杂交瘤单克隆抗体用于体内时,由于其分子量大不易穿透入组织及诱发人体产生抗小鼠抗体(HAMA)反应,在体内应用效果不理想.为此,必须将鼠源单抗人源化.最好的策略是用噬菌体技术构建抗体库.但人淋巴细胞未经体内/外致敏,不易筛出特异性和亲和力高的抗体.国内外尚无结合体外致敏法和噬菌体呈现技术以改造鼠源单抗的报导.本研究拟建立抗原体外致敏淋巴细胞,RT-PCR克隆人抗体基因,噬菌体呈现技术构建人源抗体库并用单抗纯化的抗原筛选抗体库的策略,以人源化鼠源单抗Hb3.方法与结果:首先,用Hb3亲和层析纯化大肠癌相关抗原CA-Hb3,该抗原经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定后,与IL-2和丝裂原于体     

抗人肺癌噬菌体展示可溶性ScFv的筛选与鉴定及其序列测定

目的:制备抗人肺癌单链抗体(single chain Fv ferment antibody,ScFv),并对抗体生物学特性进行初步研究.方法:以人肺腺癌细胞系A2为抗原,对5 F-11杂交瘤细胞噬茵体抗体库进行富集和筛选.以人肺腺癌细胞系A2和正常人淋巴细胞为抗原,进行酶联免疫吸附试验,从富集后的噬菌体抗体库中筛选出只与A2细胞结合的阳性克隆.筛选的噬茵体克隆转染大肠埃希茵HB2151,得到可溶性单链抗体分泌克隆.可溶性抗体分泌克隆测序.应用 ELISA、竞争性ELISA、SDS-PAGE及蛋白质印迹法对其中的2A7-1克隆进行初步鏊定.结果:以肺腺癌细胞A2为抗原进行了4轮富集.进一步筛选得到18个仅识别A2细胞而与人淋巴细胞无反应的融合抗体分泌克隆.转染大肠埃希茵HB2151后筛选到能与A2细胞特异结合的可溶性抗体分泌克隆2A7-1.竞争性ELISA结果显示,5F-11能强烈抑制2A7-1与A2细胞的结合.SDS-PAGE蛋白质印迹法显示得到大小约为30×103的单链抗体.结论:通过噬菌体抗体技术成功分离到了鼠单抗5F-11的可溶性ScFv分泌克隆,为进一步的抗体应用研究奠定了基础.     

与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析

目的从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选与肺癌源性HSP70特异性结合的融合抗体。方法以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮筛选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测筛选出阳性菌株,再经PCR进一步鉴定,确定含有单链抗体基因的克隆并测序,测序结果通过GeneBank比对进行同源性分析。结果获得了1个特异性强的阳性噬菌体克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,确定为单链抗体片段。结论从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选到与HSP70特异性结合的具有功能活性的单链融合抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠定了基础。     

人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定

目的构建人源抗肝癌单链抗体基因噬菌体表面呈现文库。方法利用噬菌体表面呈现技术,构建基因文库,经过panning筛选富集后,用ELISA方法检验抗原结合活性。结果从30个噬菌体克隆中筛选到8个具有肝癌细胞株SMMC7721结合活性的阳性克隆。结论从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗肝癌单链抗体的策略是可行的。     

结肠癌单抗MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段的制备

背景与目的：MC5是一种特异性良好的针对人结肠癌的鼠源性单克隆抗体,而将鼠源性抗体小型化可使其用于在体研究时引起人抗鼠抗体反应的可能性大大降低。本研究的目的是制备MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段（ScFv)。方法：从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体的重,轻链可变区DNA（VH和VL DNA）,两者经linker DNA连接形成ScFvDNA,将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7辅助噬菌体感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv,以高表达MC5结合抗原的细胞株SW480对重组噬菌体抗体ScFv进行两轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现MC5 ScFv的噬菌体单克隆,经竞争ELISA对阳性克隆结合抗原的能力进行鉴定。结果：VH,VL和ScFvDNA分别约为340bp,320bp和750bp,在随机筛检的25个克隆中得到10个呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有3个,结论：用噬菌体呈现技术成功地制备了单抗MC5的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。     

