巨噬细胞缺氧复氧模型的制作方法及其生物学意义

目的：建立一种简单可行的巨噬细胞缺氧复氧（H/R）模型。方法：采用制备缺氧液与氮气饱和相结合的方法制造细胞缺氧环境。巨噬细胞系RAW264.7分为对照组、缺氧（30、60和120min）复氧（15或30min）组及H/R＋不同剂量的依达拉奉（EDA）组,借助于倒置荧光显微镜及流式细胞仪观测巨噬细胞内活性氧（ROS）浓度的变化,作为评判H/R模型成功与否的标准。结果：与各自对照组比,缺氧60min复氧15 min组即可引起ROS浓度明显升高（P〈0.05）,随着H/R时间延长,ROS生成呈进行性增加趋势。ROS清除剂EDA能剂量-依赖地抑制H/R所致ROS的大量生成。结论：应用制备缺氧液与氮气饱和相结合的方法可成功建立巨噬细胞H/R模型,该模型适于不同脏器缺血再灌注损伤共同分子机制的探讨及寻找共同治疗策略的相关研究。     

VS-1基因转染对血管内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的构建Ad-VS-1基因转染HUVEC的体外缺氧/复氧模型,探讨VS-1转基因治疗对血管内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制。方法①建立HUVEC缺氧/复氧（H/R）损伤模型,分为4组：空白组,H/R组,空载腺病毒转染＋H/R组,Ad-VS-1转染＋H/R组;②测定内皮细胞活力（MTT）,超氧化物歧化酶活力（SOD）、丙二醛（MDA）、eNOS、NO表达、炎症因子ICAM-1、VCAM-1、TNF-α的表达情况;③在Ad-VS-1转染＋H/R组基础上增设Hb、KT5823、SB203580和W ortm an in 4个信号抑制组,流式细胞仪测定细胞凋亡率进行统计学分析。结果①成功构建Ad-VS-1转染HUVEC表达后H/R模型;②与空白组比较,H/R组和空腺病毒感染＋H/R组的MTT、SOD含量、eNOS、NO表达显著降低,而MDA、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α含量显著增加（P〈0.05）;与H/R组和空载腺病毒感染＋H/R组比较,VS-1转染＋H/R组MTT、SOD、eNOS、NO表达含量明显回升,而MDA、ICAM-1,TNF-α生成量明显回落（P〈0.05）;③与H/R组和空载腺病毒感染＋H/R组比较,VS-1转染组细胞凋亡率明显降低,而4组信号抑制剂组的细胞凋亡率较VS-1转染组均明显回升（P〈0.05）。结论Ad-VS-1成功转染HUVEC,并通过PI3K/Akt-eNOS-NO-cGMP-PKG和P38MPAK等信号途径,抑制氧化应激和炎症反应,产生显著的抗血管内皮细胞缺氧/复氧损伤作用,为今后VS-1抗心肌缺血/再灌注损伤研究奠定基础。     

比索洛尔预处理对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤的影响

目的研究比索洛尔预处理对缺氧/复氧诱导的大鼠心肌细胞损伤的保护作用,并探讨该作用的机制。方法对大鼠心肌细 胞株（H9c2）进行缺氧复氧（6 h/2 h）,模拟大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,将H9c2细胞随机分成4组：正常对照组（control组）、缺 氧/复氧组（H/R组）、缺氧/复氧+比索洛尔预处理组（H/R+B组）、缺氧/复氧+比索洛尔预处理+PI3K/AKT阻滞剂LY294002组（H/ R+B+LY组）;分别采用MTT法检测心肌细胞活力,流式细胞仪法检测心肌细胞凋亡、ROS水平,Western免疫印迹法检测心肌 细胞p-AKT及p-GSK3β蛋白表达情况。结果与正常组相比,H/R组细胞活力下降,细胞凋亡率增加、ROS水平升高;经比索洛 尔预处理后,细胞活力明显提高,细胞凋亡率下降、活性氧水平降低,p-AKT/GAPDH、p-GSK3β/GAPDGH显著提高,而加入 PI3K/AKT阻滞剂LY294002后比索洛尔的保护作用消失。结论比索洛尔能减少缺氧/复氧所引起的氧化应激,对心肌细胞具 有明显的保护作用,其作用机制是通过激活PI3K/AKT/GSK3β通路而提高AKT、GSK3β磷酸化水平,减少ROS产生,增加细胞 的活性实现的。     

