成纤维细胞介导的人α型干扰素基因疗法与过继免疫化疗联合治疗人肝癌的实验研究

作者以皮下接种人肝细胞癌细胞ＳＭＭＣ７７２１的裸鼠为荷瘤模型，由人外周血单个核细胞经体外ＩＬ－２和丝裂霉素Ｃ灭活的人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１共同刺激培养后激活的杀伤细胞（ＡＫ），研究了将成纤维细胞介导的人ＩＦＮ－α基因疗法与ＩＬ－２／ＡＫ／阿霉素过继免疫化疗联合应用后对肝癌的治疗作用。结果表明：（１）给肝癌裸鼠单独腹腔埋植人ＩＦＮ－α基因转移的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α￣＋）就能显著抑制肝癌（皮下）体内生长，使荷瘤裸鼠存活期明显延长；（２）在腹腔埋植ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α￣＋之后再静脉注射ＡＫ细胞、腹腔内注射ＩＬ－２，发现荷瘤裸鼠的皮下肿瘤结节生长抑制作用更明显；（３）将ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α￣＋与ＩＬ－２／ＡＫ／阿霉素联合应用后，对肝癌裸鼠的治疗效果更佳。     

人原发性肝癌基因治疗的实验研究：肿瘤坏死因子基因的初步应用

将含人肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ的不同逆转录病毒载体（ＬＮＳ－ｔｎｆα、Ｌ－ｔｎｆαＳＮ及ＬＮＣ－ｔｎｆα）和质粒型真核细胞载体（ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα），分别用磷酸钙法导入肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１中，观察ＴＮＦ的表达水平。结果：重组质粒型表达载体ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα表达好，２４小时开始分泌ＴＮＦα（５０Ｕ／ｍｌ），４８￣７２小时达最高值（９０Ｕ／ｍｌ），９６小时后下降（４０Ｕ／ｍｌ）。将ｐ     

癌性渗出液中IL—2,IL—6,IL—8,TNFα和IFNγ活性分析

目的与方法 应用ＥＬＩＳＡ法研究了１８例癌性渗出液（ＭＯＦ）中内源性ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＦＮγ和ＴＦＮα的生物学活性,并与恶性肿瘤病人（ＭＴＤ）血清、正常人、结核性胸膜炎（ＴＢＰ）和肝硬化病人（ＣＲＳ）进行了比较分析。结果 ＭＴＤ血清中ＩＬ－６活性高于与正常成人组（Ｐ〈０．０５）;ＩＬ－２和ＩＦＮγ活性亦低下（Ｐ〈０．５）。ＭＴＤ血清中ＩＬ－２、ＩＬ－６ＴＮＦα活性显著低于ＴＢＰ（Ｐ〉     

癌性渗出液中IL-2、IL-6、IL-8、TNFα·论著·和IFNγ活性分析

目的与方法应用ＥＬＩＳＡ法研究了１８例癌性渗出液（ＭＯＦ）中内源性ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＦＮγ和ＴＦＮα的生物学活性,并与恶性肿瘤病人（ＭＴＤ）血清、正常人、结核性胸膜炎（ＴＢＰ）和肝硬化病人（ＣＲＳ）进行了比较分析。结果ＭＴＤ血清中ＩＬ－６活性高于与正常成人组（Ｐ＜０．０５）;ＩＬ－２和ＩＦＮγ活性亦低下（Ｐ＜０．５）。ＭＴＤ血清中ＩＬ－２、ＩＬ－６ＴＮＦα活性显著低于ＴＢＰ（Ｐ＜０．００１）;ＩＬ－８和ＩＦＮγ活性亦降低（Ｐ＜０．０５）。ＭＯＦ中的ＩＬ－６、ＩＦＮγ水平显著高于ＴＢＰ组（Ｐ＜０．０１;Ｐ＜０．０５）;ＩＬ－２却明显降低（Ｐ＜０．０５）。ＭＴＤ血清中ＩＬ－２、ＩＬ－６低于ＣＲＳ组（Ｐ＜０．０５）;ＭＯＦ中ＩＬ－６、ＩＮＦγ水平高于ＣＨＡＤ组（Ｐ＜０．００１;Ｐ＜０．０５）;ＩＬ－２和ＩＬ－８则低于ＣＲＳ组（Ｐ＜０．０５;Ｐ＜０．０１）。结论ＭＴＤ血清和ＭＯＦ中ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８和ＩＦＮγ活性反映了ＭＴＤ抗肿瘤免疫的功能状态。ＩＬ－６和ＩＬ－８活性对于ＭＴＤ预后的估计具有重要的意义。     

