BMP2/β-TCP-HA复合支架体内构建组织工程软骨的实验研究

目的 探讨以骨形态发生蛋白2(BMP2)/β磷酸三钙-透明质酸(β-TCP-HA)复合支架在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性.方法 分别构建BMP2/β-TCP-HA(实验组),BMP2/β-TCP(对照组)及β-TCP(空白组)支架.分离培养大鼠间质干细胞(MSCs)至三代,利用负压吸引将MSCs作为种子细胞分别接种于各组支架内,并植于裸鼠皮下.于术后12周观察其成软骨效果并对修复组织行大体,组织学及免疫组化观察.结果 术后12周实验组支架降解基本完全,能形成丰富的软骨组织,软骨细胞外基质丰富,糖胺多精(GAG)及Ⅱ型胶原免疫组化染色均旱强阳性;对照组支架大部降解,支架内形成岛状软骨增生;GAG及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性;空白组支架部分降解,以纤维组织和脂肪组织为主;仅在支架边缘见少最软骨组织,GAG及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阴性.结论 BMP2/β-TCP-HA复合支架为MSCs提供了一条可能有效的关节软骨修复途径,是目前软骨组织工程较为理想的细胞支架材料.     

采用纤维蛋白凝胶种植技术体外构建组织工程软骨

目的 探讨有效体外构建高质量组织工程软骨的细胞种植技术.方法 将分离、培养的兔第1代软骨细胞分别通过纤维蛋白凝胶种植技术(实验组)及常规种植方法(对照组)接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架.体外培养3周后收获组织工程软骨,行大体观察,组织切片,定量检测氨基糖胺聚糖(GAG)、DNA含量及Ⅱ型胶原染色面积.结果 实验组较对照组构建的组织工程软骨体积更大、更有弹性和光泽;其Ⅱ型胶原染色面积、GAG、DNA含量均高于对照组(P＜0.05).结论 与传统种植方法比较,采用纤维蛋白凝胶种植技术能在体外形成更高质量的组织工程软骨.     

三种不同载体材料体外生物相容性的比较

目的探讨纳米晶羟基磷灰石胶原复合材料(NHAC)、非纳米晶羟基磷灰石胶原复合材料(HAC)和珊瑚羟基磷灰石(CHA)的体外生物相容性,为组织工程提供理想的细胞基质载体材料。方法将人骨髓基质干细胞分别与上述三种载体材料体外复合培养,应用倒置显微镜、扫描电镜、四唑盐比色试验(MTT法)及碱性磷酸酶(ALP)活性测定,对材料上复合培养的细胞进行形态学和功能测定。结果骨髓基质干细胞能在NHAC和CHA两种材料上良好地黏附、增殖和生长。细胞的活性和碱性磷酸酶活性未受到材料的影响;而HAC不利于人骨髓基质干细胞的黏附、增殖,并使碱性磷酸酶活性降低。结论NHAC和CHA两种材料具有良好的生物相容性,可作为骨组织工程理想的骨替代材料;HAC不适合做细胞外基质。     

辛伐他汀组织工程骨材料的制备及性能研究

目的:探讨制备的辛伐他汀组织工程骨复合支架材料的理化性质及力学强度.方法:将同种异体骨、Ⅰ型胶原、辛伐他汀进行系列理化处理,制备成单纯组织工程骨材料、胶原组织工程骨材料、辛伐他汀组织工程骨复合材料.制备后的材料用扫描电镜观察其形貌特征,用X线衍射分析材料成分,并对材料的力学性能进行分析测定.结果:单纯组织工程骨材料具有天然骨的网状孔隙系统;胶原组织工程骨材料具有天然骨的网状孔隙系统,微孔表面覆盖胶原膜;辛伐他汀组织工程骨复合材料具有骨组织的天然网状孔隙系统,微孔表面可见胶原膜覆盖;单纯组织工程骨材料、胶原组织工程骨材料、辛伐他汀组织工程骨复合材料主要成分均为羟基磷灰石[HA,Ca10(OH)2(PO4)6],3种材料的孔径大小、空隙率、弯曲强度和压缩强度差异无统计学意义(P＞0.05).结论:辛伐他汀组织工程骨复合材料与其他2种材料理化性质和力学强度相同,可作为一种有效的天然组织工程骨支架材料.     