成纤维细胞生长因子21对缺氧复氧心肌细胞的保护作用及机制研究

【摘要】 目的 探讨成纤维细胞生长因子21（FGF21）对缺氧复氧（H/R）心肌细胞的保护作用及对PI3K/AKT通路的影响。方法 重组腺病毒载体Ad FGF21诱导原代心肌细胞过表达FGF21。腺病毒转染心肌细胞后构建H/R损伤模型（3h缺氧联合3h复氧）。实验分为对照组（Con组）、H/R组、H/R+Ad GFP组、H/R+Ad FGF21组4组。心肌细胞存活率评估细胞损伤程度;SOD/MDA检测联合DHE荧光染色评估氧化应激反应（ROS）;流式细胞术评估细胞凋亡;Western blot检测相关蛋白水平。在机制探讨实验中给予PI3K/AKT抑制剂（LY294002）进行干预。结果 与Con组相比,H/R损伤后FGF21蛋白表达显著下调,并伴随心肌细胞活性降低、ROS与凋亡反应激活。腺病毒介导的心肌细胞过表达FGF21能够明显抑制H/R损伤,表现为细胞活力、ROS与凋亡反应均有不同程度改善。FGF21心肌细胞过表达能够增加PI3K/AKT磷酸化水平,而抑制PI3K/AKT通路后FGF21过表达介导的细胞保护功能被逆转。结论 FGF21主要通过PI3K/AKT依赖性途径改善心肌细胞H/R损伤。     

6-姜酚预处理对乏氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用

  目的  探讨6-姜酚（6-G）预处理是否能够减轻乏氧/复氧（H/R）诱导的H9C2细胞损伤及相关机制。  方法  采用常规方法制备心肌细胞H/R体外模型〔H9C2细胞加入经氮气饱和后的乏氧液后放于培养箱,通入混合气体（体积分数1%O₂,5%CO₂,94%N₂）作用15 min,培养3 h后取出细胞,置于常氧培养箱（37 ℃,体积分数5%CO₂）进行复氧培养1 h〕。在建立心肌细胞H/R体外模型前给予6-G预处理,采用MTT法测定细胞活力,并筛选6-G干预下细胞活力最大的6-G质量浓度进行后续实验。采用DCFH-DA荧光探针检测6-G预处理对H9C2氧化应激水平的影响,荧光显微镜以及流式细胞仪观察细胞内氧化应激的作用。Western blot法检测H/R诱导细胞炎症反应因子中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）表达的变化。  结果  与H/R组相比,6-G+H/R组细胞活力从 50 μg/mL 6-G 组开始上升,200 μg/mL 6-G时细胞活力最大,后续实验选6-G干预质量浓度为200 μg/mL。与对照组相比,200 μg/mL 6-G组活性氧（ROS）含量无明显变化（P>0.05）,ROS荧光波峰未见明显迁移,H/R组ROS的含量升高,差异有统计学意义（P<0.05）,ROS荧光波峰向右侧迁移,与H/R组相比,6-G+H/R组ROS含量降低,差异有统计学意义（P<0.05）,ROS荧光波峰向左侧回移。与对照组相比,6-G组TNF-α、IL-6、IL-1β的表达无明显变化（P>0.05）;H/R组TNF-α、IL-6、IL-1β的表达升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与H/R组相比,6-G+H/R组TNF-α、IL-6、IL-1β的表达降低,差异有统计学意义（P<0.05）。  结论  6-G预处理能够减轻H/R诱导的H9C2心肌细胞损伤,其机制可能与抑制氧化应激和炎症反应有关。     

