幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建

目的 构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）和尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的重组蛋的白质的侯选菌株。方法 用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌的染色休ＤＮＡ上分别扩增出ＨｓｐＡ和ＵｒｅＢ基因片段,将它们融合插入原核表达载体ｐＥＴ－２３ｂ（＋）中,并在ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌表达。结果 经测序,ＨｓｐＡ－ＵｒｅＢ（ＨＵ）事例基因片段由２０６１ｂｐ组成,为编码６８７个氨基酸残基的多肽。ＳＤＳ－     

幽门螺杆菌HspA-CtxB口服疫苗的研制及免疫原性研究

目的　观察幽门螺杆菌融合蛋白质热休克蛋白A 霍乱毒素B(HspA CtxB ,HCT)经口服免疫在小鼠小肠内的吸收情况及免疫后机体产生的免疫应答。方法　用PCR方法扩增hspA和ctxB 2个目的基因片段 ,将它们分别克隆至pSK(+)质粒上 ,然后插入含T7启动子pET 2 2b(+)的表达载体中 ,构建含双基因的表达质粒pET hct,转化E .coliBL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达融合蛋白质HCT ;融合蛋白质经镍离子柱纯化、复性后 ,与HspA重组蛋白质共同标记同位素1 2 5I,经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况 ;HCT和HspA分别给小鼠灌胃进行免疫 ,每周灌胃 2次 ,共 8次 ,末次免疫后 3d起收集小鼠粪便 ,次日眶后静脉采集静脉血 ,分别对标本进行IgG和IgA检测。结果　经测序 ,HspA CtxB(HCT)融合基因片段由 72 6bp组成 ,为编码 2 42个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE和免疫印迹分析检测发现 ,融合基因表达的蛋白质相对分子质量 (M) r 约为 30× 10 3 。标记同位素1 2 5I的HCT和HspA ,经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收情况 ,结果发现在 10～ 15min时间段 ,HCT组出现吸收峰值 ,约为对照组的 8倍以上 (P <0 .0 0 1) ,且吸收峰值时间明显提前 ;将HCT口服免疫小鼠 ,检测小鼠血清和粪便中的特异性抗体水平。结果HCT组 (A40 5) ,血清IgA ,2 .98     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌HpureB基因,并构建其核酸疫苗。方法:以HpNCTC11637株基因组DNA为模板,用PCR扩增ureB基因,并亚克隆至pMD18-T载体中。将目的基因经SalI、BglⅡ酶切纯化后插入pTCAE中,转化E.coliDH5α。经SalI、XhoI酶切并测序鉴定的阳性重组质粒命名为pT-ureB。以电穿孔法将pT-ureB转染CHO细胞,用Wes-tern blot检测UreB蛋白的表达。结果:克隆重组后得到pT-ureB。将pT-ureB以电穿孔法转染CHO细胞后,取其培养上清进行Western blot检测,在UreB的相对分子质量(Mr)为62000处出现特异性条带。结论:成功地构建了HpureB核酸疫苗。体外转染CHO细胞后,经Western blot检测证实有UreB蛋白的表达,为进一步的相关研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的 设计幽门螺杆菌（Hp）的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法 将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联,表位之间用两个赖氨酸（KK）间隔,合成全基因,克隆到pET-22b载体上,在大肠杆菌B121（DE3）中表达;表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balb／c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果 克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95％,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,Th表位多肽（U546-561、U229-244、U237-251）、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖（SI〉2）,并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论 本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能,并且具有较强的免疫原性,为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

目的 获取人幽门螺杆菌（Ｈｐ）热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）的ＤＮＡ（ｈｓｐＡ）,并将它克隆到质粒ＰｉｎＰｏｉｎｔ＾ＴＭ Ｘａ－３中进行核苷酸序列分析。方法 利用ＰＣＲ技术扩增ＨｓｐＡ,并将其它向插入ＰｉｎＰｏｉｎｔ＾ＴＭ Ｘａ－３载体中通过４种荧光染料标记,激光检测的方法进行核苷酸序列分析。结果 ＤＮＡ序列分析表明,所克隆的ＨａｐＡ ＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布的一致。结论 本研究获得了序列正     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

目的 获取人幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp)热休克蛋白A基因（hsqA)进行核苷酸序列分析。方法 利用PCR技术扩增HspA的DNA,并将其定向插入PinPoint^TMXa-3载体中进行核苷酸序列分析。结果 大气层克隆的HspADNA序列与GeneBank公布的序列有15个碱基存在差异。同源95.8%。结论 所克隆的HspA基因可用于重组表达及相关研究。     