骨髓间充质干细胞与β-磷酸三钙多孔陶瓷体外复合培养实验研究

目的:研究犬骨髓间质干细胞(BMSCs)与β-磷酸三钙多孔陶瓷(β-TCP)的体外复合培养。方法:体外培养BMSCs作为种子细胞,β-TCP作为组织工程支架,制备β-TCP-BMSCs复合物,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化及细胞在材料孔隙区的贴附及生长情况,流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原CD44、CD45表达情况。结果:相差倒置显微镜下观察:原代、第2代、第3代及第4代培养的细胞形态,贴壁细胞逐渐由成纤维细胞样向多形化方向转化(三角形、菱形等),最终重叠生长形成结节状;将细胞接种于材料上进行培养,见孔隙间有大量交叠细胞生长增殖。扫描电镜下观察:在材料表面细胞呈梭形,并融合成片状,表面见丝状突起,在孔隙边缘的细胞有大量胶原和细胞外基质分泌。流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞表面抗原CD44阳性表达率(89.12±1.57)%,CD45阳性表达率为(2.32±0.45)%。结论:β-TCP与细胞有较好的亲和力,能够为基质细胞增殖、分化和成骨提供自然的三维空间,可作为组织工程的支架材料应用于骨和软骨缺损的修复。     

盐酸四环素缓释微球对大鼠成骨细胞活性的影响

目的 观察盐酸四环素缓释微球对体外培养的成骨细胞活性的影响.方法 体外分离培养SD大鼠成骨细胞并通过形态学观察、碱性磷酸酶(ALP)钙-钴法染色鉴定其细胞生物学特征;将盐酸四环素聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)微球、盐酸四环素分别与成骨细胞共培养,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各实验组成骨细胞的增殖情况,通过碱性磷酸酶活性测定法检测各实验组成骨细胞中ALP的活性,免疫组化Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ type)染色观察各实验组成骨细胞中Ⅰ型胶原的表达情况.结果 盐酸四环素-PLGA微球能显著促进SD大鼠成骨细胞的增殖,同时增强了ALP的表达,其效应持续时间高于盐酸四环素组和空白对照组,Ⅰ型胶原在3组细胞中的表达无显著差异.结论 制备的盐酸四环素-PLGA微球具有缓释促进成骨细胞增殖和增加ALP活性的作用,在骨创伤的修复重建治疗中具有潜在的应用价值.     

应用组织工程骨-软骨复合组织块修复猪软骨缺损

目的 比较应用组织工程骨-软骨复合组织块与单纯组织工程软骨修复猪膝关节软骨缺损的疗效.方法 用软骨细胞和成骨细胞构建组织工程软骨和组织工程骨,再将两者缝合形成骨-软骨复合组织块.在12只猪双侧股骨内髁负重区制造直径8mm的软骨缺损24个,并均分为组织工程骨-软骨复合组织块修复(A)组、组织工程软骨修复(B)组和空白支架(C)组.6个月后对修复部位行大体观察和组织学观察,免疫组化法检测Ⅱ型胶原的表达,并测定新生软骨的力学性能和糖胺聚糖(GAG)含量.结果 A组缺损区被新生透明软骨修复,新生软骨中的圆形细胞分布均匀.A组缺损区的新生软骨弹性模量和GAG含量高于B组.结论 组织工程骨-软骨复合组织块修复软骨缺损的效果明显优于组织工程软骨.     