sRAGE对缺氧/复氧心肌细胞氧化应激的影响

目的观察可溶性晚期糖基化终产物(soluble form of receptor for advanced glycation end products,sRAGE)对缺氧/复氧心肌细胞氧化应激的影响。方法乳鼠心肌细胞原代培养48 h,以低氧3 h、复氧2 h复制缺氧/复氧损伤模型,采用抽签法将乳鼠心肌细胞随机分为4组:常氧对照组(Control,Con)、常氧+sRAGE组(Con-sRAGE)、缺氧/复氧组(Hypoxia/reoxygenation,H/R))、缺氧/复氧+sRAGE组(H/R-sRAGE)。采用四甲基偶氮唑蓝〔3(4,5-dimethyl-thiazol)-2,5-diphenyl-tetrazolium,MTT〕比色法检测心肌细胞活力和培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)浓度,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力,硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针联合流式细胞仪检测细胞荧光强度-反应活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,硝酸还原酶法测定一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。结果与H/R组相比,H/R-sRAGE组可以提高心肌细胞活力,减少LDH漏出量,增加SOD活力,降低MDA、ROS、NO含量(P<0.05)。结论 sRAGE可以直接作用于心肌细胞拮抗缺氧/复氧损伤,其保护性作用与抑制氧化应激有关。     

三七总皂苷对缺氧再给氧血管内皮细胞损伤保护效果研究

目的探讨发生缺氧再给氧损伤（H/R）对人脐静脉内皮细胞株（ECV304）的功能影响并探讨三七总皂苷抗血管内皮细胞H/R损伤的作用效果和作用机制。方法体外培养的ECV304,将之分为7个研究组,分别为代号A-G的对照组、H/R组、PDTC组、维拉帕米组、不同浓度（0.781mg/L,1.563mg/L,3.125mg/L）的三七总皂苷组;培养1h后通过观察细胞内Ca2＋浓度,一氧化氮（NO）和前列环素（PGI2）的含量,超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量,细胞间黏附分子ICAM-1的表达、核因子kB（NF-kB）的活性等,来确定H/R对ECV304的离子转运功能、细胞分泌功能、氧自由基清除功能、黏附功能及细胞活力的影响,并通过三七总皂苷组与PDTC组、维拉帕米组进行比较,观察三七总皂苷抗血管内皮细胞H/R损伤的作用效果和作用机制。结果 H/R可激活ECV304,使细胞氧自由基清除功能明显降低,NF-κB及ICAM-1的表达明显升高,细胞肌浆网Ca2＋-ATP酶活性、一氧化氮（NO）及前列环素（PGI2）含量、细胞活力明显降低,[Ca2＋]i明显升高;tPNS能有效改善细胞氧自由基清除功能,降低NF-kB、ICAM-1活性,改善肌浆网Ca2＋-ATP酶活性,减轻细胞内钙超载,减轻H/R损伤,且高浓度tPNS效果优于维拉帕米、PDTC。结论三七总皂苷能有效降低NF-κB活性及ICAM-1表达,减轻细胞内钙超载,减轻血管内皮细胞缺氧再给氧损伤;高浓度三七总皂苷与钙拮抗剂维拉帕米、抗氧化剂吡咯烷二硫氨基甲酸脂相比作用较强,效果更好。     

miR-6216对缺氧/复氧H9C2心肌细胞损伤的影响

目的 探讨miR-6216对缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞损伤的影响。方法 体外培养大鼠胚胎心肌细胞H9C2,构建H/R（2 h/4 h）模型。实时荧光定量PCR（qRT PCR）检测miR 6216的表达水平;细胞计数试剂盒（CCK 8）检测细胞存活;平板形成实验检测细胞克隆形成能力;试剂盒检测细胞内丙二醛（MDA）含量和细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印记（Western blot）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、P21、B细胞淋巴瘤/白血病 2（Bcl 2）、Bcl 2相关X蛋白（Bax）的表达水平。将miR 6216抑制物（anti miR 6216）、miR 6216模拟物（miR 6216 mimics）分别转染H9C2,将缺氧/复氧处理后,采用上述方法检测以上指标变化。结果 缺氧/复氧诱导后H9C2细胞miR 6216的表达水平显著升高,细胞存活率和克隆能力显著降低,MDA含量和LDH活性显著升高,Cyclin D1和Bcl 2的表达显著降低,P21和Bax的表达水平显著升高,细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。抑制miR 6216可显著提高H9C2细胞存活率和克隆形成能力,降低MDA含量和LDH活性,促进Cyclin D1和Bcl 2的表达,抑制P21和Bax的表达,抑制缺氧复氧诱导的细胞凋亡（P ＜0.05）。过表达miR 6216可显著抑制细胞存活和克隆形成能力,升高MDA含量和LDH活性,抑制Cyclin D1和Bcl 2的表达,促进P21和Bax的表达,加剧缺氧复氧诱导的细胞凋亡（P ＜0.05）。结论 miR-6216在缺氧/复氧诱导的心肌细胞中表达上调,抑制miR 6216表达可减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤。     

