HPV18-L1基因真核表达载体的构建及其表达

目的:从人乳头瘤病毒(HPV)阳性的宫颈癌组织中克隆HPV18型主要衣壳蛋白L1基因全长,构建真核表达载体及验证目的蛋白的表达。方法:根据HPV18-L1基因全长设计一对特异引物,用PCR方法从宫颈癌组织DNA中获得L1基因,构建pMD18T重组质粒扩增L1基因,以pVAX1为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入地鼠肾细胞BHK,采用免疫细胞化学方法检测HPV18-L1蛋白的表达。结果:从长春地区宫颈癌临床标本克隆到的HPV18-L1基因序列与Genebank报道序列高度同源,其真核表达产物能够与特异性抗体发生特异性结合。结论:成功构建pVAX1-HPV18-L1重组真核表达质粒,为研制地区特异性HPV预防性疫苗提供基础实验参考。     

miR-29c真核表达载体构建及鉴定

目的 构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c真核表达载体,为进一步研究miR-29c的功能和靶基因鉴定奠定基础。方法 根据miR-29c成熟体序列设计合成1对miRNA寡聚单链DNA,经退火后克隆到真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR中,瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经实时荧光定量PCR检测pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c在肺癌细胞中表达miR-29c。结果 A549转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c 24 h后,miR-29c表达量上升,明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 成功构建真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c,并能有效表达miR-29c。     

ATRN基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定针对基因ATRN的特异性siRNA真核表达载体。方法:根据ATRN基因cDNA序列,设计针对目的基因ATRNcDNA序列的3个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论:本研究成功构建针对ATRN的特异性真核表达载体,为进一步研究ATRN基因在雄性生殖系统的功能奠定基础。     

HO-1不同活性真核表达载体的构建及鉴定

目的构建含有HO-1基因的重组载体并将其稳定转染到肝癌细胞系HepG2中。方法采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1（＋）载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞,获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染HepG2细胞系,G418筛选抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞系中HO-1基因的表达。结果成功制作了HO-1活性增高和降低的细胞模型。结论 HO-1不同活性真核表达载体的成功构建,为进一步研究HO-1的功能奠定了基础。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的构建方法研究

目的 提高构建携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的成功率.方法 通过理论研究结合实验操作经验.结果 利用该方法可以高效率的成功构建真核表达载体.结论 文章提出的方法简便、通用、高效,可以解决重组DNA载体构建技术中的一系列关键问题,为相关研究提供了必要的理论和技术支持.     

人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达

目的:体外构建携带人卵泡抑素基因(FS)cDNA的真核表达载体,并观察其在幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21)中的表达。方法:从新鲜人卵泡抽提液细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增人FScDNA序列,克隆到pMD-18T载体中,构成pMD-FS重组克隆质粒。经测序鉴定后,双酶切得到人FS基因cDNA序列,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-FS重组表达质粒。pEGFP-FS重组表达质粒经酶切和PCR鉴定,通过脂质体2000介导瞬时转染BHK21细胞,并检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达。结果:成功构建pMD-FS重组克隆质粒,FScDNA序列测序结果与GenBank中公布的序列(Genbank NM_013409.1)同源性为100%;成功构建pEGFP-FS重组表达质粒,将其转染BHK21细胞后,观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了人FS的pMD-FS重组克隆质粒和pEGFP-FS重组表达质粒,为进一步研究FS对哺乳动物卵泡发育的影响奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA。方法采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒。双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞。采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达。结果成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白。结论成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。     

miR-145真核表达载体的构建及表达

目的构建miR-145的真核表达载体,为研究miR-145在结肠癌中的生物学功能奠定基础。方法设计并应用PCR扩增miR-145基因片段,将其导入真核表达载体pCMV-myc中构建重组质粒pCMV-miR-145后,将重组质粒转染入结肠癌细胞系HCT116中,运用RT-PCR检测miR-145的表达情况。结果酶切及DNA测序证实miR-145被正确克隆入真核表达载体pCMV-myc中,该重组质粒能在HCT-116细胞中高效表达miR-145。结论成功构建了miR-145的真核表达载体pCMV-miR-145,该载体能有效高表达miR-145。     

人防御素-5基因原核表达载体pRSET-A的构建

目的利用分子生物学技术和方法将pRSET—A质粒改建为带有人α-防御素5（HD-5α）基因的新型表达载体pRSET—HD-5α。为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础。方法PCR技术，以设计的引物P1／P2从cDNA文库中扩增人α-防御素5基因片段，并将扩增出来的目的基因和pRSET—A质粒用BamHI和EcoRI双酶切后连接构成重组质粒，然后转化大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆。最后对PCR及酶切鉴定含有目的基因的克隆进行测序和电泳。结果获得α-防御素-5基因片断大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；电泳结果证明已将此片段克隆到pRSET—A内。结论成功构建了HD-5α基因的新型表达载体pR—SET—A／HD-5α。     

