人胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制备

目的 从人胚胎躯干中分离、培养人胚胎成纤维细胞,建立人胚胎成纤维细胞饲养层用于人精原干细胞的培养.方法 利用酶消化法从孕5～9周龄人胚胎躯干中分离培养人胚胎成纤维细胞,制作饲养层,使用不同浓度丝裂霉素C处理,以细胞形态、生长曲线作为胚胎成纤维细胞和饲养层的评价指标.结果 从人胚胎中成功分离培养出人胚胎成纤维细胞,该细胞可传代15代以上,且经过传代及冷冻复苏后生物学特性无改变.12.5mg/L丝裂霉素C作用2h可达到较好处理效果.结论 成功分离和培养人胚胎来源的成纤维细胞,用于人精原干细胞饲养层的制作.     

人胎肺成纤维细胞对小鼠胚胎干细胞生长支持作用的研究

目的探讨人胎肺成纤维细胞（hELF）作为饲养层支持小鼠胚胎干细胞（ES）的生长及维持ES细胞的未分化状态。方法采用生长状态良好的hELF,经一定浓度的丝裂霉素C处理后,制备hELF饲养层,将ES细胞接种到该饲养层进行传代培养。观察ES细胞的形态学特征,测定ES细胞表面碱性磷酸酶（AKP）活性、干细胞标志物Oct-4的表达。结果hELF细胞经丝裂霉素C处理后不再增殖,保持较好的细胞功能和形态学特征。ES细胞克隆在饲养层呈现集落状隆起生长,边缘清楚,结构致密,与周围的饲养层细胞界限清楚。ES细胞仍然保持未分化状态,高度表达AKP及胚胎干细胞转录因子Oct-4。结论hELF作为饲养层可以较好的维持胚胎干细胞的生长及其未分化状态。hELF源自人工流产组织,取材来源较丰富,为hELF饲养层应用于人胚胎干细胞的培养奠定了基础。     

γ射线防治尿道狭窄与诱导成纤维细胞凋亡的关系

1998年 ,孙颖浩等[1] 采用尿道狭窄内切开或瘢痕电切术后尿道内γ射线放疗 (总剂量 10～ 15Gy)防治复发性尿道狭窄 ,疗效满意。为探讨γ射线在临床应用剂量范围内防治尿道狭窄的作用机制 ,我们研究了γ射线体外照射对尿道瘢痕成纤维细胞的杀伤效应。一、材料和方法1.成纤维细胞培养 :取手术切除的尿道增生性瘢痕组织 ,采用组织块贴壁法原代培养[2 ] 。细胞生长成片后传代培养。2 .实验分组 :取 8～ 10代指数生长期细胞进行实验。照射前 2 4h ,以红细胞计数法计数细胞 ,按 3× 10 6个 /瓶接种到 75ml培养瓶中。随机将各瓶细胞设置为未照射组…     

小鼠胚胎生殖细胞体外培养

目的：研究胚胎生殖细胞的体外生长条件和分化潜能，探索从胚胎生殖细胞获得皮肤细胞的可能性。方法：在解剖显微镜下分离取出10天龄的胎鼠生殖嵴，消化法得到原生殖细胞，接种在胎鼠的成纤维细胞饲养层上，培养基使用α-MEM添加药用级的bFGF，或者添加成纤维细胞的上清液，配制成条件培养基。培养的细胞用形态学观察法，碱性磷酸酶染色法和诱导分化的方法来鉴定。结果：初步摸索出胚胎生殖细胞体外培养的简单方法，验证了它的分化潜力，观察到了神经细胞、心肌细胞、和表此样细胞。结论：本试验为简易条件下的胚胎生殖细胞的研究做出了有益的探索，为大规模获得表皮细胞提供了一个新的思路。     

