低频超声辐照联合小剂量缓激肽选择性开放大鼠血肿瘤屏障及其可能机制

目的研究应用低频超声辐照和小剂量缓激肽颈内动脉灌注非侵袭性、可逆性、靶向最大限度开放血肿瘤屏障的可行性。方法应用伊文氏兰检测血肿瘤屏障通透性,透射电镜观察吞饮小泡数量,Westernblot法检测质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的蛋白表达,RT-PCR法检测caveolin-1和caveolin-2的mRNA表达。结果低频超声辐照联合应用小剂量缓激肽后伊文氏兰检测血肿瘤屏障通透性显著增加(P<0.01),透射电镜示吞饮小泡数量显著增加(P<0.01),RT-PCR法、S-P免疫免疫组织化学法、Westernblot法检测质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的mRNA和蛋白表达表达显著增加(P<0.01)。结论低频超声辐照联合应用小剂量缓激肽通过增加胞吞饮转运显著增加血肿瘤屏障通透性。     

低频超声开放大鼠血脑肿瘤屏障与TNF-α表达之间的关系

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与低频超声开放大鼠血脑肿瘤屏障之间的关系。方法应用1MHz低频超声辐照C6胶质瘤大鼠,采用伊文思蓝(EB)法检测血脑肿瘤屏障通透性的变化,应用透射电镜观察脑微血管内皮细胞紧密连接的变化,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测脑组织中TNF-α含量的变化。结果低频超声辐照后大鼠血脑肿瘤屏障的通透性逐渐增加,在辐照后1.5h￣3h达高峰,12h恢复至正常水平;透射电镜显示低频超声辐照后,0.5h至9h血管内皮细胞的紧密连接均有不同程度的开放,至12h时关闭;低频超声辐照后大鼠胶质瘤侧脑组织中TNF-α含量逐渐增加,在1.5h￣3h达高峰,12h恢复至正常水平。结论低频超声辐照大鼠脑胶质瘤模型后引起TNF-α量的变化与血脑肿瘤屏障通透性变化的趋势及达到峰值的时间相一致。TNF-α的增加可能是低频超声辐照开放大鼠脑胶质瘤血肿瘤屏障的重要因素之一。     

RNA干扰沉默神经轴突导向因子受体4基因增加血肿瘤屏障通透性

目的研究神经轴突导向因子受体(Robo4)对血肿瘤屏障(BTB)通透性的影响。方法建立了体外BTB模型,应用Real-time PCR和Western blot检测Robo4在正常人脑微血管内皮细胞和胶质瘤微血管内皮细胞中的表达变化。设计合成针对Robo4基因的小干扰RNA,转染至人脑微血管内皮h CMEC/D3细胞,下调体外血肿瘤屏障模型内皮细胞中Robo4的表达,跨内皮电阻测量系统和辣根过氧化物酶渗透试验分析血肿瘤屏障通透性变化;Western blot和免疫荧光法检测h CMEC/D3细胞中紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达和分布变化。结果和正常人脑微血管内皮细胞相比,Robo4在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达显著上调。下调体外血肿瘤屏障模型内皮细胞Robo4的表达后,TEER值显著降低,辣根过氧化物酶透过率显著增高;同时胶质瘤微血管内皮细胞中紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达显著降低,在细胞膜上呈不连续分布。结论 RNA干扰沉默Robo4表达能够显著降低紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达,增加BTB通透性。     

