索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株的建立及基因表达分析

目的 建立索拉菲尼诱导的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)耐药细胞株,筛选出耐药细胞株中的高表达基因,进一步探讨肝细胞癌中与索拉菲尼耐药的相关基因.方法: 选取人肝癌细胞株PLC及Huh7,采用药物间歇诱导法分别建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株,运用高通量测序技术(RNA-Seq)测定两株耐药细胞株中高表达基因,运用生物信息学数据库分析高表达基因与肝癌临床生物学指标相关性,筛选出肝癌耐药机制中可能参与的基因.结果: 通过基因测序得到两株肝癌耐药细胞株中的高表达基因,在设定的限定条件下进行进一步筛选, 限定条件为两株耐药细胞中共同表达的基因且表达差异倍数大于4倍,差异具有统计学意义(P<0.05),发现两株耐药细胞共同表达前12位基因符合限定条件,进一步运用Ualcan数据库分析12个基因与肝癌组织表达水平,分期,分级及生存的关系,筛选出符合条件的基因CBX4.结论: 成功构建了索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株,并筛选出与索拉菲尼耐药相关基因CBX4,为进一步耐药机制探讨提供依据.     

lncRNAENST00000484679促进肝癌索拉菲尼耐药细胞迁移侵袭的机制研究

目的探讨差异表达的长链非编码RNA（lncRNA）对肝癌索拉菲尼耐药细胞迁移、侵袭的影响。方法采用ln-cRNA芯片微阵列分析肝癌索拉菲尼耐药细胞Huh7SR和亲本细胞Huh7中的lncRNA,筛选出差异表达lncRNA;荧光定量PCR法进一步验证差异表达的lncRNA。将转染后的肝癌索拉菲尼耐药细胞Huh7SR分为ENST00000484679-小干扰RNA（siRNA）组和阴性对照（siNC）组。ENST00000484679-siRNA组加入lncRNAENST00000484679-siRNA转染,siNC组加入无关序列NC-siRNA转染。Transwell实验观察肝癌索拉菲尼耐药细胞株迁移侵袭能力的变化;Westernblot法检测肝癌索拉菲尼耐药细胞株的上皮-间质转化（EMT）标记蛋白钙黏蛋白N（N-cadherin）、钙黏蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表达水平。结果芯片筛选出lncRNAENST00000484679在肝癌索拉菲尼耐药细胞株中高表达,荧光定量PCR进一步验证了Huh7SR细胞ENST00000484679mRNA表达水平高于Huh7细胞（P＜0.01）。ENST00000484679-siRNA组ENST00000484679mRNA表达水平低于siNC组,迁移细胞数和侵袭细胞数均低于siNC组,N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平均低于siNC组,E-cadherin蛋白表达水平高于siNC组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论lncRNAENST00000484679促进肝癌索拉菲尼耐药细胞的迁移和侵袭能力可能与EMT有关。     

索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,并研究其耐药细胞的生物学特性。方法通过药物敏感性实验CCK8法测定索拉菲尼的半数抑制浓度IC50值;采用体外间歇诱导法,使用PLC/PRF/5和Huh7各自IC50值作为筛选浓度,建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株模型;Real time-PCR检测5种耐药基因(GST-π、LRP、MDR1、MRP、TopoⅡ)在耐药组和对照组中的表达差异;Western blot检测MAPK信号通路中关键信号因子细胞外调节蛋白激酶(extra-cellular regulated protein kinases,ERK)ERK1/2在不同组别细胞中的磷酸化水平差异。结果所筛选的PLC/PRF/5和Huh7耐药组细胞与对照组细胞相比较,其细胞生存率有显著性提高(P<0.05);5种耐药基因中MDR1的表达有显著性上调(P<0.05);索拉菲尼作用靶点的下游信号因子ERK1/2的磷酸化水平上调。结论成功地在体外建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,其耐药机制可能与ERK1/2的磷酸化水平上调导致耐药基因MDR1高表达有关。     

Establishment and biological characteristics of sorafenib-resistant hepatocellular carcinoma cell lines