重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗鼻腔免疫的实验研究

目的:探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果。方法:以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠。末次免疫7 d后,收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液,用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体。结果:rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高,与对照组相比较差异显著(P<0.01)。20μg剂量组与10μg剂量组相比较,仅血清特异性IgG水平增高,其它黏膜特异性IgA的水平未见增高。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强,卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平。结论:CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂。HprUreB鼻黏膜接种,不仅可诱导血清特异性抗体反应,而且能引起多个黏膜部位的免疫应答,是一种方便、有效、廉价的免疫途径。     

幽门螺杆菌尿素酶A、过氧化氢酶的表达及纯化

目的：探讨重组尿素酶A亚单位（UreA）、过氧化氢酶（KatA）疫苗在防治婴门螺杆菌（HP）感染中的作用。方法：构建表达UreA、KatA的重组质粒,用IPTG诱导表达融合蛋白,并进行SDS－PAGE凝胶电泳及Western blot分析,Bulk GST Purification Module试剂盒纯化UreA和KatA。结果：构建的重组质粒能表达GST－UreA和GST－KatA合蛋白,表达量占细胞总蛋白量的35％和19％,并能与抗GST 发生特异性反应。纯化的UreA、KatA的纯度达95％以上。结论：该工作为进一步的动物免疫实验奠定了基础,该重组疫苗有望在HP感染及其相关疾病的防治中发挥积极作用。     

人幽门螺杆菌18 000外膜蛋白与HspA双价疫苗的构建和表达

目的 :构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和Mr为 180 0 0的外膜蛋白编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法 :用PCR方法从HpDNA染色体中 ,扩增HspA编码基因片段。将目的基因HspA与载体 pET32a( )分别经kpnⅠ和BamHI双酶切后 ,进行连接、测序。同时将重组载体 pET32a( ) /HspA和pET32a( ) /Omp18,分别经HindIII和BamHI双酶切 ,通过凝胶电泳回收pET32a( ) /HspA和Mr180 0 0OMPDNA片段 ,经T4连接酶将HspA和Mr180 0 0OMP编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE30 )中表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,以Westernblot分析其抗原性。结果 :经酶切、测序表明 ,插入的基因片段为HpHspA和Mr 为 180 0 0OMP编码基因 ,由 891个碱基组成 ,与GenBank中登录的序列相比较 ,有 1.15 %的碱基发生变异 ,1.2 6 %的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr 为 5 1× 10 3 ,其中 pET32a( )表达的蛋白Mr 约为 2 0×10 3 ,可溶性表达产物占菌体总蛋白的 18.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。用Westernblot分析显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗Mr为 180 0 0OMP单     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位重组蛋白纯化及免疫活性研究

热休克蛋白 (ｈｅａｔｓｈｏｏｋｐｒｏｔｅｉｎ ,Ｈｓｐ)为幽门螺杆菌 (Ｈｐ)共同的抗原成分 ,分为Ａ(ＨｓｐＡ)、Ｂ(ＨｓｐＢ)两个亚单位。目前 ,通过细菌培养获得大量Ｈｐ,并从中纯化出足量的亚单位抗原非常困难。因此 ,我们采用基因工程技术构建重组ＨｓｐＡ基因工程菌 ,并对ＨｓｐＡ重组蛋白纯化条件及免疫学活性进行研究。试验证明ＨｓｐＡ以包涵体形式表达。采用本室建立的包涵体洗涤、溶解方法进行处理 ,溶解包涵体后ＨｓｐＡ纯度大于6 0 % (Ａ级纯化 )。之后我们采用分步稀释法将ＨｓｐＡ复性。对ＨｓｐＡ的Ｂ级纯化选择ＱＳｅｐｈ…     

