透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞外基质表达的影响

背景:软骨细胞代谢异常引起细胞外基质降解和修复失衡是骨性关节炎的重要病理变化。透骨消痛胶囊具有补肾柔肝、活血祛风的功效,临床实验证实其对防治骨性关节炎有较好疗效。目的:观察透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞外基质表达的影响。方法:取SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,第3代软骨细胞同步化后进行干预。50只SD大鼠抽签法随机分为5组,用药量按照人体与动物药物等效剂量换算,空白组:生理盐水进行灌胃;对照组:壮骨关节丸水溶液灌胃;实验组:透骨消痛胶囊水溶液按0.145,0.290,0.580mg/(g·d)进行灌胃。各组均连续给药3d,采血前禁食12h,末次给药1h后腹主动脉采血,制备血清。结果与结论:Ⅱ型胶原免疫组织化学染色可见透骨消痛胶囊实验组Ⅱ型胶原表达强于空白组及对照组;透骨消痛胶囊实验组CollagenⅡ、蛋白聚糖、Aggrecan mRNA基因表达明显升高(P<0.01),Cathepsin K mRNA基因表达明显降低(P<0.01)。提示透骨消痛胶囊含药血清能上调软骨细胞CollagenⅡ、蛋白聚糖、Aggrecan mRNA基因表达,下调Cathepsin K mRNA基因表达,促进细胞外基质合成,调控细胞外基质和软骨细胞之间的动态平衡。     

透骨消痛胶囊对凋亡软骨细胞Rac1和Cdc42表达的影响

背景：透骨消痛胶囊治疗早、中期骨性关节炎有较好疗效,但作用机制尚未完全阐明。小GTP酶Rho能够抑制软骨细胞肥大分化,促进软骨细胞的凋亡。
　　目的：观察透骨消痛胶囊对体外培养凋亡大鼠关节软骨细胞Rac1和Cdc42的影响,并初步探讨其防治骨性关节炎的作用机制。
　　方法：采用4周龄SD大鼠膝关节软骨建立稳定的软骨细胞体外培养体系,采用甲苯胺蓝染色法对第3代软骨细胞进行鉴定。用20μg/L的肿瘤坏死因子α诱导体外培养软骨细胞的凋亡,诱导成功后,给予透骨消痛胶囊(500,100,20 mg/L)孵育24 h后,分别用MTT法检测各组软骨细胞的存活率,用流式细胞仪检测各组软骨细胞的线粒体膜电位情况,Western Blot检测各组软骨细胞Rac1,Cdc42,Bcl-2及Bax蛋白表达。结果与结论：透骨消痛胶囊能够减少肿瘤坏死因子α所致的软骨细胞凋亡,提高线粒体膜电位,提高细胞的存活率,同时能够下调Rac1,Cdc42,Bax蛋白的表达,上调Bcl-2蛋白表达,差异均有显著性意义(P<0.05)。提示透骨消痛胶囊可能通过下调Rac1,Cdc42和 Bax蛋白表达,增加凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达,从而抑制软骨细胞的凋亡,而起到治疗骨性关节炎的疗效。     

透骨消痛胶囊对体外关节软骨细胞Caspase-9和Caspase-3表达的影响

目的:观察透骨消痛胶囊对大鼠体外培养关节软骨细胞凋亡的影响。方法:采用4周龄SD大鼠膝关节软骨建立稳定的软骨细胞体外培养体系,采用Ⅱ型胶原对第3代软骨细胞进行鉴定。用20 ng/ml TNF-α诱导体外培养软骨细胞的凋亡,诱导成功后,给予不同浓度的透骨消痛胶囊干预24 h后,镜下观察软骨细胞的生长情况;采用MTT法检测各组软骨细胞的存活率;DAPI染色观察各组软骨细胞的凋亡情况,分光光度法检测凋亡软骨细胞中Caspase-9和Caspase-3活性。结果:透骨消痛胶囊能够减轻软骨细胞的核固缩,减少软骨细胞凋亡,提高细胞的存活率,同时能够下调Caspase-9和Caspase-3活性。结论:透骨消痛胶囊可以通过下调Caspase-9和Caspase-3活性,抑制软骨细胞的凋亡,从而起到治疗骨性关节炎的作用。     