外胚间充质干细胞对射线照射后大鼠造血系统的影响

目的探讨颌突外胚间充质干细胞对γ射线照射后大鼠造血系统的影响.方法取孕11.5 d SD大鼠胚胎颌突,用消化法培养获得外胚间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况.雄性SD大鼠80只,体重220 g,随机分为A、B、C、D 4组,每组20只,A、B和C组给予60Co γ射线全身一次性照射,照射剂量为6.0 Gy.A组:照射后6 h,尾静脉移植第2代外胚间充质干细胞;B、C组尾静脉分别移植真皮成纤维细胞和生理盐水作为阴性对照;D组未照射,为正常对照组,注射生理盐水0.3 ml/只.分别于1、2、3和4周动态观察大鼠外周血白细胞及血红蛋白的变化,并于第4周行骨髓有核细胞计数,测定大鼠骨髓粒细胞巨噬细胞集落形成单位(colony forming unit-granulocyte macrophage,CFU-GM),采用内源性脾结节法测定脾集落形成单位(colony forming unit-spleen,CFU-S),进行大鼠骨髓组织学检查.结果培养的原代外胚间充质干细胞呈单层生长,似成纤维样梭形,有2～4个突起.移植后第3、4周,A组白细胞数明显高于B、C组(P＜0.05),A、D组大鼠外周血血红蛋白含量高于B、C组(P＜0.05).移植后第4周,A组大鼠骨髓有核细胞计数明显多于B、C组(P＜0.01), CFU-S计数明显多于B、C组(P＜0.01),A、D组CFU-GM数量均较B、C组多(P＜0.01).结论颌突外胚间充质干细胞具有干细胞的特征,能够促进辐射损伤后大鼠造血功能的修复与重建.     

人胚胎成纤维细胞饲养层支持人精原干细胞的生长

目的:探讨人精原干细胞分离、纯化及以人胚胎成纤维细胞为饲养层培养的方法和条件。方法:利用两步酶法和Percoll不连续密度离心法分离、纯化人精原干细胞,在人胚胎成纤维细胞饲养层上培养;用免疫组织化学方法检测精原干细胞表面标志SSEA-1和OCT4;检测精原干细胞克隆碱性磷酸酶活性;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测精原干细胞相关基因的表达。结果:精原干细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上可以存活并增殖形成集落。集落未分化标志检测显示SSEA-l、OCT4呈阳性,碱性磷酸酶活性呈强阳性,并表达精原干细胞相关基因。结论:人胚胎成纤维细胞饲养层可以支持人精原干细胞的生长。     

大鼠骨髓间充质干细胞作为滋养层培养小鼠胚胎干细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞(embryonic stemcells ESCs)的可能。方法:收集BALB/C小鼠3·5d胎龄的囊胚,接种于大鼠骨髓间充质干细胞的滋养层上,培养5~6d后挑取胚胎干细胞集落,胰酶消化传代。观察细胞集落生长情况,通过碱性磷酸酶染色、细胞核型分析对细胞生物学特性进行检测。结果:ES细胞呈集落性生长,碱性磷酸酶组织化学染色阳性,具有正常核型及多向分化潜能。结论:大鼠MSCs可以作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞,并能保持未分化状态。     

人胚胎干细胞培养的相关因素分析

人胚胎干细胞(HESC)是一种存在于着床前胚胎,能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态,具有分化发育成3个胚层组织细胞潜能的全能性细胞[1]。目前已有多个实验室对HESC进行广泛的研究,由于HESC的原代培养尤其重要,本实验旨在探讨其原代培养相关影响因素。一、材料和方法1.材料:DMEM培养基、HESC专用胎牛血清、L-谷氨酰胺及胰蛋白酶、丝裂霉素、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等均购自武汉大风公司。     

胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生研究

目的：分离培养胎鼠的表皮干细胞及毛囊乳头层细胞，通过动物模型观察两者复合移植后，上皮形成及毛囊的再生情况。方法：采用IV型胶原分离培养胎鼠表皮干细胞，检测β1整合素及角蛋白15的表达水平，测定其细胞周期及克隆形成率（以角质细胞为对照）；分离培养毛囊乳头层细胞，并接种在纤维蛋白胶中，与表皮干细胞膜片复合形成全层皮肤等同物，移植在裸鼠全层皮肤缺损创面作为实验组，同时将胎鼠成纤维细胞替代乳头层细胞作为对照组，8－10周后观察创面及囊的组织学变化。结果：胎鼠表皮干细胞表达高水平的β1整合素及角蛋白15；细胞周期分析显示，G1期细胞百分率为94．9％，S期为3．5％，提示为慢循环细胞周期；角质细胞的G1期细胞有百分率为74．1％，S期为17．5％；表皮干细胞的克隆形成率为15．3％，明显高于对照组的6．7％；裸鼠创面愈合后8－10周，实验组可见新生毛囊形成，对照组未见到此现象。结论：能初步实现对胎鼠表皮干细胞的体外分离培养；在毛囊乳头层细胞的诱导下，胎鼠表皮干细胞可参与形成新的毛囊结构。     