抗CD47单克隆抗体制备及其促巨噬细胞吞噬作用鉴定

目的:制备可识别肿瘤细胞表达CD47蛋白的抗CD47单克隆抗体,并鉴定其抗肿瘤作用。方法:利用BL21(DE3)原核表达系统表达CD47胞外段蛋白,利用Ni-NTA层析纯化表达蛋白。免疫BALB/c小鼠,制备并筛选分泌抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株。利用正辛酸-硫酸铵沉淀方法纯化抗CD47单抗。利用流式细胞术检测纯化抗体的活性。利用巨噬细胞与肿瘤细胞共培养试验,检测抗CD47单抗的抗肿瘤作用。结果:表达并纯化了CD47胞外段蛋白,筛选到了分泌抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株—7D4,流式细胞术检测结果显示,抗体具有结合肿瘤细胞的活性,但是对不同肿瘤类型细胞的结合效率存在差异。巨噬细胞与肿瘤细胞共培养试验发现,利用抗体封闭肿瘤细胞CD47信号后,可以增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。结论:抗CD47单抗—7D4可以促进巨噬细胞的吞噬作用,具有潜在应用价值。     

嵌合轻链为模板导向筛选人源性抗肝癌抗体重链Fd片段

目的:利用噬菌体抗体库和导向选择技术,以抗HAb18G嵌合抗体轻链为模板,筛选人源性抗肝癌抗体Fd片段.方法:利用RT-PCR自肝癌患者外周血淋巴细胞中扩增全套人抗体重链Fd基因片段,克隆入含嵌合L链的展示载体pComb3X,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库.然后,利用大肠杆菌表达的非融合HAb18GE为抗原进行亲和筛选,利用pⅢ融合抗体的形式进行克隆鉴定,并对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测.结果:构建成功库容量为2×107PFU的杂合人-鼠噬菌体抗体库,利用非融合表达的HAb18GE进行6轮筛选.ELISA及流式细胞仪检测,其中7个克隆呈特异性阳性反应.其中克隆AP6-2和AP6-7亲和力较高,测序显示其基因序列相同,且与亲本抗体恒定区序列相同,属IgG2亚类,可变区属VH3家族.结论:通过本实验,利用嵌合轻链为模板,进行Fd片段替换,成功筛选到人源性抗体Fd片段.     

用噬菌体抗体库技术筛选单克隆抗体

用噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体是近年来抗体技术中的革命性进展，本文简要介绍了我们在这方面所进行的研究工作：从乳癌细胞免疫后的小鼠脾脏细胞和接种过HBsAg疫苗的志愿者的外周血淋巴细胞扩增出k链和Fd段基因，组装到Fab段噬菌体抗体表达载体pCOMB3中,分别建立了鼠源性和人源性噬菌体抗体库，以固相化的HBsAg和乳癌细胞为抗原．通过“吸附-洗脱-扩增”富集性筛选过程获得了鼠抗人乳癌细胞和人抗HBsAg的噬菌体抗体，并通过对表达载体的改造，在大肠杆菌表达出了可溶性的Fab段,对所获得的抗体Fab段进行了特异性、亲和力以及DNA序列的分析，显示噬菌体抗体库技术是一个行之有效的抗体制备手段。     

用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的单链抗体

目的:初步探索从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选肿瘤细胞抗体的技术策略.方法:通过两种方法,即2%多聚甲醛固定细胞筛选法(PF)及活细胞直接筛选法(NF),经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛过程,对食管癌KYSE-170细胞进行筛选,得到抗食管癌细胞的噬菌体抗体,完善了噬菌体抗体库筛选完整细胞的特异性抗体的技术策略.并且进一步制备了其可溶性抗体.结果:活细胞NF组的筛选阳性率高于2%多聚甲醛固定PF组,筛选特异性抗体的阳性率分别为25.00%和12.50%,两组的差异具有统计学意义.结论:利用单链大容量抗体库可以采用不同的筛选方法成功制备与肿瘤细胞结合的噬菌体抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