应用富含血小板血浆构建组织工程骨的研究

目的探究富含血小板血浆（PRP）是否能成为接种骨髓间充质干细胞（BMSCs）于3D支架中的有效媒介,是否具有促进骨组织再生、新生骨成熟及血管化的作用,为组织工程骨的构建策略及动物实验和临床应用提供理论依据。方法体外培养新西兰兔BMSCs至第三代作为种子细胞,分别应用PRP组、乏血小板血浆（PPP组）重悬BMSCs,双相接种法构建细胞/支架复合体,另设对照组,通过检测支架内DNA含量、碱性磷酸酶（ALP）含量,对比细胞的接种效率、增殖和分化情况。结果 PRP组的成骨量较PPP组和对照组显著（P〈0.05）。结论用PRP介导的双相接种法可以促进BMSCs在细胞/支架复合物中增殖并向成骨分化;PRP双相接种法是一种可行的构建组织工程骨的方法,具有很大的潜力和广阔的应用前景。     

重组人骨形态发生蛋白-7体内外生物学活性研究

采用体外、体内两种方法同时测定原核表达重组人BMP 7(rhBMP 7)的生物学活性 ,建立rhBMP 7活性测定的标准并为推广其临床应用提供依据。在体外 ,PNPP底物比色法和MTT比色法结果表明 ,10倍、10 0倍稀释上清组与细胞共同培养 72h后碱性磷酸酶 (ALP)水平和活细胞增殖数明显高于阴性对照组 (P <0 .0 5 ) ,而与标准品无显著性差异 (P >0 .0 5 )。在体内 ,将rhBMP 7植入小鼠肌间隙后 3周 ,见软骨岛和编织骨生成 ;而将rhBMP 7与胶原载体复合后植入 ,可见大量骨小梁、骨髓腔和板层骨 ,血管和骨髓丰富 ;成骨率均为8/ 8。ALP水平和钙含量 ,rhBMP 7组与标准品组相比 ,无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;复合组则明显高于单独植入rhBMP 7和胶原两组 (P <0 .0 5 )。     

骨髓来源成骨细胞复合纳米晶羟基磷灰石胶原材料培养的研究

目的 探讨纳米材料作为组织工程骨基质材料的可行性。方法 分离培养兔骨髓间充质干细胞，诱导为成骨细胞后作为种子细胞，与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养，通过对复合物光镜、免疫组织化学染色及扫描电镜观察，了解细胞在材料中生长情况。结果 兔骨髓间充质干细胞可以诱导为成骨细胞，体外复合培养8天，分布于支架材料上的细胞大量分化增殖、分泌细胞外基质。结论 纳米晶羟基磷灰石胶原材料是一种构建组织工程骨的较好的支架材料。     

低分子牛骨多肽制备及对大鼠成骨细胞的影响

目的从牛骨制备低分子多肽,并观察其对体外培养新生大鼠的成骨细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性和Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。方法采用冷冻离心、等电点沉淀方法去除骨胶原,超滤法得到相对分子质量(Mr)10000以下的牛骨多肽,经Sephadex G-10脱盐,浓缩后用Tricine-SDS-PAGE电泳对Mr进行检测。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定牛骨多肽对成骨细胞增殖的影响,ALP检测试剂盒测定细胞的ALP活性,RT-PCR法检测细胞中Ⅰ型胶原mRNA表达。结果建立了牛骨多肽的制备方法。低浓度牛骨多肽组与实验对照组相比对成骨细胞的增殖不显著(P>0.05),高浓度具有显著的增殖作用(P<0.05),并呈现出剂量依赖性;中、高浓度(50~400μg/mL)牛骨多肽组可提高成骨细胞ALP的活性(P<0.05),低浓度组(10μg/mL)提高ALP的活性不显著(P>0.05);牛骨多肽能提高Ⅰ型胶原mRNA表达。结论牛骨多肽的制备工艺简单,适合规模化生产;牛骨多肽能促进成骨细胞增殖、ALP活性和Ⅰ型胶原mRNA的表达。     