小鼠胚胎神经干细胞的长期培养和分化

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和分化条件,为神经干细胞的深入研究奠定基础。方法：无菌条件下分离小鼠胚胎脑皮质,制成单细胞悬液,种植在N2培养基中培养,培养基中加入20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（每次实验用1－2只小鼠胚胎,实验重复8次）。采用机械方法传代,常规方法冻存和复苏。用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。结果：成功培养出小鼠的神经干细胞,神经干细胞呈悬浮状态生长,形成典型的神经球。细胞表达巢蛋白和波形蛋白2种神经干细胞的标志物。细胞在胎牛血清的诱导下,可分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,它们所占的比例分别为7％、85％－90％和2％－4％。结论:鼠的神经干细胞可以在体外稳定地培养和传代,为细胞治疗提供了一个理想的细胞来源。     

胚胎植入与内膜准备的机体调节机制

成功的胚胎植入是人类生殖的必需过程。胚胎种植过程发生在"种植窗"时期,母体子宫处于接受外源囊胚的容受状态,这一过程涉及到母胎间的多重复杂相互作用。本文将主要阐述胚胎植入过程中最重要的因素,包括激素、细胞因子、免疫细胞以及神经调节。     

菲立磁标记胚胎干细胞适宜示踪浓度的研究

目的 探讨适宜体内移植示踪研究的胚胎干细胞(ESCs)菲立磁标记浓度.方法 分别以0.05、0.10 g/L硫酸鱼精蛋白-菲立磁复合物标记胚胎干细胞,行电镜检测及MRI扫描了解菲立磁标记细胞体外生物学特征.结果 0.05 g/L浓度的硫酸鱼精蛋白-菲立磁复合物标记胚胎干细胞效率最高,达到91.5%以上,标记细胞数量为1×105时能有效引发MRI信号改变.结论 以0.05 g/L硫酸鱼精蛋白-菲立磁复合物浓度标记胚胎干细胞可以作为胚胎干细胞体内移植适宜的标记浓度.

Abstract：

Objective To investigate the feasible feridex concentration for labeling embryonic stem cells (ESCs) in tracking study in vivo.Methods ESCs were labeled with 0.05,0.10 g/L protamine sulfate-feridex complex respectively,to find out the biological character of ESCs labeled with feridex through electron microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) examination.Results With 0.05 g/L protamine sulfate-feridex complex,the feridex labeling efficiency of ESCs was above 91.5%.The number of labeled cells which induced MRI signal changes in vitro was 1 × 105.Conclusion Labeled ESCs with 0.05 g/L protamine sulfate-feridex complex is the optimal choice for transplanted ESCs in vivo.     

胚胎基因组的形成和激活

早期胚胎缺乏转录活性,由母源性的转录产物所调控,随着胚胎的发育,胚胎的基因组逐渐形成并被激活。胚胎基因组的形成和激活在早期胚胎的发育中起关键作用,主要包括胚胎细胞核的形成和胚胎细胞质由转录抑制状态向激活状态转变。本文对胚胎基因组的形成和激活的基本特点和分子机制进行综述。     

胚胎干细胞嵌合体小鼠的制备及其影响因素

胚胎干细胞(ES cell)嵌合体制备在发育生物学,功能基因组学等研究领域发挥越来越重要的作用。其技术本身随着干细胞生物学,体细胞核移植技术进步而不断发展。但其制备过程受ES细胞,宿主囊胚遗传背景、生存状态及嵌合体制备程序等诸多因素影响,导致ES细胞嵌合体的制备程序颇为复杂。本文将对ES细胞嵌合体小鼠制备技术的最新进展作一综述。     

Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells

BACKGROUND: Embryonic stem (ES) cells are widely used in therapeutic research as an unlimited source of cell therapy. Therefore, it is of great value to find a way to efficiently manipulate ES cells. HIV-1-derived lentiviral vectors are now considered to be an efficient vehicle for delivering genes into a variety of cells. In this study, we examined the efficacy of lentivirus-based gene delivery into mouse ES (mES) cells. MATERIALS AND METHODS: Recombinant HIV-I-based lentiviral vectors Lt-GFP, expressing green fluorescent protein (GFP), and Lt-LacZ, expressing E. coli LacZ gene in conjunction with neomycin resistance gene, were generated using a FuGENE 6 transduction method and used for transducing ES cells derived from 129Sv mice. Lentiviral transduction efficacy was evaluated by GFP expression assay using flow cytometry and by X-gal staining. The in vivo potential of developing teratoma of such transduced mES cells was examined in severe combined immunodeficiency (SCID) mice. RESULTS: FuGENE 6 showed no considerable transduction-associated cytotoxicity. The expression rate of GFP and LacZ of mES cells increased on a multiplicity of infection (MOI)-dependent manner with the amount of Lt-GFP and Lt-LacZ used. Approximately 42% of mES cells were positive for GFP after infection of Lt-GFP at an MOI of 30. Notably, after G418 selection, nearly 100% of Lt-LacZ-transduced mES cells were positive for LacZ and formed teratomas in SCID mice. CONCLUSIONS: This work demonstrates that HIV-I-based lentiviral vectors are capable of transducing mES cells. Lentiviral vectors may facilitate an advance in the field of gene transfer and expression in various types of ES cells, including human ES cells.     

