脂质体介导的VEGF-C反义寡核苷酸对肺癌微淋巴管生成的影响

目的 观察脂质体介导的血管内皮生长因子C (VEGF-C) 反义寡核苷酸对肺癌裸鼠皮下种植瘤模型微淋巴管生成的影响.方法 建立BALB/C小鼠皮下肺癌模型30只,随机分为磷酸盐缓冲液对照组 (PBS组)、正义寡核苷酸对照组 (SODN组) 和反义寡核苷酸干预组 (AODN组).接种人肺腺癌细胞株A549后24 h内,分别用PBS、SODN及AODN皮下注射进行治疗,观察小鼠肿瘤的生长情况.4 w后,处死动物,留取瘤体标本,采用RT-PCR、Western印迹和免疫组织化学方法检测VEGF-C反义寡核苷酸对种植瘤中VEGF-C表达水平和微淋巴管生成的影响.结果 AODN组VEGF-C mRNA和蛋白表达量降低 (4.61±1.57),与对照组比较差异显著(P<0.05);种植瘤内微淋巴管密度为 (3.2±1.7),明显低于对照组(P<0.01).结论 脂质体介导的VEGF-C反义寡核苷酸可以显著降低肺癌裸鼠皮下种植瘤模型VEGF-C的表达水平,并对其微淋巴管生成具有较强抑制作用.     

血管内皮生长因子C反义脱氧寡核苷酸对肺癌细胞的作用

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCC)中血管内皮生长因子C(VEGF-C)信使核糖核酸(mRNA)的表达及其反义脱氧寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide,ASODN)对人肺癌细胞的作用.方法 应用原位杂交技术检测48例新鲜肺癌标本中VEGF-C mRNA的表达,将脂质体介导的VEGF-C ASODN转染人肺癌细胞株A-549,用Western印迹法检测肺癌细胞VEGF-C蛋白的表达.结果 VEGF-C mRNA在肺鳞癌和腺癌细胞中的表达阳性率分别为65.4%(17/26)和59.1%(13/22),经VEGF-C ASODN转染的细胞株A-549中,VEGF-C蛋白表达水平明显下降(P＜0.01).结论 VEGF-C mRNA在NSCC中有一定程度的表达,体外实验VEGF-C ASODN通过下调VEGF-C蛋白的表达抑制肺癌细胞的侵袭作用.     

腺病毒介导的CIAPIN1基因对肺癌细胞生长和细胞周期的影响

目的 以重组腺病毒载体介导细胞因子诱导的凋亡抑制分子1(cytokine induced apoptosis inhibitor 1,CIAPIN1)基因转染人肺腺癌细胞系A549,观察并鉴定该基因在腺癌细胞中的表达及其对细胞生长和细胞周期的影响.方法 构建腺病毒载体介导CIAPIN1基因(Ad-CIAPIN1),转染到低水平表达CIAPIN1的人肺腺癌细胞系A549,采用Western blot检测目的蛋白的表达;台盼蓝染色计数活细胞数,绘制细胞生长曲线;流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化.结果 外源性CIAPIN1基因在A549肺癌细胞获得高水平的表达;CIAPIN1能显著抑制A549的生长(P＜0.01);流式细胞仪检测显示肺癌细胞发生凋亡,并出现明显的G1/S期阻滞现象.结论 以腺病毒为载体介导CIAPIN1基因在A549细胞内表达,可发挥抑制细胞生长、诱发细胞凋亡及参与细胞周期调控的作用.提示Ad-CIAPIN1基因可能在人肺癌基因治疗中发挥重要作用.     

VEGF反义寡核苷酸对体外生长的大肠癌HT-29细胞的抑制作用

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)对体外生长的人大肠癌HT-29细胞的抑制作用.方法:实验设空白对照组、脂质体转染组、错义链转染组(SODN组)和不同浓度反义链转染组(ASODN组).用LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN和错义寡核苷酸(SODN)转染人大肠癌细胞株HT-29,半定量RT-PCR检测各组细胞VEGF mRNA的表达:Western blot测定转染48、72 h后VEGF蛋白表达:MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡.结果:转染48 h后,ASOND组的VEGF mRNA表达水平明显低于脂质体对照组和SODN组(0.455±0.032 vs 0.934±0.031,0.915±0.004,p<0.01);脂质体对照组与SODN组之间无显著差异.细胞转染48、72 h后,ASODN组蛋白表达明显弱于脂质体对照组和SODN组,且72h弱于48 h.与对照组比较.VEGF ASODN对HT-29细胞有明显的生长抑制作用,并且抑制呈剂量和时间依赖性(P<0.05).结论:VEGF ASODN通过抑制VEGF的基因表达,对体外生长的人大肠癌HT-29细胞的增殖进行抑制.     