Bone biomimetic microenvironment induces osteogenic differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells

A critical strategy for tissue engineering is to provide the signals necessary for tissue regeneration by mimicking the tissue microenvironment. In this study, we mimicked (1) the bone chemical and the physical microenvironment by fabricating a three-dimensional nanocomposite scaffold composed of biphasic calcium phosphates (BCP) coated with a nanocomposite layer of polycaprolactone (PCL) and hydroxyapatite nanoparticles (nHA) (BCP/PCL-nHA)), and (2) the bone's biological microenvironment by co-culturing with primary human osteoblasts (HOBs), and then investigated their effects on osteogenic differentiation of adipose tissue-derived stem cells (ASCs). In comparison with the ASCs cultured alone on BCP scaffolds that were coated only with PCL, early osteogenic differentiation of ASCs was induced by either seeding ASCs on BCP/PCL-nHA scaffolds or by co-culturing with HOBs; the combination of BCP/PCL-nHA scaffold and HOBs resulted in the synergistic enhancement of osteogenic gene expression. Moreover, we found that BCP/PCL-nHA scaffolds induced early osteogenic differentiation of ASCs through integrin-α2 and an extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway. FROM THE CLINICAL EDITOR: The authors mimicked the physico-chemical environment of bone by fabricating a nanocomposite scaffold, and then co-cultured it with human osteoblasts. Demonstrated enhancement of osteogenic gene expression and early osteogenic differentiation of adipose tissue derived stem cells were found using this approach.     

淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞Cbfa1基因表达的影响

目的观察淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞功能及对转录因子核心结合因子a1（Cbfa1）mRNA表达的影响,探讨淫羊藿甙抗骨质疏松的作用机制。方法用酶消化法获得新生（〈24 h）SD大鼠颅盖骨成骨细胞,进行体外原代培养。将不同浓度的淫羊藿甙（1,10,100 ng/ml）分别加入培养液中,观察成骨细胞的形态、增殖和分化功能。用RT-PCR法测定成骨细胞Cbfa1、碱性磷酸酶（ALP）和Ⅰ型胶原（ColⅠ）mRNA表达水平的变化。结果 1、10和100 ng/ml淫羊藿甙均可促进Cbfa1、ALP和ColⅠmRNA表达（P〈0.05）,且以10 ng/ml组作用最显著。结论淫羊藿甙能促进体外培养成骨细胞增殖与分化,通过提高成骨细胞转录因子Cbfa1的基因表达水平诱导骨形成,是其抗骨质疏松作用机制之一。     

人牙周膜细胞接种于纳米-羟基磷灰石上的形态学研究

目的观察人牙周膜细胞接种于三维多孔纳米-羟基磷灰石上的组织形态学表现。方法将原代培养的人牙周膜细胞接种于三维多孔纳米-羟基磷灰石上，培养15天后，采用扫描电子显微镜观察细胞的生长情况，探讨两者的复合情况。结果作为种子细胞的人牙周膜细胞接种到支架材料上后，细胞粘附充分，生长旺盛，并有钙结节和少量胶原纤维形成。结论三维多孔纳米羟基磷灰石支架材料是一种比较符合牙周组织工程学条件的支架材料。     

In vivo study of dendronlike nanoparticles for stem cells "tune-up": from nano to tissues