[目的]建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,并研究其耐药细胞的生物学特性.[方法]通过药物敏感性实验CCK8法测定索拉菲尼的半数抑制浓度IC50值;采用体外间歇诱导法,使用PLC/PRF/5和Huh7各自IC50值作为筛选浓度,建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株模型;Real time-PCR检测5种耐药基因(GST-π、LRP、MDR1、MRP、TopoⅡ)在耐药组和对照组中的表达差异;Western blot检测MAPK信号通路中关键信号因子细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)ERK1/2在不同组别细胞中的磷酸化水平差异.[结果]所筛选的PLC/PRF/5和Huh7耐药组细胞与对照组细胞相比较,其细胞生存率有显著性提高(P＜0.05);5种耐药基因中MDR1的表达有显著性上调(P＜0.05);索拉菲尼作用靶点的下游信号因子ERK1/2的磷酸化水平上调.[结论]成功地在体外建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,其耐药机制可能与ERK1/2的磷酸化水平上调导致耐药基因MDR1高表达有关.     

人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定

目的:构建人葡萄糖调节蛋白 94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型。方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Hyg中,获得重组载体。瞬时转染293T细胞,采用Western blotting 法检测GRP94蛋白表达量。pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株。用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证。结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确。HeLa细胞经慢病毒感染,药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P<0.01)。成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白。结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLVX-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础。     

肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析

目的: 获取肝癌相关基因(hepatoma associated gene,HTA)的mRNA分子全长序列并对其可变剪接进行分析,检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达,为进一步研究该基因在肝癌发生、发展中的作用奠定基础。方法: 用3'RACE 和5'RACE方法扩增HTA基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析,用Northern印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达。结果: HTA基因全长序列为1414 bp,经分析该序列包含3个外显子,2个内含子,其中2号内含子在可变剪接中被作为外显子表达。Northern印迹显示HTA基因1.7 kb转录本和1.4 kb转录本均表达于恶性肝癌细胞系,而不表达于正常细胞系。结论: 成功获得了HTA基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达,作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究。     

碳青霉烯耐药克雷伯菌耐药机制研究

目的:探讨天津医科大学第二医院分离得到的碳青霉烯耐药克雷伯菌的耐药机制。方法:2013-2014年度临床微生物实验室分离到36株碳青霉烯耐药克雷伯菌,改良Hodge试验、EDTA协同试验及 PCR法检测碳青霉烯酶耐药基因,PCR法检测ESBLs及Ampc酶耐药基因,PCR、实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测外膜蛋白基因Ompk35及Ompk36存在及表达情况。结果:9株改良Hodge试验阳性,EDTA协同试验均阴性,碳青霉烯酶耐药基因均阴性;36株碳青霉烯耐药克雷伯菌至少存在1种β内酰胺酶耐药基因;外膜蛋白基因无缺失,33株存在外膜蛋白表达量下降。结论: 分离的碳青霉烯耐药克雷伯菌耐药机制可能为ESBLs及Ampc酶表达合并外膜蛋白表达下降。     

干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因的扩增、克隆及蛋白表达

目的 研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1(interferon-inducible transmembrane protein-1,IFITMP-1)基因的扩增、克隆及蛋白表达。方法 以含IFITMP-1基因的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将目的基因克隆到pUCm-T质粒测序。进一步克隆到pET-Trx蛋白表达载体质粒,优化蛋白表达条件。结果 含有IFITMP-1基因的PCR产物约1000bp。重组pUCm-T质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,有相应大小的cDNA片段插入,测序结果显示其序列正确,证实目的基因的扩增、克隆成功,并成功克隆进pET-Trx蛋白表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)plysS中有融合蛋白表达。结论 成功扩增克隆IFITMP-1基因,并成功表达该基因编码的蛋白,为进一步研究IFITMP-1基因在大肠癌中的作用奠定了基础。     

