日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原     

Sj28GST基因克隆和高效表达产物的纯化

目的　从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中克隆 2 8kDa谷胱甘肽 -S -转移酶 (Sj2 8GST)基因 ,获得用于疫苗和T细胞表位研究的高纯度重组融合蛋白 2 8GST -TRX。方法　应用引物特异性PCR技术 ,从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中扩增Sj2 8GST基因 ,经琼脂糖凝胶电泳结合碱基序列分析鉴定后 ,采用定向克隆技术构建Sj2 8GST -TRX融合蛋白重组表达载体并诱导其在大肠杆菌BL2 1(DE3)的表达 ,用Western -blotting测定以融合蛋白方式表达的Sj2 8GST的免疫原性 ,通过包涵体纯化结合Ni+柱亲和层析获得高纯度重组融合蛋白。结果　Sj2 8GSTPCR产物为约 6 4 0bp ,其碱基序列 (6 33bp)和推导的氨基酸序列 (2 11aa)与GenBank报道一致 ;获得了Sj2 8GST -TRX重组质粒 ;2 8GST -TRX融合蛋白在大肠杆菌以包涵体形式高效表达 ;在分子量为约 4 3kDa处有一能与羊抗Sj2 8GST抗体产生特异性反应的含 2 8GST融合蛋白条带 ;包涵体纯化法结合Ni+ 亲和层析可获得高纯度的重组融合蛋白。结论　获得到了日本血吸虫中国大陆株 2 8GST分子的全长基因和高纯度重组 2 8GST -TRX融合蛋白 ,该融合蛋白具有天然Sj2 8GST免疫原性。     

日本血吸虫(中国大陆株)线粒体相关的重组融合蛋白(rSj338/26GST)的免疫原性鉴定

目的：鉴定纯化的重组日本血吸虫线粒体相关融合蛋白（rSj338/26GST）的免疫原性。方法：对已构建的阳性表达菌pGEX-6p-1/Sj338进行大量诱导表达，并对纯化蛋白进行活性分析。将粗提包涵体蛋白、复性包涵体蛋白、经分子筛纯化并复性的蛋白分别免疫新西兰家兔2只。用Western blot及Dot-ELISA方法检测特异性抗体的免疫原性及各组抗体水平。结果：用分子筛纯化的融合蛋白rSj338/26GST经SDS－PAGE电泳鉴定显示达电泳纯；Western blot显示纯化蛋白能够被日本血吸虫重感染兔血清及rSj338/26GST免疫兔血清识别。Dot-ELISA法检测结果表明，经分子筛纯化并复性的rSj338/26GST融合蛋白免疫兔血清中特异性抗体的滴度最高，为1：51200。结论：纯化后的融合蛋白rSj338/26GST具有较高的纯度及较强的免疫活性，可望作为日本血吸虫病疫苗候选分子，值得进一步深入研究。     

日本血吸虫热休克蛋白40 kDa免疫学功能研究

目的探索日本血吸虫热休克蛋白40 k Da(Sj HSP40)免疫学功能。方法采用生物信息学方法分析Sj HSP40蛋白序列同源性,并预测其B细胞及T细胞表位。应用PCR技术扩增全长Sj HSP40基因,将其克隆入原核表达质粒p GEX-6P-1,再转入大肠埃希菌BL21中;以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,再经亲和柱分离纯化获得谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-Sj HSP40融合蛋白,分别采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blotting进行鉴定。以GST-Sj HSP40免疫BALB/c小鼠后,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中抗Sj HSP40特异性Ig G抗体及其亚型Ig G1、Ig G2a抗体,采用流式检测术观察Sj HSP40对CD4+T细胞亚群分化的影响。结果 Sj HSP40含有7个潜在B细胞表位及多个T细胞表位(CTL表位和Th表位)。成功构建了原核表达重组质粒p GEX-6P-1-Sj HSP40,并通过诱导表达和蛋白纯化获得GST-Sj HSP40融合蛋白。与其他组相比,GST-Sj HSP40免疫小鼠血清中抗Sj HSP40特异性Ig G抗体及其亚型Ig G1和Ig G2a水平均显著升高,但Sj HSP40对CD4+T淋巴细胞分化无显著影响。结论 Sj HSP40可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,但不影响小鼠体内各类Th免疫反应平衡,可作为潜在疫苗候选分子。     

屋尘螨重组变应原Der p 2的表达、纯化及免疫学活性鉴定

目的大量诱导表达含pET24a-Derp2质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,经包涵体洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用梯度复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Western blot方法分析Derp2重组蛋白的免疫学特性。纯化后的融合蛋白Derp2具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。     