胚胎干细胞转基因治疗甲状旁腺功能低下症

目的　探讨小鼠胚胎干细胞 (TC 1)转基因治疗甲状旁腺功能低下症 (HPT)。方法包装出重组人甲状旁腺素 (PTH )基因的小鼠干细胞病毒 (MSCV) ,以lml重组病毒液加入 poly brene(终浓度 8mg/L)感染TC 1细胞 ,检测基因转导效率 ,PTH分泌情况 ;以及每 1× 10 5个 /mlTC 1细胞注入模型鼠体内各组小鼠血PTH和血钙变化情况。结果　获得滴度为 2× 10 7集落形成单位 (CFU) /ml的重组逆转录病毒 ,其感染TC 1的效率为 70 % ,每 10 6 未分化TC 1每 48h分泌PTH10ng。重组有PTH基因的TC 1细胞注入模型鼠体内后 ,在观察期间实验组动物血PTH和血钙均保持在接近正常值范围内。结论　MSCV介导外源PTH基因可高效转导TC 1并持续分泌PTH ;内环境并不是决定TC 1分化的唯一因素。经基因转导的TC 1可较好的改善模型鼠的症状 ,是未来细胞移植的一种潜在来源。     

核移植胚胎干细胞的鉴定及诱导分化研究

目的 观察胚胎后肾细胞微环境诱导核移植胚胎干细胞( ntESCs)分化为肾系细胞的作用.方法 分离小鼠ntESCs样集落,对ntESCs进行鉴定.将核移植拟胚体(ntEBs)与胚胎后肾细胞通过间接共培养以诱导其分化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测诱导后ntEBs与对照组中肾组织Wilms瘤抑癌因子1(WT-1)、Wnt-4、同源盒基因2(pax-2)、c-Ret、足细胞标记蛋白( podocalyxin)和Nephrin的mRNA表达;免疫荧光染色法检测诱导后ntEBs与对照组的Pax-2、WT-1蛋白表达.结果 mESCs集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性.ntEBs共培养组WT-1、Wnt-4、pax-2、c-Ret、podocalyxin和Nephrin均有表达,而对照组则为阴性;免疫荧光结果显示ntEBs细胞诱导分化后Pax-2荧光强度为(++);而实验组WT-1荧光强度(+)也优于对照组的(±).结论 后肾细胞微环境可促进核移植胚胎来源ntESCs分化为肾系细胞.     

利用冷冻胚胎建立人胚胎干细胞系

目的利用辅助生殖技术中废弃的冷冻胚胎建立人胚胎干细胞系。方法将体外受精一胚胎移植周期中废弃的冷冻胚胎解冻,序贯培养至囊胚,分离出内细胞团,接种至混合饲养层,进行传代培养,对可连续传代的细胞系进行鉴定。结果共收集废弃冷冻胚胎44枚,形成囊胚15枚,原代接种内细胞团10枚,其中一枚已稳定传至25代,目前生长状态良好,经鉴定证实为胚胎干细胞。结论利用辅助生殖技术中废弃的冷冻胚胎,可成功建立人胚胎干细胞系。     

用囊胚内细胞团建立小鼠胚胎干细胞系的尝试

目的建立小鼠129品系胚胎干细胞(ES)系。方法分离囊胚内细胞团接种至小鼠胚胎成纤维细胞,培养、传代以获得细胞系,通过形态观察、碱性磷酸酶检查、体内外分化实验予以鉴定。结果共获取12个囊胚,培养后有9个内细胞团增殖,消化传代,分离出2株克隆;形态观察具有明显的ES细胞形态,染色体核型检查为XY,碱性磷酸酶检查细胞呈阳性,体外分化实验表明可自发分化为外、中和内胚层细胞,体内分化实验获得典型的畸胎瘤,并具备小鼠特异性表面标志物Oct-4、SSEA-1。结论应用本方法建立了两株129品系胚胎干细胞系,并证实其符合小鼠胚胎干细胞的特征。