β位淀粉样前体蛋白裂解酶2基因敲除斑马鱼动物模型的构建及其初步应用

目的 构建β位淀粉样前体蛋白裂解酶2(β-site APP-cleaving enzyme 2,BACE2)基因敲除斑马鱼动物模型并及其初步探索其应用。方法 运用CRISPR/Cas9技术,在斑马鱼中设计针对靶点的gRNA,使之诱导靶点突变,经测序鉴定得到突变体。结果 BACE2纯合突变体在早期部分无法存活,RT-PCR结果显示BACE2基因在斑马鱼的早期发育中持续表达。结论 BACE2基因敲除的斑马鱼动物模型将为进一步研究BACE2基因在斑马鱼胰腺发育中的作用和针对糖尿病的药物靶点筛选提供有效工具。     

ARNT2在胃癌中的表达及临床意义

目的 探讨人胃癌中芳香烃受体核易位蛋白2(ARNT2)的表达及临床意义。 方法 运用qRT-PCR和Western blotting检测ARNT2在正常胃细胞株及多种胃癌细胞株中的表达。通过免疫组织化学检测61例胃癌组织及相应癌旁胃黏膜组织中ARNT2的表达。 结果 ARNT2 mRNA和蛋白在胃癌细胞株中的表达水平显著低于正常胃细胞株。胃癌组织中ARNT2的阳性表达率显著低于癌旁胃黏膜组织(32.79% vs 80.33%,P<0.05),与细胞株的检测结果一致。并且,胃癌中ARNT2的表达水平与肿瘤的分化程度显著相关(P<0.05)。 结论 ARNT2在胃癌细胞及组织中低表达,并且其表达水平与胃癌的分化程度相关,提示其可能参与胃癌的发生与发展。     

长期索拉菲尼暴露促进Huh7肝癌细胞上皮间质变的实验研究

目的探讨索拉菲尼耐药肝癌细胞发生上皮间质变(EMT)及侵袭、转移能力增强的机制。方法通过药物连续诱导人肝癌细胞株Huh7建立索拉菲尼耐药肝癌细胞株Huh7R,显微镜下观察细胞形态学变化;CCK-8细胞增殖试验检测Huh7R细胞增殖能力;荧光定量PCR检测ABC家族耐药基因ABCB1、ABCC1、ABCG2及EMT相关调控锌指蛋白转录因子Snail、Slug基因表达水平;Westernblot检测耐药蛋白ABCG2,EMT标记分子E-cadherin、Vimentin及N-cadherin,转录因子Snail、Slug蛋白表达水平;Transwell小室侵袭试验检测Huh7R细胞迁移、侵袭能力。结果Huh7R细胞呈细长形,伴纤维状突起,形态学上符合EMT改变;CCK-8细胞增殖试验显示在索拉菲尼作用下,Huh7R细胞生存率高于Huh7细胞;荧光定量PCR结果显示,Huh7R细胞ABCB1、ABCC1、ABCG2及Snail、Slug基因表达水平均高于Huh7细胞（均P＜0.05）;Westernblot显示,Huh7R细胞上皮标记蛋白E-cadherin表达水平低于Huh7细胞（P＜0.05）,而间质标记蛋白Vimenti、N-cadherin及Snail、Slug蛋白表达水平均高于Huh7细胞（均P＜0.05）;Transwell小室侵袭试验显示Huh7R细胞迁移、侵袭能力均较Huh7细胞增强。结论长期低剂量索拉菲尼暴露会促进肝癌细胞Snail和Slug表达,诱导肿瘤细胞发生EMT,增强其侵袭、转移能力。     

Robo家族在肝癌细胞系的表达

目的研究不同肝癌细胞系中Robo1,Robo2、Robo3和Robo4的表达差异。方法用RT-PCR检测8个肝癌细胞系的mRNA表达。结果 Robo1和Robo4在这8个肝癌细胞系中均表达;Robo2只在PLC细胞系中微量表达;Robo3在Hep3B、Huh7表达较高,而97L和G2表达较低,其它细胞系均无表达。结论 Robo1、Robo2、Robo3和Robo4在不同的肝癌细胞系中表达水平不同,为研究Robo家族选择合适的细胞模型提供理论依据。     