日本血吸虫Sj-Ts1基因的亚克隆表达与免疫保护效果测定

在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)Sj -Ts1融合蛋白并测定其免疫保护效果。将Sj-Ts1基因亚克隆至 pGEX - 5X - 3原核载体 ,转化入大肠杆菌ER2 5 6 6 ,并用IPTG对该重组菌进行诱导表达中。将此表达产物进行WesternBlot分析后免疫小鼠 ,免疫剂量为 10 0 μg/次 /鼠。并设蛋白佐剂对照和PBS对照。免疫三次后进行攻击感染 ,计数虫负荷及肝卵负荷。在IPTG诱导下 ,亚克隆至 pGEX - 5X - 3的Sj-Ts1基因在大肠杆菌内高效表达融合蛋白SjGST -Ts1,用此融合蛋白免疫小鼠 ,能诱导产生 2 4 16 %的减虫率和 4 8 74 %的减卵率。Sj-Ts1基因亚克隆至 pGEX -5X - 3载体后可在大肠杆菌中高效表达 ,表达产物可诱导小鼠产生一定程度的抗Sj保护性免疫力。     

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组复性后体外免疫反应性研究

目的分析基因工程生产的弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)的体外免疫反应性,并对表达产物进行复性处理以获得表达产物的天然构象,为体内免疫学活性的研究作准备。方法重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株,经IPTG诱导的表达产物超声破壁后,SDS-PAGE分析表达产物的表达形式,对产生的重组蛋白ROP2-P30过Sephadex G-25交联葡聚糖柱,经尿素梯度洗脱进行目的蛋白的复性,通过免疫共沉淀反应及免疫印迹实验检测其复性后的重组蛋白的免疫反应性。结果重组质粒pET28b/ROP2-P30在大肠杆菌中以融合形式表达,融合表达的产物主要以包涵体形式存在,该重组蛋白复性后具有明显的免疫反应性。结论利用SephadexG-25交联葡聚糖柱尿素梯度可以复性重组的弓形虫复合蛋白ROP2-P30,该蛋白复性后体外具有免疫反应性,可用于进一步开展弓形虫病复合型疫苗的研制工作。     

Sj43B基因编码蛋白的日本血吸虫虫体组织定位

目的确定Sj43B基因编码蛋白在日本血吸虫成虫体内组织及亚细胞水平定位。方法取新鲜日本血吸虫成虫标本,按电镜生物样品制备方法常规固定、包埋,制成超薄切片,与鼠源纯化的抗重组Sj43B基因编码蛋白的IgE抗体(对照组试验为正常鼠血清)反应,再与大鼠抗小鼠IgE的IgG抗体结合,最后与蛋白A-胶体金连接,透射电镜下观察胶体金颗粒的分布。结果用正常鼠血清处理虫体切片,从皮层、肌层到皮层细胞体,未见有明显的电子致密的胶体金颗粒分布。用特异性IgE抗体处理的样品上,胶体金颗粒分布较广泛,见于皮层、肌层、胞质、核膜和核质内。结论Sj43B基因编码蛋白在血吸虫成虫体内的分布无组织和亚细胞结构特异性。     

Sj43B基因编码蛋白的日本血吸虫虫体组织定位

目的确定Sj43B基因编码蛋白在日本血吸虫成虫体内组织及亚细胞水平定位。方法取新鲜日本血吸虫成虫标本，按电镜生物样品制备方法常规固定、包埋，制成超薄切片．与鼠源纯化的抗重组Sj43B基因编码蛋白的IgE抗体（对照组试验为正常鼠血清）反应，再与大鼠抗小鼠IgE的IgG抗体结合，最后与蛋白A-胶体金连接，透射电镜下观察胶体金颗粒的分布。结果用正常鼠血清处理虫体切片，从皮层、肌层到皮层细胞体，未见有明显的电子致密的胶体金颗粒分布。用特异性IgE抗体处理的样品上，胶体金颗粒分布较广泛，见于皮层、肌层、胞质、核膜和核质内。结论Sj43B基因编码蛋白在血吸虫成虫体内的分布无组织和亚细胞结构特异性。     

伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白类似基因的原核表达和抗体制备

目的 克隆伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白（PbTIP）类似基因,原核表达PbTIP重组蛋白,并制备其抗血清。 方法 在GenBank中检索PbTIP类似基因序列,设计特异性引物,从伯氏疟原虫ANKA株扩增获得该基因cDNA片段,克隆入原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠埃希菌BL21（DE3）。经异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）鉴定重组蛋白。用重组蛋白GST-PbTIP包涵体免疫BALB/c小鼠,以间接荧光抗体试验(IFAT)和Western blotting鉴定产生的抗体。 结果 获得了纯化的重组蛋白GST-PbTIP及其相应抗体,该抗体可以识别相对分子质量（Mr）约为60 000的伯氏疟原虫感染红细胞内的PbTIP蛋白。 结论 获得PbTIP重组蛋白及其相应抗体。     