透骨消痛胶囊促进成骨细胞的增殖和分化

背景：透骨消痛胶囊是福建中医药大学治疗骨关节炎的临床验方,以往的研究多集中于其对软骨的作用。目的：观察透骨消痛胶囊对成骨细胞增殖、分化及骨重塑相关因子表达的影响。方法：以透骨消痛胶囊干预大鼠成骨细胞 ROS17/2.8,分空白对照组和各浓度透骨消痛胶囊组,MTT 法测定细胞增殖,比色法检测成骨细胞分化的生物标志物碱性磷酸酶活性,ELISA 法检测骨钙素,茜素红染色观察骨矿化结节,实时定量 PCR 和 ELISA 法检测骨重塑相关因子骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达。结果与结论：与对照组相比,质量浓度为 0.25-2 g/L 透骨消痛胶囊能显著促进 ROS17/2.8 细胞增殖（P 〈 0.05）,上调碱性磷酸酶活性（P 〈 0.05）、骨钙素的表达水平（P 〈 0.05）和矿化结节面积（P 〈 0.05）,增加骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的比例（P 〈 0.05）。提示透骨消痛胶囊防治骨关节炎的作用机制可能与其促进成骨细胞的增殖、分化以及调节骨重塑平衡的作用有关。     

透骨消痛颗粒诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:研究表明,透骨消痛颗粒通过有效抑制细胞因子、基质金属蛋白酶3、氧自由基的生物效应来延缓关节宏观形态、软骨基质及软骨细胞退变的作用.目的:验证透骨消痛颗粒含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖和诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-12/2007-08在福建中医学院中西医结合研究院分子生物学实验室完成.材料:选用清洁级4周龄SD大鼠80只.透骨消痛颗粒,由巴戟天、杭白芍、青风藤、川芎等组成,由福州屏山药厂制作.方法:取72只SD大鼠随机分为5组,透骨消痛颗粒的水提物高剂量组、水提物中剂量组、水提物低剂量组、醇提物组各16只,空白对照组8只,分别以含14,7,3.5g/(kg·d)药量的水溶液2 mL灌胃,对照组以等量生理盐水2 mL灌胃,2次,d,连续给约3 d后,腹主动脉采血制备血清.从另8只4周龄SD大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞,体外传代培养,取第2代骨髓间充质干细胞分为空白对照组、软骨诱导剂组及透骨消痛颗粒组,通过透骨消痛颗粒含药血清诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化.主要观察指标:采用MTT法检测骨髓间充质干细胞增殖和免疫组织化学检测Ⅱ型胶原在细胞分化过程中的表达.结果:透骨消痛颗粒含约血清各组均能促进骨髓间充质干细胞增殖,与空白对照组相比差异均有非常显著性意义(P＜0.01),中剂量约物浓度时达到最大效应(P＜0.01),中剂量1 h组与2 h组相比差异无显著性意义(P＞0.05).透骨消痛颗粒含药血清能增强Ⅱ型胶原在细胞分化过程中的表达,与空白对照组相比差异有非常显著性意义(P＜0.01),与软骨诱导剂组相比差异有显著性意义(P＜0.05).结论:透骨消痛颗粒含药血清能有效促进骨髓间充质干细胞增殖和诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化.     

透骨消痛胶囊防治骨性关节炎的化学空间分析

目的从化学空间角度探讨透骨消痛胶囊防治骨性关节炎的作用机制。方法运用计算机方法对透骨消痛胶囊中分子组成的数据集及药物分子/类药分子数据集进行化学空间分析,对一些特征描述符的分布进行了描述,同时采用主成分分析方法将多维化学空间映射到二维空间以得到更直观的图像。结果透骨消痛胶囊中分子与药物分子/类药分子在化学空间有较好的重叠。结论本方法直观地揭示了透骨消痛胶囊防治骨性关节炎的重要意义。     