血管内皮生长因子C反义脱氧寡核苷酸对肺癌A-549细胞株侵袭力的影响

目的研究血管内皮生长因子C(VEGF-C)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide,ASODN)对人肺癌细胞株A-549体外侵袭力的影响。方法应用脂质体介导的VEGF-C正义、反义寡核苷酸转染人肺癌细胞株A-549细胞,并设对照组,检测癌细胞的侵袭力变化。结果经VEGF-CASODN转染的A-549细胞株黏附能力显著降低(P0.01),对重组基底膜体外侵袭能力明显减弱(P0.01)。结论 VEGF-CASODN能够明显抑制肺癌细胞株A-549体外侵袭力。     

靶向瘦素基因的siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的 通过构建慢病毒介导的靶向瘦素基因的小干扰RNA(siRNA),探讨瘦素对A549细胞增殖和凋亡的影响.方法 建立siRNA-a组、siRNA-b组及其各自阴性对照组和空白对照组(A549)5组细胞,分别于荧光显微镜下观察细胞5d和11d的生长情况.噻唑蓝(MTT)比色法测定空白对照组、siRNA-a组及其阴性对照组细胞1～6 d的生长情况,绘制生长曲线,比较各组细胞增殖差异.流式细胞仪分析各组细胞凋亡率,观察瘦素的siRNA对A549细胞凋亡的影响.RT-PCR和Western bloting方法检测各组细胞瘦素mRNA和蛋白表达水平.结果 siRNA-a细胞镜下形态基本正常,5d后荧光效率仍较高,感染稳定,但生长较阴性对照组及空白对照组细胞缓慢.siRNA-b细胞感染48 h后,镜下见细胞肿胀、变形,空泡出现,5d后见多量细胞碎片,凋亡小体形成,呈现凋亡状态,11d后可见细胞碎片,已近完全凋亡.MTT实验siRNA-a组细胞从第3天起生长比其他各组均缓慢(P＜0.01).流式细胞仪检测细胞凋亡率结果:siRNA-a组、siRNA-b组细胞凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组.RT-PCR和Western bloting结果 显示干扰组细胞瘦素mRNA和蛋白表达水平较阴性对照组和空白对照组明显下调.结论 慢病毒介导的siRNA能下调肺腺癌A549细胞瘦素基因的表达,从而抑制A549细胞增殖,促进其凋亡.由此可见,瘦素的siRNA有望成为肺腺癌基因治疗的新手段.     

survivin—siRNA对肺癌细胞A549增殖抑制的影响

目的探讨survivin—siRNA对肺癌细胞A549的增殖抑制作用。方法将针对survivin的siRNA表达载体与脂质体和pSi—scrambled两个对照组一起分别转染肺癌细胞A549后，利用半定量RT—PCR和Western印迹法分别检测细胞survivin mRNA及蛋白表达水平，MTT法测定细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果转染72h后，实验组细胞的survivin mRNA水平是脂质体对照组的31.1％，蛋白表达水平是脂质体对照组的29．2％。MTT检测实验组细胞的生长速度是脂质体对照组的36．6％，流式细胞术发现实验组G1期细胞比例明显高于两个对照组，而G2期和S期细胞比例减少，细胞出现凋亡。结论利用survivin—siRNA可明显抑制肺癌细胞A549的增殖，细胞受阻于G1期，诱导细胞凋亡。     

红景天联合顺铂协同诱导人肺腺癌耐药细胞的凋亡

目的观察红景天联合顺铂对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的生长抑制和凋亡诱导作用。方法应用MTT法检测红景天、顺铂对A549/DDP细胞的生长抑制并计算IC50,采用Annexin V-FITC试剂盒、流式细胞仪定量检测凋亡率;采用Western印迹法检测各组细胞Caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶(PARP)表达水平。结果 A549/DDP对顺铂具有一定耐药性;在红景天、顺铂分别作用24 h后,A549/DDP细胞凋亡率为(11.49+1.73)%、(19.87+3.65)%;显著低于联合用药组(34.88+5.62)%(P<0.05)。联合用药组Caspase-3、PARP活化程度高于红景天组、顺铂组。结论联合红景天与顺铂具有协同作用,抑制肺腺癌耐药细胞生长,促进肺腺癌耐药细胞凋亡,提示红景天在化疗耐药的肺癌治疗中有一定的应用前景。     

相关基因在苦参碱诱导人肺腺癌细胞凋亡中的表达

目的 探讨苦参碱对肺腺癌细胞凋亡和Bcl-2、Bax蛋白表达的影响.方法 肺腺癌A549细胞进行传代培养后,分别加入30、60、120、240 mg/L的苦参碱,MTT法检测其对A549细胞生长的抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 不同浓度的苦参碱对肺腺癌细胞生长均有抑制作用,抑制率与浓度呈正相关.苦参碱可诱导A549细胞凋亡,与作用时间呈正相关.苦参碱能显著降低Bcl-2蛋白表达(P＜0.01),而显著升高Bax蛋白表达水平.结论 Bcl-2基因表达降低、Bax基因表达增高可能在苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡中起重要作用.     