还原型谷胱甘肽对缺氧/复氧培养大鼠心肌细胞的干预性研究

目的：探讨还原型谷胱甘肽（GSH）对缺氧/复氧培养大鼠心肌细胞损伤的保护作用。方法：将原代培养的乳鼠心室肌细胞分为正常对照与GSH不同浓度处理组,缺氧、复氧前均给予0、40、80、160mg/L浓度的GSH,缺氧2 h,复氧1 h。应用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性,用硫代巴比妥酚显色法测定丙二醛（MDA）含量。结果：与对照组相比,单纯缺氧/复氧（0 mg/L）组SOD活性显著下降、MDA水平显著升高（P＜0.01）。GSH预处理以剂量依赖性减轻细胞活力下降及MDA的上升,而对SOD的作用则在160 mg/L组达到峰值。结论：GSH对缺氧/复氧损伤的心肌细胞具有保护作用,其机制可能与GSH的抗氧化作用有关。     

JNK信号传导通路在星形胶质细胞缺氧/复氧后损伤的作用

目的 建立SD大鼠星形胶质细胞（astrocyte,AC）缺氧/复氧损伤模型,探讨JNK信号转导通路与星形胶质细胞损伤的关系.方法 体外培养新生SD大鼠星形胶质细胞,传至第3代,细胞自然纯化,实验设正常对照组（N）、SP600125组（SP组,10 μmol /L）、缺氧/复氧组（H/R组）和缺氧/复氧＋SP600125组（H/R＋SP组）.分别利用MTT法、AnnexinV/碘化丙啶（propidium iodide,PI）双染法、WB法检测缺氧8 h,复氧4、6、12、24 h时细胞存活率、凋亡率、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）的变化.结果 ①缺氧/复氧后细胞活力出现明显下降,SP600125阻断JNK通路后细胞活力高于H/R组;②缺氧/复氧后细胞凋亡率增加,SP600125阻断JNK通路后能够减轻细胞凋亡.③各组AC的JNK水平无显著变化,缺氧/复氧干预后p-JNK表达上调,用SP600125阻断JNK通路后,H/R＋SP组较H/R组p-JNK水平降低.结论 JNK信号通路参与了星形胶质细胞缺氧/复氧损伤过程.     

碘化N-正丁基氟哌啶醇对缺氧复氧内皮细胞早期生长反应基因-1表达的影响

目的:观察碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)对缺氧复氧(H/R)条件下大鼠心脏微血管内皮细胞(RCMECs)早期生长反应基因-1(Egr-1)表达的影响。方法:体外培养RCMECs,建立其H/R模型。细胞随机分为对照组,H/R组,溶剂(PEG)组和F2组。在细胞缺氧3 h复氧2h后收集细胞及上清液,免疫细胞化学法检测细胞中Egr-1蛋白的表达水平,显微镜下观察细胞形态学改变并计算存活率。结果:H/R及PEG组内皮细胞在H/R刺激下Egr-1蛋白表达明显升高,细胞形态发生改变,存活率降低。F2组的内皮细胞在H/R刺激下Egr-1的异常表达受抑制,细胞形态结构无明显改变,细胞存活率提高。结论:F2对体外培养的RCMECsH/R损伤具有保护作用,这可能与其抑制Egr-1蛋白过表达有关。     

大鼠心肌细胞H9C2活性氧水平检测方法探究

目的比较3 种细胞内活性氧（ROS）的检测方法,分析优缺点,筛选1 种合适、准确的检测大鼠心肌细胞H9C2 缺氧/复氧（H/R）模型中细胞内活性氧的方法。方法培养H9C2 细胞,选择密度合适（80%～90%）的H9C2 细胞进行铺板,加入2,7- 双乙酸二氯荧光素（DCFH-DA）荧光探针孵育,应用荧光显微镜、流式细胞仪及荧光酶标仪3 种方法检测对照组（正常含氧量培养条件,CON）和实验组（缺氧复氧处理,H/R6h）心肌细胞的荧光强度,从而反映大鼠心肌细胞内活性氧水平,并利用数据分析软件进行统计分析。结果流式细胞仪检测分析结果：对照组（152 690±34 104）FU/μg,实验组（325 669±12 755）FU/μg;荧光酶标仪检测分析结果：对照组（282.3±12.57）FU/μg,实验组（1 274±37.05）FU/μg。实验组的ROS 水平与对照组的ROS 水平比较,差异有统计学意义（P <0.05）,实验组高于对照组,而荧光显微镜观察法无法定量地分析出实验结果。结论3 种ROS检测方法中,荧光酶标仪检测方法能更好地判断大鼠心肌细胞H9C2 活性氧水平。     