日本血吸虫21.7kDa膜蛋白的表达及特性分析

目的　对日本血吸虫中国大陆株 2 1 .7kDa膜蛋白分子 (SjC2 1 .7)进行体外重组表达 ,纯化并分析其免疫特性。　方法　将SjC2 1 .7分子基因亚克隆到表达载体 pGEX 4T 3中构建重组表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导 ,表达GST SjC2 1 .7融合蛋白 ,用亲和层析及蛋白酶切制备纯化的重组SjC2 1 .7分子。将重组SjC2 1 .7免疫小鼠制备抗血清 ,用Westernblotting分析其免疫特性。　结果　SjC2 1 .7分子基因被成功地克隆到表达质粒 pGEX 4T 3中 ,并获得能表达GST SjC2 1 .7融合蛋白的转化子。纯化的重组SjC2 1 .7蛋白免疫昆明鼠能产生高效价的抗体。该重组蛋白能被免疫鼠血清和重感染兔血清所识别 ,免疫鼠血清能识别成虫抗原 (AWA)中相应分子量的蛋白质条带。　结论　本研究获得具有较好免疫原性的重组SjC2 1 .7蛋白质分子 ,为进一步研究其免疫保护性作用奠定了基础     

安氏隐孢子虫热休克蛋白编码基因的克隆、表达和分析

目的 克隆、表达和分析安氏隐孢子虫Mr 70 000热休克蛋白（CaHSP70） 的部分编码基因。 方法 依据公布的CaHSP70基因序列设计引物，以江苏徐州安氏隐孢子虫（XZ-BOV）总RNA为模板，反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。PCR产物经TA克隆后，亚克隆入pET28a原核表达载体，构建重组质粒pET28a-CaHSP70，转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并获得纯化的重组蛋白（简称为rCaHSP70）。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹（Western blotting）和ELISA对该重组蛋白进行分析和鉴定。采用相关生物信息学软件对序列进行分析。 结果 根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的CaHSP70一致。SDS-PAGE和Western blotting分析显示，重组蛋白（rCaHSP70） Mr约为43 000（含6个组氨酸），以包涵体的形式存在，可被辣根过氧化物酶标记的抗组氨酸抗体、安氏隐孢子虫感染的小鼠血清、微小隐孢子虫感染的儿童血清和rCaHSP70免疫小鼠血清识别。rCaHSP70存在多个功能位点和潜在的抗原决定簇。种系发生分析表明XZ-BOV与安氏隐孢子虫进化关系最近。ELISA检测结果表明，rCaHSP70免疫的C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠血清特异性抗体滴度均显著高于免疫前。 结论 XZ-BOV HSP70部分编码基因的克隆获得成功，研究获得的重组蛋白具有一定的免疫原性和免疫反应性。     

乙型肝炎病毒核心抗原与表面抗原"a"决定簇融合疫苗的免疫效果

目的 评价乙型肝炎病毒核心蛋白作为类病毒颗粒载体融合表面抗原"a"决定簇的基因疫苗和蛋白疫苗的免疫效果,为寻求有效的慢性乙型肝炎治疗性疫苗奠定基础.方法 体外分别扩增编码乙型肝炎病毒HBsAg 100～162 aa部分、HBcAg 1～78 aa部分和HBcAg 83～144aa的基因序列,目的 基因连接后定向克隆到真核表达载体pcDNA3的多克隆位点内.将嵌合基因亚克隆到原核表达载体,诱导表达并纯化获得融合蛋白.分别用真核表达质粒和纯化融合蛋白免疫BALB/c小鼠,加强免疫并定期采血,检测血清中特异性抗体并进行淋巴细胞增殖实验以评价体液和细胞免疫应答效果.实验结果进行重复测量资料的方差分析和单向方差分析. 结果嵌合基因免疫后可以产生有效的抗-HBs"体液免疫"应答,免疫0、2、4、6、8、10、12,14周时的S/N值分别为1.05±0.20、2.69±0.38、4.48±0.50、6.61±0.49、6.95±0.19、7.43±0.31、8.11±0.14、7.43±0.31,F值分别为1202.021和200.059,P<0.01.未引起明显的抗-HBc"体液免疫"应答却获得了明显的HBcAg特异性细胞免疫应答.融合蛋白免疫后也能获得有效的抗-HBs"体液免疫"应答,但针对HacAg的体液应答却较强;可以产生较强的HBcAg特异性增殖反应,而没有明显的HBsAg特异性增殖反应.嵌合基因免疫组较融合蛋白组的细胞免疫应答明显增强,体液免疫应答相对较弱. 结论 以该乙型肝炎病毒核心蛋白为载体的包含HBsAg"a"决定簇的融合基因疫苗相对于其融合蛋白具有良好的细胞和体液免疫效果.     

日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白对小鼠免疫保护性的初步研究

目的 研究日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白（rSj338/26GST)对小鼠的免疫保护性，预测其作为血吸虫疫苗候选分子的潜能。方法 将编码日本血吸虫线粒体相关蛋白的cDNA经PCR扩增后亚克隆人载体质粒pGEX-6p-1进行表达，并用表达的重组抗原的融合蛋白免疫BABL／c小鼠。结果 与对照组相比，rSj338/26GST重组蛋白免疫小鼠获得了32．3％的减虫率及46．5％肝总减卵率；与Sj26GST免疫组相比，rSj338抗原可能使小鼠获得22．5％的减虫率及30．0％的肝总 减卵率。结论 证明重组的日本血吸虫线粒体相关蛋白(rSj338/26GST及rSj338)可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力，可望成为新的疫苗候选分子。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。