人表皮生长因子受体2模拟表位的筛选

目的:从噬菌体12肽库中筛选出人表皮生长因子受体2（Her2）的抗原模拟表位。方法:以曲妥珠单抗为靶分子,在噬菌体12肽库中进行3轮淘选,以ELISA方法及竞争抑制实验鉴定阳性克隆,并对阳性克隆株进行测序。结果:经过3轮淘选,与曲妥珠单抗结合的噬菌体得到了有效富集,回收率从（2.00×10-8）%增加到（2.87×10-5）%,ELISA显示20个克隆中筛选获得了18个与曲妥珠单抗具有较高亲和性的阳性噬菌体,对阳性克隆测序获得两种氨基酸序列:HTSSLWHLFRST、VHWDFRQWWQPS。结论:噬菌体展示技术可成功筛选到表皮生长因子2模拟表位,为探索乳腺癌的防治研究创造了条件。     

全人源抗MLAA-34单链抗体的筛选和鉴定

目的:抗体药物治疗是目前癌症治疗中很有前景的一种方法,利用前期实验得到的MLAA-34纯化蛋白作为抗原,在噬菌体抗体库中进行筛选得到抗MLAA-34的单链抗体,进行测序并鉴定其亲和力。方法:包被纯化的MLAA-34抗原蛋白于96孔板上,封闭过夜,加入1×1012 cfu噬菌体抗体库,4 ℃结合4 h,洗脱,洗脱后的噬菌体感染大肠杆菌TG1扩增,经过3轮淘选,淘选得到的克隆再进行Phage-ELISA的鉴定,筛选得到阳性克隆。结果:纯化的MLAA-34作为抗原,经过在噬菌体抗体库中的3轮固相筛选,噬菌体的回收得到富集,洗脱的噬菌体产率显示回收率逐级增加,富集倍数约1 000倍。最后一轮筛选后挑选出188个重组噬菌体克隆,His标签蛋白作为对照蛋白,应用Phage-ELISA筛选出33个阳性克隆。结论:利用得到的MLAA-34蛋白为目标抗原,对全人源噬菌体抗体库进行淘选,应用Phage-ELISA法挑选出和MLAA-34抗原结合力的阳性噬菌体,为抗MLAA-34抗体的制备奠定了基础。     

107. 体外致敏鼻咽癌患者B细胞构建抗独特型噬菌体抗体库

根据Jerne免疫网络理论,抗独持型抗体（Ab2β）在三维空间能够模拟Ab1所识别的抗原结构,可以替代肿瘤抗原作为抗肿瘤疫苗,激发机体体液免疫和细胞免疫应答。抗独特型抗体的这种分子模拟功能在肿瘤免疫治疗领域已展示出诱人的前景。但因杂交瘤技术制备的单克隆抗独特型抗体为鼠源性抗体,临床应用受到极大的限制。为解决这一难题,本实验采用体外致敏法结合噬菌体呈现技术构建鼻咽癌抗独特型噬菌体抗体库。以本室制备的抗鼻咽癌单抗FC2（Ab1）为免疫原,体外致敏并用EBV转化10例鼻咽癌患者PBMC,经Sandwich ELISA检测其中8例有Ab2产生。抽提致敏、转化的鼻咽癌患者B细胞的总RNA,用cDNA合成试剂盒反转录为cDNA,经多次PCR扩增出5种VH（γ、μ)和9种VL（κ、λ）基因,经简并组成15种ScFv基因,在体外与载体fuse5连接,电导入大肠杆菌MC1061,经四环素抗性筛选,得到库容为1．1×107的初级噬菌体抗体库。随机挑取20个菌落检查噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为70％。这不仅为进一步用抗鼻咽癌单抗亲和筛选具有内影像特点的抗独特型单链抗体（Ab2βScFv）奠定了基础,而且说明外致敏法结合噬菌体抗体库技术制备人源化Ab2βScFv的策略是完全可行的。     