缺氧-复氧对培养的大鼠心肌细胞损伤与细胞凋亡的影响

目的:探讨体外培养的大鼠心肌细胞在缺氧(缺血)和缺氧-复氧(再灌注)状态下心肌细胞损伤和细胞凋亡情况。方法:常规方式培养SD大鼠心肌细胞。给予模拟缺血(缺氧)溶液、模拟复氧(再灌注)液以及终浓度为200U/mL的超氧化无歧化酶(SOD)干预处理,制备缺氧-复氧损伤组(H/R组)、SOD+缺氧-复氧损伤组(SOD+H/R组)和缺氧预处理组(HP组)模型,未经处理的为正常对照组(control组)。结果:屹H/R组的细胞存活率较对照组明显降低(P<0.01);H/R+SOD组和HP组的细胞存活率虽然较正常对照组明显降低(P<0.05),但比H/R组为高(P<0.05);亿H/R组培养液中培养液中心肌酶活性显著高于HP组和H/R+SOD组(P<0.01)。役H/R组心肌细胞内的脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量也明显增高,与HP组和H/R+SOD组的心肌细胞内MDA含量比较有显著性差异(P<0.05);而HP组、H/R组与对照组间比较,无明显差异(P>0.05);均提示了缺氧-复氧过程中心肌细胞损伤严重,也说明了缺氧(血)预处理或SOD均有细胞保护作用。臆H/R组心肌细胞内游离钙含量增加,显著高于HP组和H/R+SOD组(P<0.01);逸流式细胞仪测定出H/R组心肌细胞凋亡率也明显高于HP组和H/R+SOD组(P<0.01)。心肌细胞凋亡的数量与细胞内钙的增加呈正相关(P<0.01)。肄电镜下所见H/R组的许多细胞表现为胞浆减少,核深染、固缩状态,异染色质不均匀,部分线粒体呈空泡变性,或是肌浆网囊泡变等凋亡期或凋亡前期样改变,少数呈凋亡向坏死方面改变;而其他组则少见此些变化。结论:体外培养的心肌细胞在缺氧-复氧情况下同样可加重心肌细胞损伤,可能是通过降低细胞内钙离子浓度而起作用的。     

雌马酚对PC12细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制

目的探讨雌马酚对PC12细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制。方法以PC12细胞为研究对象,构建体外神经元缺氧/ 复氧损伤模型,用雌马酚进行干预。MTT法检测细胞活力,比色法测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性和丙二醛（MDA）含量,免疫细胞化学法检测活性氧（ROS）含量,Western blotting 检测缺氧/复氧损伤的PC12 细胞内NADPH氧化酶2 （gp91phox）和磷酸化Src（p-Src）激酶的表达。结果雌马酚可有效减轻缺氧/复氧引起的PC12细胞损伤,降低缺氧/复氧损伤细胞培养上清液中LDH的活性和MDA的含量,明显抑制ROS的生成及gp91phox和p-Src的表达。结论雌马酚通过抑制p-Src激酶和gp91phox表达,减少ROS生成,从而对PC12细胞缺氧/复氧损伤产生保护作用。     