EB病毒重组抗原Rta蛋白的表达及用于鼻咽癌筛查ELISA方法的建立

目的 制备和表达EB病毒重组抗原Rta蛋白,并建立筛查鼻咽癌的ELISA方法,为鼻咽癌的早期筛查提供科学依据。方法 设计引物扩增BRLF1编码区全长序列,构建重组质粒p PICZαA-BRLF1,电转入毕赤酵母GS115,筛选His+Mut+表型转化子并用甲醇进行诱导表达和纯化;建立Ig G/Rta抗体的ELISA检测技术,用于300例鼻咽癌患者和200例健康对照者血清的筛查,对检测结果进行评价。结果 成功构建p PICZαA-BRLF1重组质粒;目的蛋白在毕赤酵母GS115中高效分泌表达(50%),蛋白电泳显示在66.0 k Da处有相应条带;同时Western-blot也证明其有良好的免疫活性;利用该重组Rta蛋白建立的ELISA检测方法对鼻咽癌检测阳性率显著高于Ig A/VCA试剂盒(P0.01)。结论 本研究构建了EB病毒重组抗原Rta蛋白的真核表达载体,表达外源蛋白产量高,免疫活性好,可用于Ig G/Rta ELISA检测技术研究,适合于鼻咽癌的大规模筛查和早期诊断。     

HBVX基因真核细胞载体的构建

目的 为了探讨HBVX基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系，构建含X基因的真核表达质粒。方法 用PCR方法扩增含EcoRI和HindⅢ酶切位点的X基因序列，对Puc118载体及X基因PCR产物双酶切，用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌JM109，称PUC118-HBx，再将PUC118-I-IBx与PCDNA3．1( )双酶切，将两者连接并转化大肠杆菌DH5α，称PCDNA3．1( )-HBx，并对其进行序列测定。结果 已构建PCDNA3．1( )-HBx载体，经序列测定含有完整的X基因片段。结论 PCDNA3．1( )-HBx表达载体可为了解X基因与X蛋白对慢性乙型肝炎及肝癌发生的作用，为X基因与X蛋白的生物学功能研究提供可靠基因材料。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

A型流感病毒NP基因的克隆表达与鉴定

目的 构建人A型流感病毒NP基因原核重组表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法 从流感患者咽分泌物中提取总RNA,设计特异性引物,经RT-PCR得到NP基因开放阅读框cDNA后定向克隆到原核表达载体pET28b(+),构建含目的 基因的pET28b(+)-NP重组质粒,经酶切、PCR和测序正确后转化E.coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 ①成功构建了pET28b(+)-NP重组质粒;②在E.coli BL21(DE3)中表达了一分子量约55 kDa的融合蛋白,经Western blot鉴定正确.结论 重组质粒pET 28b(+)-NP构建成功并在E.coli BL21(DE3)中高效表达了人A型流感病毒NP蛋白,为后续该蛋白的功能研究奠定了基础.     

人α-防御素-1基因与J链基因的融合及其表达载体的构建

目的本研究旨在将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因进行融合使其成为融合基因J-HNP-1。方法从pCH-J质粒中扩增出J链;从pBabeNeo-HNP-1质粒中扩增出HNP-1;然后以它们的自身产物为模板,进行重组PCR,获取J-HNP-1 DNA片段,并插入编码双重报告基因Myc和6个多聚组氨酸(His)的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中,构建出C端带Myc和6×His的rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1。结果经过重组得到的融合基因J-HNP-1的目的片段为786 bp,与预测相符。结论杀菌分子J-HNP-1的重组和哺乳动物细胞表达载体的构建,为进一步进行抗菌肽的研究及制备奠定了基础。     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

二氧化氯与戊二醛对乙型肝炎表面抗原破坏效果的分析

目的 对二氧化氯（ClO2破坏乙型肝炎表面抗原（HBsAg)抗原性的效果与戊二醛进行比较研究。方法 采用酶联免疫吸附实验（ELISA）进行检测。结果 ClO2消毒效果较戊二醛好，浓度40mg/L时可将HBsAg抗原性破坏，戊二醛浓度则需为200mg/L;pH值对ClO2和戊二醛的消毒效果有影响。在酸性环境中（pH值6.0时）。ClO2的破坏效果最佳。碱性戊二醛则在碱性环境中（pH值为8.0时）效果最强；20%小牛血清即对ClO2的消毒效果有明显影响，而50%以上的小牛血清才对戊二醛有影响。结论。ClO2是一种快速、高效的消毒剂。     

HBsAg重组腺病毒载体的构建及在树突状细胞的表达

目的构建能高效转导HBsAg基因的重组腺病毒Ad-S,证实其能在小鼠树突状细胞内表达,以用于基因治疗的实验研究。方法应用AdEasyTMXL腺病毒载体系统,首先将HBV S基因克隆到p-shuttle-CMV形成重组穿梭载体,用PmeⅠ酶切使之线性化,电转化到BJ5183-AD-1细胞中形成重组腺病毒Ad-S质粒,后者以PacⅠ酶切线性化,转染到AD293细胞包装为重组腺病毒Ad-S。Ad-GFP或Ad-S以MOI为100转染经GM-CSF、IL-4和TNF-α等细胞因子诱导培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞,用流式细胞仪分析细胞荧光表达,Western blot、RIA和ELISA法检测HBsAg的表达。结果PCR、序列测定和酶切鉴定证明HBsAg重组腺病毒Ad-S构建正确,扩增到的病毒颗粒滴度为108/ml;流式细胞仪分析细胞荧光表达率为(92.93±2.35)%,荧光强度达236.67±45.72;Western blot、RIA和ELISA法均检测到Ad-S转染的树突状细胞能表达HBsAg。结论HBsAg重组腺病毒Ad-S构建正确并能高效转染树突状细胞和表达HBsAg,为进一步研究腺病毒介导HBsAg基因修饰的DC疫苗的免疫治疗作用奠定了基础。