基于幽门螺杆菌UreB优势抗原表位多抗原肽疫苗制备及其免疫保护作用

目的 构建串联式幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527原核重组表达系统,制备UreB322和UreB527表位与多肽载体Poly-Asp-Lys的多抗原肽(MAP)疫苗并确定其免疫原性和免疫保护性.方法 采用连接引物PCR构建含肠激酶(EK)位点的串联式UreB322和UreB527表位基因及其原核表达系统.表达的目的重组融合蛋白8×[rEK-UreB322-EK-UreB527-EK]经EK水解后用Sephadex G-25柱分离rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.采用碳二亚胺法将rUreB322-EK、rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys载体分子交联,制备出多抗原肽疫苗MAP-rUreB322/B527.采用ELISA和Western blot分别检测各重组表位肽及MAP-rUreB322/527的抗原性和免疫反应性.采用幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠模型检测MAP-rUreB322/527免疫保护效果.结果 获得了8次重复串联的UreB322和UreB527编码基因及其原核表达系统,目的融合蛋白8×[rEKUreB322-EK-rUreB527-EK]表达量可达细菌总蛋白的48％.肠激酶可将目的融合蛋白完全水解为rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.rUreB322-EK和rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys交联率高达92.5％.幽门螺杆菌全菌抗体及rUreB-IgG均能识别rUreB322-EK、rUreB527-EK和MAP-rUmB322/527并与之结合.MAP-rUreB322/527免疫小鼠血清抗体水平明显高于rUreB(P＜0.05).50或100μgMAP-rUreB322/527对幽门螺杆菌SS1株感染小鼠的保护率(83.3％和91.7％)明显高于等量rUreB(41.7％和50.0％)(P＜0.05).结论 本研究成功地构建了幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527重复串联式编码基因及其原核表达系统,基于UreB优势抗原表位的多抗原肽疫苗MAPrUreB322/527能显著提高免疫保护效果.     

构建携带幽门螺杆菌oipA核酸的减毒沙门重组菌株及其免疫保护作用的初步研究

目的:优化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)oipA核酸疫苗,构建含oipA核酸的SL7207(减毒伤寒沙门氏菌)重组菌株,并研究其在防御H.pylori感染中的作用。方法:对oipA基因进行密码子优化,Kozak前导序列添加、CpG序列优化,将oipA优化前后的基因分别克隆入pVAX1真核表达载体,获得pVAX1-oipA和pVAX1-optioipA重组子,将上述重组子与空载体pVAX1瞬时转染AGS细胞,应用Western blot检测转染细胞中OipA蛋白的表达。将重组子转化LB5000进行甲基化修饰,利用修饰后重组子转化终宿主菌SL7207,提取SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA菌株质粒进行PCR,酶切鉴定。用SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA免疫C57BL/6小鼠,末次免疫2周后检测抗OipA抗体,并在末次免疫4周后予H.pyloriSS1(5×108CFU/只)攻击,攻击3次,隔天一次,攻击4周后处死动物,取胃组织做快速尿素酶实验和H.pylori定量培养以检测H.pylori感染状况。结果:pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA均可在AGS细胞中表达,且pVAX1-optioipA的OipA蛋白表达量高于pVAX1-oipA;从SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA抽提的质粒,经PCR,酶切鉴定正确;免疫小鼠血清中产生抗OipA蛋白的特异性抗体IgG,且pVAX1-optioipA疫苗组诱导IgG水平明显高于pVAX1-oipA疫苗组(P0.01);pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA疫苗组H.pylori感染率分别为60%(9/15)、26.67%(4/15),明显低于对照组100%(10/10)(P0.01)。结论:成功构建携带pVAX1-oipA,pVAX1-optioipA的SL7207重组菌株,并验证其对C57BL/6小鼠H.pylori感染具有免疫预防作用,且优化oipA基因有助于提高免疫保护效果。     

用单表位合成肽抗原荧光偏振免疫法检测抗幽门螺旋杆菌尿素酶的抗体

目的:应用单表位合成肽抗原,建立一种新的基于荧光偏振技术(fluorescencepolarization,FP)的抗体检测方法。方法:用幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B(UreB)的单表位合成分支肽抗原免疫小鼠,以ELISA法分析免疫的效果。分析FITC标记的合成肽抗原在不同浓度时的FP值,用FP技术分析抗原表位的抗原性以及不同稀释比例的血清样品对FP检测的影响。分别应用FPIA法和ELISA法,对126例样品进行Hp感染检测,对FPIA的检测数据进行受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)分析。结果:UreB的单表位抗原肽具有较强的抗原性和免疫原性;1.0nmol/L的FITC标记肽可用于FPIA检测,血清样品做1∶25稀释时可明显区分阳性和阴性检测结果。与ELISA方法检测的结果相比较,用基于UreB单表位合成肽抗原的FPIA法检测Hp感染的灵敏度为85.7%,特异度为98%。结论:应用UreB单表位合成肽抗原,可对抗UreB的抗体进行快速FPIA检测,用此法检测抗体在疾病的临床诊断中具有广阔的应用前景。     