肿瘤病人化疗、免疗及免疫化疗前后NK－IL－2－IFN－r系统变化

本文观察了４６例中晚期肿瘤病人化疗、免疗（抗瘤ｉＲＮＡ及Ｓ－ＴＦ）及免疫化疗前后ＮＫ－ＩＬ－２－ＩＦＮ－ｒ系统及ＷＢＣ等变化。结果发现：（１）肿瘤病人ＮＫ、ＩＬ－２及ＩＦＮ－ｒ活性均显著低于正常人；（２）化疗后除ＷＢＣ明显降低外，其它指标化疗前后均无明显变化；（３）免疫及免疫化疗后各免疫指标均较治疗前显著增加；（４）免化组各免疫指标及ＷＢＣ明显高于化疗组，其中ＩＬ－２及ＩＦＮ－ｒ活性还明显高于免疫组，但免疫组仅ＩＬ－２活性及ＷＢＣ明显高于化疗组。本研究结果表明，抗瘤ｉＲＮＡ及Ｓ－ＴＦ不仅可恢复肿瘤宿主的免疫力，而且与化疗联用，还可能降低化疗的毒副反应，协调肿瘤病人ＮＫ－ＩＬ－２－ＩＦＮ－ｒ系统的抗癌功能。     

抗肝癌iRNA及S-TF对肝癌患者LAK活性,IL-2活性及IL-2R表达的…

观察抗肝癌ｉＲＮＡ及Ｓ－ＴＦ对原发性肝癌（ＰＨＣ）患者外周血ＬＡＫ、ＩＬ－２活性及ＩＬ－２Ｒ表达的影响。发现ＰＨＣ病人ＬＡＫ、ＩＬ－２活性及ＩＬ－２表达均明显低于正常人，且ＩＬ－２与ＬＡＫ间呈正相关;经抗肝癌ｉＲＮＡ及Ｓ－ＴＦ治疗后，ＰＨＣ病人的上述指标及ＷＢＣ数均较治疗前显著升高。提示ＰＨＣ病人的免疫功能低下或紊乱可能与肿瘤的发生及发展有关，应用抗肝癌ｉＲＮＡ及Ｓ－ＴＦ可给肿瘤宿主转移介导其细胞     

肿瘤病人化疗、免疗及免疫化疗前后NK－IL－2－IFN－r系统变化

本文观察了４６例中晚期肿瘤病人化疗、免疗（抗瘤ｉＲＮＡ及Ｓ－ＴＦ）及免疫化疗前后ＮＫ－ＩＬ－２－ＩＦＮ－ｒ系统及ＷＢＣ等变化。结果发现：（１）肿瘤病人ＮＫ、ＩＬ－２及ＩＦＮ－ｒ活性均显著低于正常人；（２）化疗后除ＷＢＣ明显降低外，其它指标化疗前后均无明显变化；（３）免疫及免疫化疗后各免疫指标均较治疗前显著增加；（４）免化组各免疫指标及ＷＢＣ明显高于化疗组，其中ＩＬ－２及ＩＦＮ－ｒ活性还明显高于免疫组，但免疫组仅ＩＬ－２活性及ＷＢＣ明显高于化疗组。本研究结果表明，抗瘤ｉＲＮＡ及Ｓ－ＴＦ不仅可恢复肿瘤宿主的免疫力，而且与化疗联用，还可能降低化疗的毒副反应，协调肿瘤病人ＮＫ－ＩＬ－２－ＩＦＮ－ｒ系统的抗癌功能。     

IFN—α和IL—2联合激活的脐血对K562细胞的杀伤和净化作用研究

目的 探讨体外干扰素α（ＩＦＮ－α）联合白细胞介素２（ＩＬ－２）激活的脐血对慢性髓性白血病细胞株Ｋ５６２细胞的杀伤和净化作用。方法 采用细胞培养法和反转录聚合酶链反应法进行研究。结果 ＩＬ－２激活３ｄ的脐血对Ｋ５６２细胞具有显著的杀伤和净化作用,加用ＩＦＮ－α后这种作用得到明显增强。ＩＬ－２单用或与ＩＦＮ－α联合对脐血ＣＦＵ－ＧＭ未见明显抑制作用。结论 ＩＦＮ－α可增强ＩＬ－２激活脐血对Ｋ５６２的     