siRNA-Tie1下调紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1增加血肿瘤屏障通透性

目的研究Tie1 AS和Tie1表达变化对血肿瘤屏障通透性的影响和相关机制。方法建立体外血脑屏障和血肿瘤屏障模型,Real-time PCR检测h CMEC/D3细胞中Tie1 AS和Tie1的表达水平。转染p IRES2-EGFPTie1 AS表达载体上调体外血肿瘤屏障模型h CMEC/D3细胞中Tie1 AS的表达,Western blot检测Tie1的表达变化。将si RNA-Tie1转染人h CMEC/D3细胞并建立体外血肿瘤屏障模型,跨内皮电阻测量系统分析血肿瘤屏障通透性变化;Western blot和免疫荧光法检测h CMEC/D3细胞中紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表达和分布变化。结果和正常脑微血管内皮细胞相比,体外血肿瘤屏障模型h CMEC/D3细胞中Tie1的表达显著增加,而Tie1 AS的表达显著降低。上调体外血肿瘤屏障模型内皮细胞中Tie1 AS的表达水平,能够显著降低Tie1的表达。下调体外血肿瘤屏障模型内皮细胞中Tie1的表达后屏障通透性显著下降,伴有claudin-5、occludin和ZO-1的表达下调以及在细胞膜上呈不连续分布。结论体外血肿瘤屏障模型内皮细胞中低表达的Tie1 AS能够负性调控Tie1的表达,进而通过调节紧密连接相关蛋白的表达和分布影响屏障的通透性。     

miR-19a对血肿瘤屏障通透性的影响

目的研究miR-19a对血肿瘤屏障通透性的影响。方法将miR-19a模拟物转染至人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3,应用real-timePCR法检测miR-19a的表达。用过表达miR-19a的hCMEC/D3细胞和人U251胶质瘤细胞建立体外血肿瘤屏障模型,跨内皮电阻测量系统检测血肿瘤屏障跨内皮阻抗值的变化;Western blot和免疫荧光法检测体外血肿瘤屏障hCMEC/D3细胞中,紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达。结果经miR-19a模拟物转染后,hCMEC/D3细胞中miR-19a的表达水平显著升高;血肿瘤屏障跨内皮阻抗值显著下降;体外血肿瘤屏障hCMEC/D3细胞中,紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达水平显著降低,在细胞膜上呈不连续分布。结论 miR-19a过表达能显著增加血肿瘤屏障的通透性,其机制之一可能与降低紧密连接相关蛋白相关。     

TRPV4通道激活增加大鼠血肿瘤屏障通透性

目的研究TRPV4通道激活对脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障(blood tumor barrier, BTB)通透性的作用效果及机制。方法制备脑胶质瘤模型,应用伊文氏蓝(EB)渗透评估TRPV4激动剂GSK1016790A作用后血肿瘤屏障通透性的变化;RT-PCR和Westen blot法检测脑胶质瘤组织中质膜微囊结构蛋白caveolin-1mRNA和蛋白表达的变化。结果 GSK1016790A可引起脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性的改变,灌注15min后BTB通透性开始增加,灌注45min时达高峰,而后有所下降,3h基本恢复灌注前水平。在灌注GSK1016790A 15min后,caveolin-1mRNA和蛋白表达水平开始增加,在45min时表达最多,而后有所下降,在3h基本恢复到灌注前水平。结论 TRPV4通道激活选择性开放血肿瘤屏障可能与跨细胞途径标志蛋白caveolin-1表达水平上调相关,本研究可为人脑胶质瘤的化疗提供新思路。     

Y-27632抑制缓激肽选择开放血肿瘤屏障的研究

目的研究Rho associated kinase（ROcK）特异性抑制剂Y-27632是否抑制缓激肽开放血肿瘤屏障。方法应用EVOM测定仪测定跨内皮阻抗值，分析血肿瘤屏障的通透性；应用辣根过氧化物酶渗漏实验分析血肿瘤屏障的通透性；应用免疫荧光方法观察原代大鼠脑微血管内皮细胞丝状肌动蛋白结构和分布的改变。结果BK作用15min时，跨内皮阻抗值最低，辣根过氧化物酶流量最高，血肿瘤屏障通透性最高；此时大鼠脑微血管内皮细胞边界的丝状肌动蛋白分布不连续，应力纤维形成增加。ROCK的特异性抑制剂Y-27632显著抑制了由缓激肽引起的血肿瘤屏障通透性升高和应力纤维的增加。结论Y-27632抑制缓激肽引起的血肿瘤屏障通透性升高，可能与丝状肌动蛋白结构和分布的改变和应力纤维的增加相关。     