The control of stem cell differentiation to obtain osteoblasts in vivo is still regarded as a challenge in stem-cell-based and bone-tissue engineering strategies. Biodegradable dexamethasone-loaded dendron-like nanoparticles (NPs) of carboxymethylchitosan/poly(amidoamine) dendrimer have been proposed as intracellular drug-delivery systems of bioactive molecules. In this study, combination of nanotechnology, stem-cell engineering and tissue engineering is proposed in pre-programming the fate of rat bone marrow stromal cells (RBMSCs) towards osteoblasts cells and development of new bone tissue, in vivo. This work demonstrated that the developed NPs were able to be taken up by RBMSCs, and exhibited a noncytotoxic behavior in vitro. The performance of the developed dendronlike NP system for the intracellular delivery of dexamethasone was investigated by seeding the engineered RBMSCs onto starch-polycaprolactone scaffolds ex vivo, and implanting subcutaneously in the back of Fischer 344/N rats (Syngeneic), in the absence of the typical osteogenic supplements. Favorable results were observed in vivo, thus suggesting that stem cell "tune-up" strategy can open up a new regenerative strategy for bone-tissue engineering. FROM THE CLINICAL EDITOR: In this study, a combination of nanotechnology, stem-cell engineering and tissue engineering is proposed in pre-programming the fate of rat bone marrow stromal cells (RBMSCs) towards osteoblasts cells and development of new bone tissue in vivo.     

人成骨细胞与异体脱钙松质骨成骨作用的实验研究

目的 观察人成骨细胞体外培养和接种于异体脱钙松质骨的成骨过程及特点。方法 采用正常人骨膜分离提取成骨细胞在体外进行培养，扩增，观察成骨细胞形态和生长情况，然后将其接种于异体脱钙松质骨支架上，植入裸鼠体内进行培养，8周后对大体标本进行扫描电镜的组织学检查，观察成骨情况。结果人骨膜分离、培养一、扩增的成骨细胞在体外生长良好，增殖旺盛。成骨细胞接种于异体脱钙松质骨植入裸鼠体内培养。8周后组织学观察支架有块状断层吸收．有岛状新生成骨。结论 成骨细胞接种于异体脱钙骨松质骨能钙化成骨，为骨缺损的修复提供骨源成为可能。     

辛伐他汀对体外成骨细胞、破骨细胞的影响

目的 探讨辛伐他汀对体外培养成骨细胞、破骨细胞的影响.方法 分离SD大鼠成骨细胞、破骨细胞,体外培养时给予辛伐他汀刺激,观察药物对成骨细胞增殖率和碱性磷酸酶以及骨细胞骨吸收的影响.结果 辛伐他汀10~(-6)～10~(-9)mol/L对碱性磷酸酶的分泌有明显促进作用,10~(-6)～10~(-8)mol/L的辛伐他汀既促进成骨细胞的增殖,又抑制破骨细胞的骨吸收.结论 辛伐他汀在体外促进骨形成、抑制骨吸收,有望成为治疗骨质疏松的约物.     

Visualization of vascular ultrastructure during osteogenesis by tissue engineering technique

The aim of this paper was to observe and visualize the changes in osteoblasts by electron microscopy during osteogenesis using tissue engineering technique. We also studied the feasibility of improving tissue vascularization of the engineered bone by using small intestine submucosa (SIS) as the scaffold. Bone mesenchymal stem cells (BMSCs) were isolated by gradient centrifugation method. Bone mesenchymal stem cells were seeded in the SIS, and the scaffold-cell constructs were cultured in vitro for 2 weeks. Small intestine submucosa without BMSCs served as control. Both SIS scaffolds were then implanted subcutaneously in the dorsa of athymic mice. The implants were harvested after in vivo incubation for 4, 8 and 12 weeks. The changes in osteoblasts and vascularization were observed under a transmission electron microscope and a scanning electron microscope. The BMSCs grew quite well, differentiating on the surface of the SIS and secreting a great deal of extracellular matrices. The scaffold-cell constructs formed a lot of bone and blood vessels in vivo. The scaffold degraded after 12 weeks. No osteoblasts, but vascularization and fibroblasts were observed, in the control. The SIS can be used as a scaffold for constructing tissue-engineered bone as it can improve the formation of bone and vessels in vivo. Translated from Journal of Shanghai Jiaotong University (Medical Science), 2006, 26(2): 113–116 [译自: 上海交通大学学报 (医学版)]