透骨消痛颗粒对关节软骨细胞wnt/β-连环蛋白信号通路的调控

背景:由巴戟天、杭白芍、肿节风和川芎等组成的透骨消痛颗粒能有效延缓关节宏观形态、软骨基质及软骨细胞退变.目的:观察透骨消痛颗粒对软骨细胞wnt/β-连环蛋白信号通路中Wnt4、糖原合成酶3.及.-连环蛋白的影响.方法:将SD 大鼠关节软骨细胞分离培养成功后,人白细胞介素 1β诱导软骨细胞退变,取第2 代退变软骨细胞,随机分为对照组和透骨消痛颗粒组,后者加入透骨消痛颗粒醇提物,分别培养4,8 d 后,采用RT-PCR 检测2 组Wnt4、糖原合成酶3β、β-连环蛋白mRNA 表达,采用蛋白印迹法检测Wnt4、糖原合成酶3β及β-连环蛋白表达.结果与结论:采用人白细胞介素1β可诱导软骨细胞退变,软骨细胞退变早期均有Wnt4、糖原合成酶3β及β-连环蛋白表达,但随着时间推移Wnt4、β-连环蛋白表达下降,而糖原合成酶3β表达增高,采用透骨消痛颗粒醇提物干预后均可逆转上述现象.说明透骨消痛颗粒醇提物能诱导软骨细胞转录合成.-连环蛋白和Wnt4 蛋白,并抑制糖原合成酶3β表达.     

透骨消痛颗粒对关节软骨细胞wnt/β-连环蛋白信号通路的调控

背景：由巴戟天、杭白芍、肿节风和川芎等组成的透骨消痛颗粒能有效延缓关节宏观形态、软骨基质及软骨细胞退变。目的：观察透骨消痛颗粒对软骨细胞wnt/β-连环蛋白信号通路中Wnt4、糖原合成酶3β及β-连环蛋白的影响。方法：将SD大鼠关节软骨细胞分离培养成功后,人白细胞介素1β诱导软骨细胞退变,取第2代退变软骨细胞,随机分为对照组和透骨消痛颗粒组,后者加入透骨消痛颗粒醇提物,分别培养4,8d后,采用RT-PCR检测2组Wnt4、糖原合成酶3β、β-连环蛋白mRNA表达,采用蛋白印迹法检测Wnt4、糖原合成酶3β及β-连环蛋白表达。结果与结论：采用人白细胞介素1β可诱导软骨细胞退变,软骨细胞退变早期均有Wnt4、糖原合成酶3β及β-连环蛋白表达,但随着时间推移Wnt4、β-连环蛋白表达下降,而糖原合成酶3β表达增高,采用透骨消痛颗粒醇提物干预后均可逆转上述现象。说明透骨消痛颗粒醇提物能诱导软骨细胞转录合成β-连环蛋白和Wnt4蛋白,并抑制糖原合成酶3β表达。     

兔软骨细胞与脱细胞软骨基质的生物相容性

目的：将体外培养的兔软骨细胞种植到脱细胞软骨基质上，进行细胞形态学观察、细胞黏附及增殖活性的测定，检测制备的脱细胞软骨基质与软骨细胞的相容性，分析脱细胞软骨基质作为软骨组织工程支架的可能性。 方法：实验于2005-03／09在哈尔滨医科大学附属第二医院科研中心完成。选取兔龄6个月的清洁级健康雄性日本大耳白兔，麻醉后无菌条件下显露兔双侧膝关节，切取股骨远端和胫骨近端关节软骨，经脱细胞处理制备成脱细胞软骨基质微粒作为软骨支架，并分离培养软骨细胞。将培养至第2代的软骨细胞用于实验，随机分为脱细胞基质组和空白对照组，每组复孔为6孔。脱细胞基质组将脱细胞基质颗粒单层铺满培养板孔底，接种软骨细胞。空白对照组单纯接种软骨细胞。倒置显微镜及扫描电镜观察软骨细胞与脱细胞软骨基质的黏附情况，通过四甲基偶氮唑盐法检测细胞接种2，6，12，24h细胞黏附性，测定细胞接种后1，3，5，7d时细胞的增殖活性，测定细胞培养1，2，3d时上清液中的羟脯氨酸含量。 结果：①软骨细胞在脱细胞基质上黏附的形态学观察：扫描电镜观察脱细胞基质颗粒呈不规则多角形，软骨巢内的软骨细胞消失，表面粗糙不平。倒置相差显微镜下观察软骨细胞刚开始为小圆形，折光性较强，接种2h后有少量细胞开始黏附于脱细胞基质上，随时间的延长细胞黏附数量增加。②接种后不同时间点两组软骨细胞黏附情况的测定结果：与空白对照组比较，接种2h时脱细胞基质组软骨细胞黏附性明显降低（P〈0．05），而在接种6，12，24h时两组基本相似（P〉0．05）。③接种后不同时间点两组软骨细胞增殖能力的比较：接种1，3，5，7d时。脱细胞基质组软骨细胞增殖活性分别高于空白对照组21．4％．32．7％,32．5％，25．4％，差异显著（P〈0．05）。④接种后不同时间点两组软骨细胞羟脯氨酸含量的比较：接种后第1，2天，脱细胞基质组上清液中的羟脯氨酸含量与空白对照组接近（P〉0．05）。接种第3天时，脱细胞基质组羟脯氨酸含量高于空白对照组20．28％，差异显著（P〈0．05）。 结论：实验制备的脱细胞软骨基质能够明显刺激增殖软骨细胞，且与软骨细胞具有良好的相容性，为组织工程支架的应用提供了新的材料。     