人原发性肝癌基因的实验研究───肿瘤坏死因子基因的初步应用

将含人肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ的不同逆转录病毒载体（ＬＮＳ－ｔｎｆα、Ｌ－ｔｎｆαＳＮ及ＬＮＣ－ｔｎｆα）和质粒型真核细胞载体（ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα），分别用磷酸钙法导入肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１中，观察ＴＮＦ的表达水平。结果：重组质粒型表达载体ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα表达好，２４小时开始分泌ＴＮＦα（５０Ｕ／ｍｌ），４８～７２小时达最高值（９０Ｕ／ｍｌ），９６小时后下降（４０Ｕ／ｍｌ）。将ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα重组ＤＮＡ用磷酸钙包裹后直接进行瘤内注射，发现裸鼠外周血ＴＮＦα水平有一过性增高，３周后测量瘤体大小，发现实验组的肿瘤体积明显小于对照组（２．５±１．６ｃｍ比３．２±１．８ｃｍ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０５），实验组荷瘤裸鼠的生存时间亦明显延长（４４．０±３．３ｄ比２８．２±２．０ｄ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０１）。结果表明，应用ＴＮＦα基因转移进行肝癌的基因治疗是一条值得探索的途径。     

克隆化人肝癌裸鼠移植瘤株的建立及其转移性状观察

应用单个细胞克隆化技术，从已建系的人肝癌细胞（ＳＭＭＣ－７７２１）中选育出３个亚系７７２１－ＣＡ，７７２１－ＣＢ，７７２１－ＣＳ（ＣＡ、ＣＢ、ＣＳ），并进行扩大培养，将上述各亚系肝癌细胞接种到裸鼠体内，成瘤率与自发转移率以ＣＳ组最高，ＣＢ组最低。主要的转移器官是肺。原发灶和转移灶肿瘤形态结构一致。ＣＳ细胞形态及其接种的裸鼠移植瘤形态结构和ＳＭＭＣ－７７２１母系细胞基本相似。用ＡＢＣ免疫酶标法检测ＨＢｓＡｇ、ｋｅｒａｔｉｎ、ＡＦＰ、Ｈ－ｒａｓ、Ｃ－ｅｒｂ－２、Ｐ５３癌基因蛋白等肿瘤标记物，ＣＳ组裸鼠移植瘤对Ｈ－ｒａｓ、Ｃ－ｅｒｂ－２癌基因蛋白呈阳性反应，对ＡＦＰ、Ｐ５３呈弱阳性反应，而ＣＢ组裸鼠移植瘤仅对Ｋｅｒａｔｉｎ、Ｃ－ｅｒｂ－２呈弱阳性反应，对其它肿瘤标记物均呈阴性反应。     

逆转录病毒介导IL－2基因导入肝癌细胞的研究

利用逆转录病毒载体系统ＰＡ３１７／ＬＮＣ－ＩＬ－２所产生的含有ＩＬ－２基因及新霉素抗性基因（ｎｅｏｒ）的重组病毒，经共培养转染ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞株。ＩＬ－２基因受巨细胞病毒早期启动子调控，转染后的细胞置于含新霉素类毒性药物Ｇ４１８（４００ｕｇ／ｍｌ）培养基内培养、筛选３０天，结果果转染率约为１～２％。对存活下来的转染有ＩＬ－２基因和新霉素抗性基因的细胞形态和生长情况进行观察，同时从水平及蛋白质水平对外源性基因的转录和翻译进行检测。结果表明：ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞在ＩＬ－２基因转染前后形态及生长情况无明显变化；培养上清活性检测发现转染后为转染前的２０～３０倍；逆转录ＰＣＲ分析显示转染后的ＩＬ－２ｍＲＮＡ量明显高于转染前。研究表明我们已成功地将ＩＬ－２基因导入肝癌细胞并获得持续、稳定、高效表达。     

淫羊藿甙逆转转化生长因子β_2免疫抑制作用的抗肿瘤研究

目的：研究淫羊藿甙（ＩＣＡ）对ＰＧ细胞分泌转化生长因子β２（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒβ２,ＴＧＦβ２）的影响、ＩＣＡ逆转ＴＧＦβ２介导的免疫抑制作用及其机制。方法：ＭＴＦ法检测细胞增殖、杀伤活性,ＲＴ－ＰＣＲ检测ＴＧＦβ２、穿孔素,流式细胞术检测ＴＧＦβ２、ＩＬ－２Ｒα水平。结果：ＩＣＡ可抑制ＰＧ细胞中ＴＧＦβ２的蛋白和ｍＲＮＡ表达,能够逆转受ＴＧＦβ２抑制的ＬＡＫ和ＣＤ３ＡＫ细胞的杀伤活性,并能部分恢复受ＴＧＦβ２抑制的ＬＡＫ细胞表面ＩＬ－２Ｒα表达和ＣＤ３ＡＫ细胞内穿孔素ｍＲＮＡ水平,以及ＣＤ３ＡＫ细胞的增殖活性。结论：淫羊藿甙通过抑制肿瘤细胞免疫抑制因子ＴＧＦβ２的产生,增强免疫效应细胞的杀伤活性等机制而发挥抗肿瘤作用。     