肝癌索拉非尼敏感性预测模型的构建及临床意义

目的：基于生物信息学方法构建并验证肝细胞癌(以下简称肝癌)对索拉非尼敏感性相关基因的预后风险模型,探究该模型对肝癌患者预后和对索拉非尼敏感性的预测能力。 方法：本研究对GSE109211数据集、TCGA-LIHC队列、ICGC-LIRI队列进行差异基因分析,通过交集筛选出肝癌索拉非尼敏感性相关基因。利用单因素Cox分析和LASSO回归构建预后风险模型并进行验证。通过GDSC数据库分析索拉非尼的IC50值并探索其与风险评分的关系。 结果：筛选出365个与索拉非尼敏感性相关的基因,富集分析显示存在与药物代谢相关的信号通路。单因素Cox回归分析出221个与预后相关的基因,通过LASSO回归构建了一个包含7个关键基因的预后风险模型,与低风险组相比,高风险组具有较短的生存时间。多因素Cox回归分析显示风险评分是独立的预后因素。通过对比高、低风险组患者的索拉非尼IC50值,发现高风险组的索拉非尼IC50值较低,提示高风险组对索拉非尼的治疗可能更敏感。 结论：基于索拉非尼敏感性相关基因构建的预后风险模型对肝癌患者预后具有良好的预测价值,并为评估肝癌患者的索拉非尼敏感性提供理论依据。     

去甲肾上腺素通过PI3K/Akt信号通路上调Sox4表达促进肝癌细胞增殖

目的 探讨去甲肾上腺素对肝癌细胞自我更新能力的影响及其分子机制.方法 实时荧光定量PCR和Western blot检测去甲肾上腺素对肝癌细胞(Huh7、PLC)中CD133表达水平的影响;肿瘤细胞球形成实验以及克隆形成实验检测去甲肾上腺素和哌唑嗪对肝癌细胞自我更新能力的作用;实时荧光定量PCR和Western blot检测去甲肾上腺素(10 μmol/L)和哌唑嗪(5μmol/L)对肝癌细胞中干性相关基因表达的影响,并检测相关的信号通路.结果 去甲肾上腺素使Huh7和PLC肝癌细胞中的CD133表达升高;去甲肾上腺素处理Huh7和PLC肝癌细胞后的成球率较对照组明显上升,哌唑嗪处理后明显降低(P＜0.05);在克隆形成实验中,去甲肾上腺素处理Huh7和PLC肝癌细胞的后,克隆形成率高于哌唑嗪组和对照组(P＜0.05);与对照组和哌唑嗪组相比,去甲肾上腺素组中Sox4基因表达明显升高,同时p-Akt表达相较于哌唑嗪和对照组相比也明显上调(P＜0.05).结论 去甲肾上腺素激动肝癌细胞中α肾上腺素能受体,通过激活PI3 K/Akt信号通路上调肝癌细胞中Sox4基因表达,从而提高肝癌细胞自我更新的能力.     

Anti-miRNA-21增加肝细胞癌Huh 7细胞对吉非替尼的敏感性

为了探讨anti-miRNA-21与肝细胞癌Huh 7细胞对吉非替尼敏感性之间的关系,通过MTT法和流式细胞术检测anti-miRNA-21联合吉非替尼对Huh 7细胞增殖和凋亡的影响。用Western blot检测anti-miRNA-21对同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)表达的影响,以及联合吉非替尼对ERK/Akt信号通路相关蛋白表达的影响。结果显示,anti-miRNA-21联合吉非替尼可显著抑制Huh 7细胞增殖(P<0.05),并促进其凋亡;anti-miRNA-21可以上调Huh 7细胞中PTEN的表达;miRNA-21联合吉非替尼对ERK/Akt信号通路的抑制高于吉非替尼组。结果表明,anti-miRNA-21可以增加肝细胞癌Huh 7细胞对吉非替尼的敏感性。     