兔软骨细胞与脱细胞软骨基质的生物相容性

目的:将体外培养的兔软骨细胞种植到脱细胞软骨基质上,进行细胞形态学观察、细胞黏附及增殖活性的测定,检测制备的脱细胞软骨基质与软骨细胞的相容性,分析脱细胞软骨基质作为软骨组织工程支架的可能性。方法:实验于2005-03/09在哈尔滨医科大学附属第二医院科研中心完成。选取兔龄6个月的清洁级健康雄性日本大耳白兔,麻醉后无菌条件下显露兔双侧膝关节,切取股骨远端和胫骨近端关节软骨,经脱细胞处理制备成脱细胞软骨基质微粒作为软骨支架,并分离培养软骨细胞。将培养至第2代的软骨细胞用于实验,随机分为脱细胞基质组和空白对照组,每组复孔为6孔。脱细胞基质组将脱细胞基质颗粒单层铺满培养板孔底,接种软骨细胞。空白对照组单纯接种软骨细胞。倒置显微镜及扫描电镜观察软骨细胞与脱细胞软骨基质的黏附情况,通过四甲基偶氮唑盐法检测细胞接种2,6,12,24h细胞黏附性,测定细胞接种后1,3,5,7d时细胞的增殖活性,测定细胞培养1,2,3d时上清液中的羟脯氨酸含量。结果:①软骨细胞在脱细胞基质上黏附的形态学观察:扫描电镜观察脱细胞基质颗粒呈不规则多角形,软骨巢内的软骨细胞消失,表面粗糙不平。倒置相差显微镜下观察软骨细胞刚开始为小圆形,折光性较强,接种2h后有少量细胞开始黏附于脱细胞基质上,随时间的延长细胞黏附数量增加。②接种后不同时间点两组软骨细胞黏附情况的测定结果:与空白对照组比较,接种2h时脱细胞基质组软骨细胞黏附性明显降低(P<0.05),而在接种6,12,24h时两组基本相似(P>0.05)。③接种后不同时间点两组软骨细胞增殖能力的比较:接种1,3,5,7d时,脱细胞基质组软骨细胞增殖活性分别高于空白对照组21.4%,32.7%,32.5%,25.4%,差异显著(P<0.05)。④接种后不同时间点两组软骨细胞羟脯氨酸含量的比较:接种后第1,2天,脱细胞基质组上清液中的羟脯氨酸含量与空白对照组接近(P>0.05)。接种第3天时,脱细胞基质组羟脯氨酸含量高于空白对照组20.28%,差异显著(P<0.05)。结论:实验制备的脱细胞软骨基质能够明显刺激增殖软骨细胞,且与软骨细胞具有良好的相容性,为组织工程支架的应用提供了新的材料。     