基因工程改造鼠源性抗人脑胶质瘤单克隆抗体的初步报告

为了提高人脑胶质瘤导向诊治中单抗载体的临床实用价值，必须把鼠源性大分子单抗改造成人源化、小分子单抗。采用ＲＴ－ＰＣＲ法，从人脑胶质瘤单抗杂交瘤细胞系ＳＺ３９中克隆出３４８ｂｐ的重链可变区（ＶＨ）和３１８ｂｐ的轻链可变区（ＶＬ）ｃＤＮＡ片断。又采用重组ＤＮＡ技术，将ＶＨ和ＶＬ与人免疫球蛋白ＩｇＧ１重链ＣＨ１和轻链κ恒定区基因拼接，或将ＶＨ和ＶＬ以通用Ｌｉｎｋｅｒ直接连接，分别构建表达载体ｐＨＥＮ１－ＳＺ３９Ｆａｂ／Ｈｕ（嵌合抗体）和ｐＨＥＮ１－ＳＺ３９ＳｃＦｖ（单链抗体）。而后将此二载体转染至非抑制性大肠杆菌ＨＢ２１５１中表达。结果表明，两者的表达产物均为可溶性，以ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔ－ｅｒｎｂｌｏｔ法检测，均与人脑胶质瘤体外细胞系ＳＨＧ４４细胞膜表面抗原发生特异结合，与亲本抗体ＳＺ３９特异识别１８００００膜抗原的条带相一致。该结果显示，基因工程改造的人源化、小分子单抗为今后的临床应用展示了美好的前景。     

全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

目的：我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库，本文目的在于对该抗体库进行鉴定，筛选食管癌抗体，同时对抗体的活性进行检测。方法：PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率；1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和NotI双酶切质粒的结果；先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选；将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化；用SDS—PAGE测定该抗体的相对分子量；用Western blot鉴定该抗体；用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果：seFv基因插入率为91．7％；酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中，食管癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第4轮为第1轮的141倍；SDS—PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色；在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织，而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性，能与Eca109细胞结合，而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论：利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体，且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。     

人白介素24单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗白细胞介素24（Interleukin 24,IL-24）的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法：应用分子生物学技术,构建含人IL-24编码序列的原核表达载体,表达并纯化了人IL-24融合蛋白。用纯化人IL-24融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,采用免疫印迹及免疫组化染色对抗体的特异性进行了鉴定。结果：获得3株能稳定分泌抗IL-24单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G2,3F4,4A6。通过免疫印迹及免疫组化染色检测显示,这3株单抗均能够与IL-24特异性结合。结论：成功制备抗IL-24单克隆抗体,为进一步探索IL-24在抗肿瘤中的作用机制奠定了基础。     

人白介素24单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗白细胞介素24(Interleukin 24,IL-24)的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:应用分子生物学技术,构建含人IL-24编码序列的原核表达载体,表达并纯化了人IL-24融合蛋白。用纯化人IL-24融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,采用免疫印迹及免疫组化染色对抗体的特异性进行了鉴定。结果:获得3株能稳定分泌抗IL-24单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G2,3F4,4A6。通过免疫印迹及免疫组化染色检测显示,这3株单抗均能够与IL-24特异性结合。结论:成功制备抗IL-24单克隆抗体,为进一步探索IL-24在抗肿瘤中的作用机制奠定了基础。     

抗大肠癌大鼠单克隆抗体R19的建立和特性

用大鼠杂交瘤技术，将人盲肠癌Ｈｃｅ－８６９３细胞免疫ＬＯＵ／ｃ大鼠，取其脾细胞与大鼠骨髓瘤ＩＲ９８３Ｆ细胞融合，共产生６２０株杂交瘤从中筛选出分泌抗人大肠癌单抗杂交瘤１９５株，阳性率为３１％。其中Ｒ１９株分泌ＩｇＧ２ｂ型抗体，与人大肠癌Ｈｃｅ－８６９３ｔ ＨＴ０２９ｘｌｅｑｋｇｆ 阳性反应，与人鼻咽癌ＣＮＥ２细胞有弱阳性交叉反应，与正常人胚肺２ＢＳ细胞，人肝癌、等共１５种细胞地交叉反应，显著较强的