OipA DNA疫苗抗螺旋形和球形幽门螺杆菌免疫保护作用及其机制

目的探讨pcDNA3.1-oipA DNA疫苗在抗螺旋形与球形幽门螺杆菌（Hp）感染中的作用及其机制.方法抽提并纯化可表达OipA蛋白的重组质粒pcDNA3.1-oipA,以金粉包裹后,用基因枪接种BALB/c小鼠,5 μg/只,接种2次,以pcDNA3.1（空载组）作对照.对免疫小鼠进行：（1）免疫保护实验：于末次免疫后8周,分别给予螺旋形及球形Hp SS1攻击4次,于末次攻击4周后取胃组织做细菌学（组织尿素酶试验、细菌培养）及病理学检测.（2）小鼠免疫指标检测：分别于末次免疫后2、8、12周采集小鼠血清,用ELISA法检测其抗Hp OipA IgA、IgG、IgG1抗体.于末次免疫后12周,取脾细胞,用FLISA法检测IFN-γ、IL-2的含量;用流式细胞术检测CD4^＋/CD8^＋T淋巴细胞的比值.结果以螺旋形及球形Hp攻击的免疫小鼠,快速尿素酶实验阳性率分别为20%和10%;细菌培养阳性率分别为60%和50%,与空载组比较P＜0.05.空载组小鼠胃黏膜均出现轻度或重度糜烂,而以螺旋形Hp攻击的实验组小鼠50%胃黏膜正常,以球形Hp攻击的实验组小鼠60%胃黏膜正常,与空载组比较P＜0.05.小鼠免疫指标检测结果：免疫后8周,产生了抗OipA的特异性IgA、IgG、IgG1抗体,抗体滴度比对照组高2倍以上;脾细胞中CD4^＋/CD8^＋T淋巴细胞的比值升高;脾细胞培养上清液IFN-γ、IL-2的含量明显高于对照组（P＜0.05）.结论 pcDNA3.1-oipA DNA疫苗能有效诱导免疫小鼠产生体液与细胞免疫并使小鼠兼具一定的抗螺旋形及球形Hp感染的能力.     

幽门螺杆菌分子内佐剂三价疫苗的构建、纯化及活性研究

目的构建幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）中性粒细胞激活蛋白基因napA、黏附素hpaA、尿素酶B亚单位活性功能片段ureB414与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（heat-labile enterotoxin Bsubunit,LTB）的分子内佐剂三价融合蛋白疫苗,并通过13服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带napA-hpaA．ureB414-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-NHUL,转化E．coliB121（DE3）,进行原核表达,重组表达蛋白采用HK26／60Superdex-75分子筛和亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Westemblot鉴定,GM1-ELISA检测rNHUL与神经节苷脂的结合。口服免疫Balb／c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约1590bp的NHUL融合基因;其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的25％,Tris-Tficine初步测定目的蛋白的肘,约59000,纯化后纯度大于90％。Westemblot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性。动物实验表明,多亚单位疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG、IsA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sigA抗体显著高于单一亚单位疫苗。结论所获得重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌疫苗免疫机制的研究进展

幽门螺杆菌(H.pylori)是定植于人体胃粘膜的重要致病菌,而粘膜疫苗以其有效的保护性免疫成为防治H.pyiori的热点,但对相应的免疫机制的认识目前尚不明确.故本文对H.pyiori疫苗的保护性免疫机制中的抗原递呈机制,抗体的作用以及TH细胞反应的作用等研究进展做一概要介绍.     

幽门螺杆菌感染小鼠及其抗原免疫小鼠后体液免疫应答的比较

目的：比较BALB／c小鼠感染H.pylori后以及经H.pylori UreB抗原口服免疫后的体液免疫应答的差异。方法：80只BALB／c小鼠分为感染组和免疫组，感染组灌喂H.pylori小鼠适应株；免疫组灌喂重组H.pylori UreB抗原和佐剂LTB。在试验的0，2，6和10周时每组分别取10只小鼠收集唾液及血液标本，用ELISA法检测抗UreBIgG和IgA抗体，同时采集胃组织作H.pylori感染检测。结果：感染组小鼠在灌喂H.pylori后2，6，10周，感染率均为100％，其血清中抗UreB IgG增高明显，但血清及唾液中均未见IgA的明显升高，；免疫组小鼠在初次免疫后第6，10周后，血清及唾液中抗UreB,IgG和IgA抗体的均显著升高。结论：H.yplori感染BALB／ c小鼠不能诱导其产生明显的特异性黏膜免疫应答，而重组UreB可作为良好的免疫原诱导其产生分泌型IgA抗体。