透骨消痛颗粒含药血清诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化

背景：骨髓基质干细胞根据环境而有不同的分化路径,在特定的环境中有分化为透明软骨细胞的趋势,可能为治疗骨性关节炎提供新思路。目的：观察透骨消痛颗粒含药血清对骨髓基质干细胞向软骨分化的影响。方法：取SD大鼠四肢建立体外培养的骨髓基质干细胞,取第3代骨髓基质干细胞进行干预,分为生理盐水血清组、透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒水提物血清＋诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清＋诱导软骨剂组。Real time PCR及Western Blot检测Sox9、collagenⅡ、collagenⅩ mRNA及蛋白表达。结果与结论：含药血清干预14d后,Sox9、collagenⅡ、collagenⅩ mRNA及蛋白表达水平,透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清＋诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清＋诱导软骨剂组明显高于生理盐水血清组（P〈0.05,P〈0.01）,诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清＋诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清＋诱导软骨剂组明显高于透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组（P〈0.01）,其中Sox9表达透骨消痛颗粒水提物血清＋诱导软骨剂组高于诱导软骨。说明透骨消痛颗粒含药血清通过上调Sox9的表达,加速骨髓基质干细胞细胞向软骨细胞分化。     

透骨消痛胶囊干预膝骨性关节炎软骨下骨重塑的分子机制

背景:前期研究表明透骨消痛胶囊能有效治疗膝骨性关节炎,且对膝关节软骨有保护作用,软骨下骨重塑在骨性关节炎病理进程中起重要作用。目的:观察透骨消痛胶囊干预骨性关节炎软骨下骨重塑的作用及并探讨其作用机制。方法:新西兰大白兔分为正常组、模型组、壮骨关节丸组、透骨消痛胶囊组4组。除正常组外动物均按改良Hulth法造模。正常组、模型组兔每天给予生理盐水灌胃;壮骨关节丸组兔每天给予壮骨关节丸水溶液灌胃;透骨消痛胶囊组兔每天给予透骨消痛胶囊水溶液灌胃。结果与结论:造模后6,9,12周,透骨消痛胶囊组软骨下骨CyclinD1基因、胰岛素样生长因子1、细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达均显著高于正常组(P<0.05)。与模型组比较,造模后1周,透骨消痛胶囊组Cyclin D1 mRNA表达较低(P<0.05);造模后6周,透骨消痛胶囊组细胞核因子κB受体活化因子配体表达较低(P<0.05);造模后9,12周,透骨消痛胶囊组各项指标表达均较低(P<0.05)。与壮骨关节丸组比较,造模1周后,透骨消痛胶囊组Cyclin D1 mRNA表达较低(P<0.05);6周时透骨消痛胶囊组细胞核因子κB受体活化因子配体表达较低(P<0.05);9,12周后,透骨消痛胶囊组胰岛素样生长因子1mRNA表达较低(P<0.05)。提示透骨消痛胶囊可改变软骨下骨重塑的速率和模式,最终减轻软骨下骨硬化。     

透骨消痛胶囊调节Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路抑制骨关节炎炎症反应的机制研究

目的:探讨透骨消痛胶囊调节Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路抑制骨关节炎炎症反应的作用机制。方法:取4周龄SD雄性大鼠的双侧膝关节软骨,经Ⅱ型胶原酶消化法获得大鼠软骨细胞,并采用Ⅱ型胶原免疫组化法对所得细胞进行鉴定;取第2代软骨细胞分为空白组、模型组(10 ng/mL LPS干预8 h)、抑制剂组(10 ng/mL U0126先干预30 min后再加入10 ng/mL LPS干预8 h)、透骨消痛胶囊组(10 ng/mL LPS+300μg/mL透骨消痛胶囊一同干预8 h)。采用Western blot检测软骨细胞中Ras、Raf、p-ERK1/2、MEK1/2、MMP-3和MMP-13蛋白表达,qPCR检测软骨细胞中MEK1/2、ERK1/2、MMP-3和MMP-13基因表达及miR-27b、miR-34a和miR-146a表达。结果:(1)软骨细胞经Ⅱ型胶原免疫组化处理后,阳性组细胞胞浆被染为棕黄色,阴性组不显色,表明所提取细胞为软骨细胞。(2)与空白组相比,模型组中Ras、Raf、MEK1/2、MMP-3和MMP-13蛋白表达明显升高(P0.01,P0.05),p-ERK1/2蛋白表达量也升高,但差异无统计学意义(P0.05);与模型组相比,抑制剂组与透骨消痛胶囊组Ras、Raf、MEK1/2、p-ERK1/2、MMP-3、MMP-13蛋白表达均下降(P0.01,P0.05);透骨消痛胶囊组与模型组相比,MEK1/2蛋白表达降低,但差异无统计学意义(P0.05)。(3)与空白组相比,模型组中MEK1/2、ERK1/2、MMP-3、MMP-13基因表达明显升高(P0.01);与模型组相比,透骨消痛胶囊组与抑制剂组上述基因表达均下降(P0.01,P0.05)。(4)模型组miR-27b的表达低于空白组(P0.01),抑制剂组、透骨消痛胶囊组miR-27b的表达高于模型组(P0.01);模型组miR-34a、miR-146a的表达均高于空白组(P0.01,P0.05),而抑制剂组、透骨消痛胶囊组均低于模型组(P0.01,P0.05)。结论:透骨消痛胶囊通过调控Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路中关键因子及miR-27b、miR-34a和miR-146a的表达,调节软骨细胞炎症反应,从而抑制骨关节炎炎症,保护关节软骨。     