ROCK介导缓激肽开放SD大鼠血肿瘤屏障

目的利用ROCK的特异性抑制剂Y-27632,研究ROCK是否介导缓激肽开放血肿瘤屏障。方法应用ROCK的特异性抑制剂Y-27632预处理大鼠原代脑微血管内皮细胞后,用缓激肽诱导血肿瘤屏障开放,测量跨内皮阻抗值(TEER),辣根过氧化物酶(HRP)渗漏量,分析血肿瘤屏障的通透性的改变;应用Western-blot法检测紧密连接相关蛋白ZO-1的表达;应用免疫荧光方法观察原代大鼠脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1和丝状肌动蛋白结构和分布的改变。结果 Y-27632显著抑制缓激肽诱导TEER值的降低,HRP的升高;Y-27632显著抑制ZO-1的表达;Y-27632抑制ZO-1由内皮细胞的边缘向细胞质转移,抑制丝状肌动蛋白由细胞膜边缘向细胞中央区分布,应力纤维形成明显减少。结论 ROCK介导缓激肽开放血肿瘤屏障。     

体外培养人视网膜微血管内皮细胞屏障功能的研究

目的： 研究原代培养的人视网膜微血管内皮细胞屏障功能。方法: 对人视网膜微血管内皮细胞进行原代培养并鉴定,第4代细胞接种于Polyester(PET)膜上,不同时点对滤膜表面行显微镜观察,通过紧密连接相关蛋白occludin的表达,间接反映细胞之间紧密连接的形成,应用共聚焦免疫显微镜观察2、3、4周occludin表达的变化;跨膜电阻（TER）检测屏障的稳定性,并通过测量正常培养条件和5 μg/L的血管内皮生长因子（VEGF）干预下辣根过氧化物酶(HRP)通透性的改变反映屏障特性。结果: 成功培养了人视网膜微血管内皮细胞,纯度可达95.8%。细胞接种1周后融合为单层,接种后2、3、4周细胞密度无明显变化,细胞接触紧密,呈单层生长,可见occludin在细胞相邻边界规则的表达;occludin在2、3、4周,在细胞内的分布逐渐移向相邻细胞交界处;2周时视网膜微血管内皮细胞跨上皮细胞电阻达（120.62±3.97）Ω/cm2,2、3、4周差异无显著（P>0.05）;单层细胞的通透性检测结果显示,HRP从滤膜上方到达下方随时间延长呈线性增加,且在VEGF的干预下,各时点通透率明显增加（P<0.05）。结论: 利用体外培养的人原代视网膜微血管内皮细胞建立单层细胞具有典型的屏障功能特性,可作为体外研究血视网膜内屏障的有用模型。     

过表达miR-34a增加血肿瘤屏障通透性机制的研究

目的探讨过表达miR-34a增加血肿瘤屏障通透性的机制。方法将miR-34a模拟物转染至培养的人脑微血管内皮细胞NKIM-6,采用实时荧光定量PCR方法检测miR-34a的表达。用miR-34a模拟物转染的NKIM-6细胞和U87胶质瘤细胞建立体外血肿瘤屏障模型,跨内皮电阻测量系统检测血肿瘤屏障跨内皮阻抗值的变化;western blot和免疫荧光法检测体外血肿瘤屏障NKIM-6细胞中,紧密连接相关蛋白ZO-1和claudin-5的表达。结果经miR-34a模拟物转染后,NKIM-6细胞中miR-34a的表达水平显著升高;血肿瘤屏障跨内皮阻抗值显著下降;体外血肿瘤屏障NKIM-6细胞中紧密连接相关蛋白ZO-1和claudin-5的表达水平分别显著降低,在细胞膜上呈不连续分布。结论过表达miR-34a显著增加血肿瘤屏障的通透性,其机制之一可能与降低紧密连接相关蛋白相关。