鼻咽癌同期放化疗抵抗细胞株与母细胞株lncRNA的差异表达谱分析

  目的  分析鼻咽癌同期放化疗抵抗细胞株与亲本细胞株间差异表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），探索lncRNA在鼻咽癌同期放化疗抵抗中可能发挥的作用。  方法  体外构建鼻咽癌CEN1和CNE2细胞同期放化疗抵抗模型，诱导鼻咽癌细胞同期放化疗抵抗细胞株CEN1CRR和CNE2CRR，应用高通量测序筛选2组细胞株间差异表达的lncRNAs，对差异表达的lncRNAs的靶基因进行GO和KEGG分析。  结果  以Log2FC > 1或 < -1，FDR < 0.05为差异表达标准，和CNE1相比，CNE1CRR差异表达的lncRNAs2746个（358个上调，2063 个下调）；和CNE2相比，CNE2CRR差异表达的lncRNAs3475个（265个上调，520个下调）；此外，387个lncRNAs在CNE1CRR和CNE2CRR中表达同时下调，49个lncRNAs在CNE1CRR和CNE2CRR中同时上调。在GO分析中发现，2组细胞中差异表达lncRNAs的靶基因在生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞成分（cellular component，CC）等方面均有参与。在KEGG分析结果中发现，CNE1组细胞中，差异lncRNAs的靶基因主要富集的信号通路有细胞凋亡、病毒致癌、代谢途径等。CNE2组细胞中，差异lncRNAs的靶基因主要富集的信号通路有代谢途径（硫辛酸、磷酸戊糖、花生四烯酸、醚脂质）、T细胞受体信号通路、核苷酸切除修复等（P < 0.05）。  结论  同期放化疗抵抗细胞株与亲本细胞株的lncRNA表达谱存在明显差异，这些差异表达的lncRNA可能参与了鼻咽癌的同期放化疗抵抗，并为其机制研究奠定基础。     

E26特异性转化变异体4在体外促进肝癌细胞对索拉非尼和顺铂耐药

目的研究E26特异性转化变异体4（ETV4）对肝细胞癌（HCC）顺铂和索拉非尼耐药的影响。方法顺铂耐药HCC细胞株 SMMC-7721（对索拉非尼敏感）和HCC-LM3（对索拉非尼不敏感）经质粒转染诱导ETV4过表达或用siRNA干扰ETV4后，分别 用DMSO、索拉非尼（5 μmol/L）或顺铂（5 μmol/L）刺激48 h并收集总蛋白或总RNA。采用Western blotting、流式细胞术、EdU增 殖检测法检测处理后HCC细胞凋亡水平和增殖能力的变化。利用实时荧光定量PCR（q-PCR）技术检测11例HCC患者肿瘤组 织及配对的癌旁组织中ETV4 mRNA的表达水平。肝癌细胞株经干扰ETV4后，分别用DMSO、索拉非尼或顺铂刺激48 h，利用 q-RCR技术检测早期反应基因3（IER3）的mRNA表达水平。结果肝癌组织中ETV4 mRNA的表达水平显著高于对应的癌旁 组织。在两株肝癌细胞中过表达ETV4能显著减少索拉非尼或顺铂诱导的细胞凋亡，而干扰ETV4能显著增加索拉非尼或顺铂 诱导的细胞凋亡，并显著抑制索拉非尼或顺铂刺激下的细胞增殖能力。此外，在索拉非尼或顺铂的刺激下ETV4能调节IER3的 mRNA表达水平。结论ETV4过表达能促进HCC细胞对索拉非尼或顺铂产生耐药。     

重编程肝癌细胞系Huh7为多潜能干细胞样细胞

[摘要] 目的 重编程肝癌细胞系Huh7细胞为多潜能干细胞。方法 包装携带有Oct4、Sox2、Nanog、Lin28基因的慢病毒,将包装好的病毒共感染Huh7细胞,采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光、实时定量PCR,免疫组织化学等方法对诱导出的多潜能干细胞样克隆细胞进行鉴定。结果 Huh7细胞被重编程为多潜能干细胞样细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性,免疫荧光实验证明其表达多潜能因子,Oct4与TRA-1-60,qPCR实验证明其高水平表达内源性的多潜能相关基因及干细胞特异的microRNAs,体内分化实验结果表明iHuh7可以形成畸胎瘤。结论 通过携带四种多潜能因子的慢病毒介导的重编程, Huh7细胞可以被诱导为多潜能干细胞样细胞。