骨性关节炎模型大鼠关节软骨变化及透骨消痛胶囊干预的作用

背景：透骨消痛胶囊是治疗骨性关节炎的临床验方,作用机制尚未完全阐明。尿激酶型纤溶酶原激活系统参与关节软骨的细胞外基质降解及关节滑膜增生,在骨性关节炎的病理过程中起着重要作用。目的：观察透骨消痛胶囊对膝骨性关节炎模型大鼠软骨中尿激酶型纤溶酶原激活系统的影响。方法：SD大鼠144只,随机取120只采用关节腔注射木瓜蛋白酶复制大鼠膝骨性关节炎模型,并随机分为模型组、壮骨关节丸组[1.2 g/（kg·d）]、透骨消痛胶囊低剂量组[0.092 g/（kg·d）]、透骨消痛胶囊中剂量组[0.184 g/（kg·d）]和透骨消痛胶囊高剂量组[0.368 g/（kg·d）],每组24只,每2周为1个疗程,中间休息2 d,共4个疗程。另取24只正常大鼠为空白组。每2个疗程后,处死一批实验动物,苏木精-伊红染色观察软骨组织病理改变;免疫组织化学反应观察尿激酶型纤溶酶原激活剂、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体、纤溶酶原激活物抑制因子阳性表达情况;Western blot检测尿激酶型纤溶酶原激活剂、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体、纤溶酶原激活物抑制因子蛋白表达情况。结果与结论：透骨消痛胶囊组和壮骨关节丸组的骨性关节炎大鼠关节软骨 Mankin’s 评分较模型组明显降低（P 〉0.01）,具有时间依赖;免疫组织化学反应显示,透骨消痛胶囊组和壮骨关节丸组尿激酶型纤溶酶原激活剂、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体的阳性率明显降低,而纤溶酶原激活物抑制因子明显升高,具有时间依赖。Western blot检测结果与免疫组织化学具有相同的趋势。提示透骨消痛胶囊可能通过调控尿激酶型纤溶酶原激活剂系统对骨性关节炎发挥防治作用。     

四环素对兔膝骨关节炎负重模型软骨基质金属蛋白酶1表达的影响

目的:观察四环素对兔膝骨关节炎负重模型软骨基质金属蛋白酶1表达的影响,探讨其对骨关节炎防治的有效性及其机制。方法:实验于2005-03/05在武汉科技大学医学院药理实验室进行。①分组处理:18只日本大耳白随机分为假手术组,模型组和给药组各6只。模型组和给药组将兔右侧膝关节前交叉韧带切断造成关节不稳定后,以石膏将左后腿固定于腹部,右后腿负重锻炼造成负重损伤,给药组每日给予四环素(35～40mg/kg)灌胃,其他2组给予等量生理盐水。②观察指标:4周后通过大体形态观察了解股骨内髁关节面的病理改变;苏木精-伊红染色观察软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色结果观察蛋白多糖和胶原等基质含量;并检测软骨基质金属蛋白酶1水平。结果:18只兔进入结果分析。①大体观察结果:模型组出现软骨的退变,给药组较模型组关节退变为轻(P<0.05)。②关节软骨细胞形态和基质变化:模型组出现软骨表层缺损,表中层细胞明显减少,甲苯胺蓝染色明显减退;给药组仅见表层软骨细胞减少甲苯胺蓝染色较模型组深。③软骨基质金属蛋白酶1水平:假手术组呈阴性表达,给药组阳性表达率低于模型组[(63±6)%,(82±4)%,P<0.01]。结论:四环素可减轻兔膝骨关节炎负重模型的关节退行变性,减少软骨破坏和软骨基质丢失,其作用可能与四环素控制软骨基质金属蛋白酶1表达增高有关。     