COMBINED IL-2/IL-3 GENE THERAPY FOR G422 MOUSE GLIOBLASTOMA BY INTRATUMORAL INJECTION OF RECOMBINANT ADENOVIRUSES

ＣＯＭＢＩＮＥＤＩＬ２／ＩＬ３ＧＥＮＥＴＨＥＲＡＰＹＦＯＲＧ４２２ＭＯＵＳＥＧＬＩＯＢＬＡＳＴＯＭＡＢＹＩＮＴＲＡＴＵＭＯＲＡＬＩＮＪＥＣＴＩＯＮＯＦＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳＥＳ１ＨｏｎｇＢｏ２洪波ＣａｏＸｕｅｔａｏ３曹雪涛Ｙｕ...     

不同类型骨髓瘤细胞中IL-6信号途径活化及生物学意义

目的：研究具有不同ＩＬ－６反应性的人骨髓瘤细胞中两条ＩＬ－６信号转导途径ＪＡＫ／ＳＴＡＴ和Ｒａｓ／ＭＡＰＫ／ＮＦ－ＩＬ－６的诱导活化情况及生物学意义。方法：首先采用ＭＴＴ方法观察ＩＬ－６刺激ＸＧ－７、ＫＭ－３、Ｕ２６６和Ｓｋｏ－００７４株ＭＭ细胞后对其生长产生的影响;进而分别采用凝胶阻滞电泳（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ,ＥＭＳＡ）和免疫沉淀（ｉｍｍｕｎ     

自体可溶性肿瘤抗原协同IL-2诱导外周血PBMC增殖及杀瘤

探讨自体可溶性肿瘤抗原（ＴＳＡ）与ＩＬ┐２共同诱导ＰＢＭＣ增殖及杀瘤作用。方法分三组用ＡＰＡＡＰ法观察细胞表型，ＭＴＴ法测定细胞增殖及杀瘤活性（靶细胞为ＭＮＫ４５系人胃低分化腺癌细胞）。结果培养第７天ＴＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）协同ＩＬ┐２诱导ＰＢＭＣ增殖显著高于单独ＩＬ┐２诱导（Ｐ＜０．０１）。且ＣＤ＋８及ＣＤ＋２５表达率增高，差异有显著性（Ｐ＜０．０１０，当效／靶比为８０∶１时ＩＬ┐２诱导的ＰＢＭＣ杀瘤活性为４８．６％，而１０μｇ／ｍｌＴＳＡ协同诱导ＰＢＭＣ杀瘤活性为８６．３％。结论为研究ＴＡＫ细胞提供了实验依据，提示该类细胞具有临床过继免疫治疗应用的潜能     

甲氰咪呱对鼠体内IL—2／LAK抗肿瘤作用的影响

为探讨甲氰咪呱（ＣＩＭ）对鼠体内ＩＬ２／ＬＡＫ抗肿瘤作用的影响,将Ｂ１６细胞经尾静脉接种于Ｃ５７ＢＬ／６小鼠,第３ｄ分别应用ＤＨａｎｋｓ液、ＣＩＭ（１０ｍｇ／ｍｌ）＋ＣＩＭ（１μｇ／ｍｌ）诱导的脾细胞,ＩＬ２＋ＩＬ２（５００Ｕ／ｍｌ）诱导的ＬＡＫ细胞,ＣＩＭ（１０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ２＋ＣＩＭ（１μｇ／ｍｌ）和ＩＬ２（５００Ｕ／ｍｌ）共同诱导的ＬＡＫ细胞,观察鼠肺转移结节和生存期。结果显示,单用ＣＩＭ并不能减少肺转移结节和延长生存期;ＣＩＭ＋ＩＬ２／ＬＡＫ治疗组与ＩＬ２／ＬＡＫ治疗组相比,可减少肺转移结节（Ｐ＜０．０５）和显著延长生存期（Ｐ＜０．０１）。结果表明,ＣＩＭ能够增强ＩＬ２／ＬＡＫ抗肿瘤作用,可用于治疗肿瘤。     