七氟烷预处理对缺氧/复氧损伤的心肌细胞H9c2 LC3蛋白表达的影响

目的观察七氟烷预处理对缺氧/复氧（H/R）损伤的H9c2大鼠心肌细胞自噬相关蛋白LC3表达的影响,探讨自噬在七氟烷预处理延迟性保护中的作用。方法 H9c2心肌细胞随机分为5组：空白对照组（CON）;缺氧/复氧组H/R（缺氧2 h,复氧1 h）;七氟烷预处理组（SEVO）予2.5%七氟烷预处理1 h,24 h后进行H/R;3-MA＋SEVO组,七氟烷预处理前15 min在培养液内加入3-MA（10 mmol/L）,24 h后进行H/R;3-MA组,即在培养液内加入3-MA（10 mmol/L）,25 h后进行H/R。取复氧后心肌细胞,MTT法检测各组H9c2心肌细胞存活率,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达。结果与CON组相比H/R组和SEVO组细胞存活率均降低（均P〈0.05）;与H/R组相比SEVO组、3-MA组和3-MA＋SEVO组细胞存活率均增高（均P〈0.05）。Western blot结果显示,与CON组相比SEVO组、H/R组自噬蛋白LC3-Ⅱ表达均上调（均P〈0.05）,与H/R组相比SEVO组LC3-Ⅱ蛋白表达均下调（均P〈0.05）,而3-MA组和3-MA＋SEVO组表达均显著下调（均P〈0.01）。结论七氟烷预处理对H/R损伤H9c2心肌细胞具有延迟性保护作用,自噬可能参与了七氟烷预处理的延迟性保护机制。     

AMPK介导线粒体融合与裂变在抑制P2X7受体抗神经元缺氧/复氧损伤中的作用

目的探讨AMPK介导下线粒体融合与裂变在抑制P2X7受体抗神经元缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤中的作用。方法培养原代神经元细胞,并随机分为正常对照（Control）组、缺氧/复氧（H/R）组、H/R+Bright Blue G（BBG）组、H/R+BBG+Dorsomorphin组。采用Calcein-AM/PI双染法检测细胞存活率;采用活性氧（ROS）试剂盒检测ROS的产生;采用Mito Tracker TM Green FM检测线粒体形态;采用Western blotting法检测p-AMPK、p-Drp1、Mfn2蛋白的表达。结果与Control组相比,当神经元细胞发生H/R损伤时,其细胞死亡率、线粒体裂变、ROS的含量都明显增加,BBG预处理后,H/R损伤神经元细胞的死亡率、线粒体裂变、ROS的含量都明显减少,而AMPK抑制剂Dorsomorphin则减弱了BBG对H/R损伤神经元细胞的保护作用（P < 0.01）。Western blotting结果显示,与Control组相比,H/R组神经元细胞p-AMPK与Mfn2的表达显著降低,而p-Drp1的表达显著增高（P < 0.01）;BBG预处理后,H/R损伤神经元细胞p-AMPK与Mfn2的表达显著增高,而p-Drp1的表达则显著降低（P < 0.01）;AMPK抑制剂Dorsomorphin则减弱了BBG增加H/R损伤神经元p-AMPK与Mfn2的表达而降低p-Drp1的表达的作用（P < 0.01）。结论抑制P2X7受体可通过抑制线粒体裂变促进线粒体融合减轻神经元缺氧/复氧损伤,其机制可能与激活AMPK有关。     

二氢杨梅素对H202诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤的影响

目的：研究二氢杨梅素（DMY）对过氧化氢（H02）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响并探讨其作用机制。方法：用不同浓度DMY（5μg·mL^-1,20μg·mL^-1,80μg·mL^-1）预处理保护HUVECs 12h,再用0．5mmol·L^-1H202干预12h,用MTT法检测细胞活力;用Hoechst33258进行细胞核染色;并取上清液检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量;用流式细胞仪分别测活性氧（ROS）和细胞内钙离子含量。结果：DMY能明显提高H202（0．5mmol·L^-1）损伤后HUVECs存活率（P〈0．05）,增加上清液SOD活性,降低MDA含量,减少细胞内ROS表达,下调细胞内钙离子浓度,其中DMY5ug-mL。时效果最明显。结论：DMY对H202诱导内皮细胞损伤具有保护作用,其机制与清除细胞内ROS,抑制细胞内钙离子介导的细胞凋亡相关,浓度以DMY5μg·mL^-1时效果最明显。     

建立新生大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型

目的：探讨缺氧密闭法建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型的可行性与稳定性。方法：将体外培养的新生SD大鼠心肌细胞随机分为对照组（不做处理）和实验组（进行不同时间（30min、1-4h）的缺氧／复氧处理）。DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）浓度;AO／EB双染法及AnexinV／PI流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：对照组ROS浓度及细胞凋亡率均较低;而实验组随着缺氧时间的延长,ROS浓度逐渐增加,细胞凋亡数逐渐增多。不同缺氧时间段细胞凋亡率与对照组比,除缺氧30min组外,1-4h组差异均有统计学意义（P〈0．05,P〈0．01）。结论：厌氧产气袋．缺氧密闭系统建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型稳定、可行且重复性好。     