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨透骨消痛胶囊含药血清对经TNF-α诱导的软骨细胞多靶点保护作用

目的观察透骨消痛胶囊含药血清对经TNF-α诱导的软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响,探讨其对关节软骨细胞的多靶点保护作用。方法将4周龄SD大鼠关节分离软骨细胞进行体外培养、传代,用免疫组化法鉴定第三代软骨细胞。以第3代软骨细胞为靶细胞,分为正常组、模型组和治疗组,模型组和治疗组用TNF-α诱导软骨细胞凋亡后,分别给予生理盐水血清和透骨消痛胶囊含药血清作用24 h,Western blot法观察各组软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Wnt 4、β-catenin和GSK-3β的表达。结果 (1)细胞鉴定结果为Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性,由此说明分离细胞为软骨细胞。(2)与正常组相比,模型组Wnt 4和β-catenin表达升高(P<0.05),而GSK-3β的表达降低(P<0.05);与模型组相比,治疗组Wnt 4和β-catenin表达降低(P<0.05),而GSK-3β的表达升高(P<0.05)。结论透骨消痛胶囊能多靶点调控Wnt/β-catenin信号通路,对软骨细胞具有保护作用,为其治疗骨关节炎提供依据。     

膝骨关节炎脂肪垫对关节软骨细胞的影响

目的:观察人膝骨关节炎(OA)脂肪垫对正常及OA关节软骨细胞的影响。方法:24例人膝脂肪垫和膝关节软骨均由骨科手术室提供,12例为膝关节急性外伤手术患者,12例为膝OA患者行关节置换术后。切取正常及OA膝脂肪垫行苏木精-伊红染色(HE)及瘦素免疫组织化学染色;用OA膝脂肪垫制作脂肪垫培养液(FCM);于急性膝外伤手术标本的表面完整处提取正常软骨细胞,于膝OA关节置换术标本提取OA软骨细胞,分别进行体外培养并鉴定,随机分成正常组、OA组、正常+FCM组及OA+FCM组,其中正常组和OA组均加入完全高糖培养基,正常+FCM组和OA+FCM组均加入FCM,对各组细胞进行形态学观察,于第14天将各组软骨细胞予Ⅱ型胶原(COL2)免疫组化染色及油红O染色,同时应用Western blot技术检测各组软骨细胞中COL2、聚蛋白多糖(Acan)和基质金属蛋白酶(MMP-13)的表达情况。结果:(1)COL2免疫组化染色:OA组软骨细胞内的COL2免疫组化染色平均吸光度比正常组显著降低(P0.05)。与OA组相比,正常+FCM组软骨细胞内的COL2免疫组化染色平均吸光度无明显差异,而OA+FCM组显著降低(P0.05)。与正常+FCM组相比,OA+FCM组软骨细胞内的COL2免疫组化染色平均吸光度显著降低(P0.05)。(2)油红O染色:OA组软骨细胞内的油红O染色平均吸光度与正常组相比差异无统计学意义。与OA组相比,正常+FCM组和OA+FCM组软骨细胞内的油红O染色平均吸光度均有增高(P0.05),但OA+FCM组增高更为显著(P0.05)。(3)Western blot结果:OA组COL2、Acan的表达水平低于正常组(P0.05),而MMP-13的表达高于正常组(P0.05)。与OA组相比,正常+FCM组COL2、Acan和MMP-13的表达水平无明显差异;相较于正常组及正常+FCM组,OA+FCM组COL2、Acan的表达水平降低(P0.05),而MMP-13的表达水平增高(P0.05)。结论:OA膝FCM能使正常及OA软骨细胞形态上发生脂肪样变,并通过代谢途径提高软骨细胞MMP-13的表达,加速软骨细胞COL2、Acan的降解,且对OA软骨细胞的破坏更为显著。     

骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素

目的:近年来国外对骨关节炎的发生及发展机制有许多研究成果,骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的研究颇具新意。资料来源:应用计算机检索Medline1985-01/2004-12与骨关节炎中软骨细胞凋亡相关的文献,检索词“osteoarthritis,chondrocyte,apoptosis”并限定文献语种为English。资料选择:对资料的摘要进行阅读初审,选取包括试验组和对照组的文献,开始查找全文。纳入标准:①随机对照试验。②试验包括对照组。排除标准:①没有设立对照组的文献。②综述类文献、Meta分析、重复研究。资料提炼:共收集到111篇关于骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的试验,纳入符合标准的文献35篇。排除的文献为综述类文献28篇和重复研究48篇。35篇文献多为软骨细胞体外培养有关的试验,分别对各种凋亡影响因素进行评价。资料综合:在骨关节炎患者和老年人的软骨中,由于细胞外基质成分降解或通过高级糖基化、酪氨酸亚硝基化等修饰作用破坏了正常的细胞外基质从而使软骨细胞发生炎症反应并促进其死亡。各种机械性刺激是软骨细胞功能的重要调节因素,施加机械压力的加速率也决定软骨损伤和软骨细胞死亡的类型与程度。经某些细胞因子作用的正常软骨和分离培养的软骨细胞产生高水平的NO,而NO产物又能诱导软骨细胞死亡。肿瘤坏死因子受体超家族成员与相应的死亡配体结合能激活凋亡信号通路,当存在其他前凋亡因子或缺乏某些促存活因子时肿瘤坏死因子α能诱导软骨细胞凋亡。正是由于能量代谢受损使软骨细胞对其他的致死因子变得更加敏感。在发育和骨关节疾病相关过程中,软骨细胞的死亡虽然有p53的参与,但其精确的机制有待阐明,同时没有足够的直接证据表明c-myc能够影响软骨细胞的存活或死亡。结论:骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素很多,机制复杂,许多因素导致软骨细胞凋亡的通路有待进一步阐明。     

骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素

目的：近年来国外对骨关节炎的发生及发展机制有许多研究成果，骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的研究颇具新意。资料来源：应用计算机检索Medline 1985-01／2004—12与骨关节炎中软骨细胞凋亡相关的文献，检索词“osteoarthrltis，chondrocyte，apoptosis”，并限定文献语种为English。资料选择：对资料的摘要进行阅读初审，选取包括试验组和对照组的文献，开始查找全文。纳入标准：①随机对照试验。②试验包括对照组。排除标准：①没有设立对照组的文献。②综述类文献、Meta分析、重复研究。资料提炼：共收集到111篇关于骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的试验，纳入符合标准的文献35篇。排除的文献为综述类文献28篇和重复研究48篇。35篇文献多为软骨细胞体外培养有关的试验，分别对各种凋亡影响因素进行评价。资料综合：在骨关节炎患者和老年人的软骨中，由于细胞外基质成分降解或通过高级糖基化、酪氨酸亚硝基化等修饰作用破坏了正常的细胞外基质从而使软骨细胞发生炎症反应并促进其死亡。各种机械性刺激是软骨细胞功能的重要调节因素，施加机械压力的加速率也决定软骨损伤和软骨细胞死亡的类型与程度。经某些细胞因子作用的正常软骨和分离培养的软骨细胞产生高水平的NO，而NO产物又能诱导软骨细胞死亡。肿瘤坏死因子受体超家族成员与相应的死亡配体结合能激活凋亡信号通路，当存在其他前凋亡因子或缺乏某些促存活因子时肿瘤坏死因子α能诱导软骨细胞凋亡。正是由于能量代谢受损使软骨细胞对其他的致死因子变得更加敏感。在发育和骨关节疾病相关过程中，软骨细胞的死亡虽然有p53的参与，但其精确的机制有待阐明，同时没有足够的直接证据表明c—myc能够影响软骨细胞的存活或死亡。结论：骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素很多，机制复杂，许多因素导致软骨细胞凋亡的通路有待进一步阐明。