低剂量环磷酰胺增强MHC I类限制性肿瘤抗原多肽冲击致敏 …

目的：研究低剂量环磷酰胺（Ｃｙ）联合ＭＨＣ Ｉ类限制性肿瘤抗原多肽Ｍｕｔｌ致敏、白细胞介素２（ＩＬ－２）基因修饰的树突状细胞（ＤＣｓ）对转移性肺癌小鼠的治疗作用及其免疫学机理。方法：制备小鼠骨髓来源的ＤＣｓ,用转移性Ｌｅｗｉｓ肺癌特异性多肽Ｍｕｔｌ预激经ＩＬ－２基因修饰的ＤＣｓ联合低剂量Ｃｙ治疗转移性肺癌小鼠。通过ＦＡＣＳ分析其脾细胞内Ｔ淋巴细胞比例的变化,＾５１Ｃｒ释放法检测ＣＴＬ和ＮＫ细胞杀伤     

Ａｄ-ＩＮＧ４抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长的体内实验研究

目的　研究携带ＩＮＧ４基因的重组腺病毒（Ａｄ-ＩＮＧ４）对人肝癌细胞株ＳＭＭＣ-７７２１移植瘤生长的抑制作用及其潜在的分子机制。方法　将扩增的Ａｄ-ＩＮＧ４感染ＳＭＭＣ-７７２１细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测Ａｄ-ＩＮＧ４在ＳＭＭＣ-７７２１细胞中的转录。用ＳＭＭＣ-７７２１细胞建立裸鼠人肝癌移植瘤模型,予Ａｄ-ＩＮＧ４（１×１０^９ｐｆｕ／ｍｌ）５０μｌ对移植瘤瘤体注射治疗,观察肿瘤生长变化;３周后处死裸鼠,摘除瘤体,称瘤重;免疫组化法检测ｐ２１、ＣＯＸ-２、Ｆａｓ、Ｂｃｌ-２、Ｂａx、Ｃａｓｐａｓｅ-３、ＶＥＧＦ、ＣＤ３４等因子的表达。结果　Ａｄ-ＩＮＧ４在ＳＭＭＣ-７７２１细胞中成功表达;Ａｄ-ＩＮＧ４对裸鼠人肝癌移植瘤有明显的生长抑制作用,Ａｄ-ＩＮＧ４组瘤体显著减小（Ｐ＜０.０１）,抑瘤率达４１.６４％;免疫组化检测显示,Ａｄ-ＩＮＧ４抑癌的分子机制可能与上调ｐ２１、Ｆａｓ、Ｂａｘ和Ｃａｓｐａｓｅ-３的表达及下调ＣＯＸ-２、Ｂｃｌ-２、ＶＥＧＦ和ＣＤ３４的表达有关。结论　Ａｄ-ＩＮＧ４能有效抑制ＳＭＭＣ-７７２１裸鼠人肝癌移植瘤的生长,其机制可能通过抑制肿瘤细胞生长、血管形成和激活细胞凋亡等多个途径共同发挥抑癌效应。     

逆转录病毒介导IL—2基因导入肝癌细胞的研究

利用逆转录病毒载体系统ＰＡ３１７／ＬＮＣ－ＩＬ－２所产生的含有ＩＬ－２基因及新霉素抗性基因的重组病毒，经共培养转染ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞株。ＩＬ－２基因受巨细胞病毒早期启动子调控，转染后的细胞置于含新霉素类毒性药物Ｇ４１８（４００ｕｇ／ｍｌ）培养基内培养、筛选３０天，结果果转染率约为１￣２％。对存活下来的转染有ＩＬ－２基因和新霉素抗性基因的细胞形态和生长情况进行观察，同时从水平及蛋白质水平对外     

LiCl协同IL—2对脐血有核细胞增殖,凋亡及NK活性的影响

目的 探讨ＬｉＣｌ、ＩＬ－２对脐血有核细胞（ＣＢＮＣ）的细胞周期、增殖、凋亡及ＮＫ生的影响,为临床应用提供依据。方法 （１）＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定ＬｉＣｌ、ＩＬ－２、ＬｉＣｌ＋ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ对ＣＢＮＣ细胞增殖作用的影响。（２）用流式细胞仪测定ＬｉＣｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ对ＣＢＮＣ细胞周期及凋亡的影响。（３）测定ＬｉＣｌ、ＩＬ－２、ＬｉＣｌ＋ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ对ＣＢＮＣ的