PPARγ激动剂罗格列酮对缺氧/复氧大鼠心肌细胞氧化应激和凋亡的影响

目的 观察不同浓度PPARγ激动剂罗格列酮对缺氧/复氧大鼠心肌细胞氧化应激影响及细胞活力和凋亡情况.方法 建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型.培养大鼠心肌细胞分为5组:Ⅰ组(正常组)、Ⅱ组(20μmo/L ROS组)、Ⅲ组(I/R组)、Ⅳ组(FR+20μmol/LROS组)、Ⅴ组(I/R+80μmol/LROS组),Ⅳ组和Ⅴ组在缺氧/复氧前12 h经ROS处理.分别在光镜和透射电镜下观察缺氧/复氧后各组心肌细胞形态改变,采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物岐化酶(SOD)活力,采用2,4-二硝基苯肼法测定乳酸脱氢酶(LDH)含量,采用MTT法比较各组心肌细胞活力和采用流式细胞术测定各组心肌细胞凋亡率.结果 与Ⅰ组相比,Ⅲ组的MDA和LDH含量及细胞凋亡率明显升高(P<0.05),SOD含量和细胞活力降低(P<0.05);Ⅳ组和Ⅴ组MDA和LDH含量及细胞凋亡率较Ⅲ组降低(P<0.05)而SOD含量和细胞活力增加(P<0.05).Ⅴ组MDA和LDH含量及细胞凋亡率较Ⅳ组降低(P<0.05)而SOD含量和细胞活力增加(P<0.05).电镜下观察到Ⅲ组(I/R组)心肌细胞形态出现明显凋亡损伤改变,凋亡小体形成,而Ⅴ组改变轻微.结论 罗格列酮可以显著减轻心肌细胞缺氧/复氧导致的氧化应激损伤,改善细胞活力和减轻心肌细胞凋亡率,并存在量效关系.     

eNOS谷胱甘肽化在缺氧预适应保护人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤中的作用及机制

目的：研究缺氧预适应（hypoxic preconditioning,HPC）保护人脐静脉内皮细胞（human umbilical veinous endothelial cells,HUVECs）缺氧/复氧损伤的可能机制。方法：将培养的HUVECs分为5组：对照（Control）组、缺氧复氧（hypoxia/reoxygena－tion,HR）组、HPC组、HR+自由基清除组（HR+EUK134组）、HPC组+自由基处理组（HPC+H2O2组）。先将Control组和HR组、HR+EUK134组放在常规孵育箱中,而HPC组和HPC+ H2O2组放入三气低氧箱中进行3个10 min的缺氧/复氧小循环,即缺氧预适应,再将HR组、HR+EUK134组与HPC组、HPC+H2O2组一起放入三气低氧箱中进行1 h大缺氧。1 h后,向HPC+H2O2组加入H2O2（100 mmol/L）、HR+EUK134组加入EUK134（10 mmol/L）,然后将4组同时放入常规孵育箱复氧2 h。复氧后检测细胞存活率,测定细胞内还原型谷胱甘肽（reductive glutathione,GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidative glutathione,GSSG）内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthetase,eNOS）谷胱甘肽化水平、超氧化物阴离子（superoxide anion,O2.）和一氧化氮（nitric oxide,NO）水平以及抗氧化酶过氧化氢酶（catalase,CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的活性。结果：与对照组相比,HR组O2.增加（P=0.004）,抗氧化酶活性降低（P=0.000）,细胞内氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽比例（GSSG/GSH）和eNOS谷胱甘肽化水平（P=0.000）均增加,而NO生成减少（P=0.003）。自由基清除剂EUK134和HPC（P=0.028）均可减少O2.生成,增加SOD（P=0.002）和CAT活性（P=0.003）,降低GSSG/GSH和eNOS谷胱甘肽化水平（P=0.001）,NO生成增加（P=0.042）,高浓度H2O2可消除HPC的作用。结论：HPC可提高细胞存活率,恢复内皮细胞eNOS功能活性,其机制可能是通过减轻氧化应激,降低细胞内GSSG/GSH和eNOS谷胱甘肽化水平,促进NO生成而实现。