沉默miR-345联合5-FU对胃癌MGC803细胞增殖能力及凋亡的影响

目的 观察沉默miR-345联合5-FU对胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的影响。方法 采用脂质体介导转染miR-345反义寡核苷酸至胃癌细胞MGC803以沉默miR-345表达。应用40μg/ml 5-FU单独处理胃癌细胞MGC803或联合miR-345沉默组,克隆形成实验观察细胞的增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果 脂质体介导转染miR-345反义寡核苷酸至胃癌细胞MGC803可以抑制miR-345的表达;细胞克隆形成实验显示,反义miR-345+5-FU联合组与单独5-FU处理组相比,克隆形成率[(4.29±0.83)%vs(7.68±0.34)%]显著降低(P0.01);流式细胞凋亡检测表明,反义miR-345+5-FU联合组细胞凋亡率显著高于反义miR-345组、5-FU组(P0.01)。结论 沉默miR-345联合5-FU能抑制5-FU对MGC803细胞增殖能力,并促进其凋亡。     

外源性p16基因对人肺癌细胞生物学特性的影响

目的：研究外原性p16基因对肺癌细胞生物学特性的影响。方法：利用脂质体介导的基因转染方法将外源性p16基因转入p16基因缺陷的人肺腺癌细胞株A549中,用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）及免疫组化的方法检测p16基因的表达,同时观察转染后细胞恶性生长的变化。结果：外源性p16基因在A549细胞中能稳定表达,转染后A549细胞生长速度明显减慢,在软琼脂上形成克隆的能力降低。流式细胞仪检测显示A549细胞G1期阻滞并发生了凋亡,接种裸鼠后致瘤性降低,肿瘤生长明显减慢。结论：外源性p16基因导入人肺癌细胞株A549中可稳定表达并抑制细胞的恶性生长,同时诱导调亡。     

WWOX基因转染抑瘤效应的实验研究

目的建立肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体，观察其瞬时转染对肿瘤细胞凋亡的影响。方法采用RT-PCR方法，从正常人胚肾细胞HEK-293中钓取WWOX基因，将其克隆至pMD18-T载体上，测序正确后克隆到真核表达载体pcDNA4／myc-His中；采用脂质体介导法体外瞬时转染人肺腺癌A549细胞；RT—PCR法和Western印迹法分别检测WWOX基因mRNA和蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率；克隆形成试验观察肿瘤细胞克隆形成能力的变化。结果成功构建了WWOX的真核表达载体，体外转染的A549细胞凋亡率明显高于未转染和空载体转染细胞，且细胞克隆形成能力下降，形成率为35．43％，明显低于未转染细胞和空载体转染细胞。结论所构建的pcDNA4／myc-WWOX真核表达载体转染肿瘤细胞能够抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。     

自噬相关基因Beclin 1沉默对人肺癌A549细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨应用RNAi技术沉默Beclin 1基因对人肺癌A549细胞顺铂(DDP)耐药性的影响。方法应用真核细胞转染技术将Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重组质粒转入人肺癌DDP耐药A549/DDP细胞,通过RT-PCR和Western印迹检测Beclin-1基因表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞对DDP的耐药性及细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与空白对照组及空质粒对照组相比,重组质粒组Beclin 1mRNA及蛋白表达下降,凋亡率增加,对DDP的敏感性增加(均P<0.05)。结论 Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1转染人肺癌A549细胞后,可有效抑制Beclin-1基因的表达,增加人肺癌A549细胞对DDP的敏感性,促进细胞凋亡。     

反义c-myc寡核苷酸对转染FHIT基因胃癌细胞MKN28的影响

目的: 探讨脂质体介导的c-myc反义寡核苷酸对导入脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的胃癌细胞增殖及凋亡的影响.方法: 通过脂质体将重组FHIT基因PRC/CMV质粒和空载体转染到人类胃癌细胞系MKN28,并分别转染c-myc反义寡核苷酸,RT-PCR和Westen b1ot法检测FHIT基因的转染,Westem b1ot法检测细胞c-mHyc的表达,MTT法分析细胞增殖,AO/EB染色法和流式细胞分析技术检测细胞凋亡.结果: 转染FHIT基因后,MKN28细胞检测到FHIT基因片段和FHIT蛋白,而未转染的细胞及转染空载体的细胞未检测到FHIT基因片段及FHIT蛋白.转染c-myc反义寡核苷酸后.对MKN28细胞c.myc的表达有明显的抑制作用,并呈明显的时间依赖性;c-myc asODN对FHIT MKN28细胞抑制率(F=177.480,P<0.05),凋亡率(F=41.500,P<0.05)和凋亡比例明显高于FHIT MKN28细胞.结论: 癌基因c-myc的表达抑制联合FHIT基因的表达可以发挥较强的抗肿瘤细胞作用,为多基因治疗肿瘤提供了理论基础.     

Livin基因沉默对大肠癌细胞凋亡和化疗敏感性的影响

目的 观察沉默Livin基因对大肠癌HT-29细胞凋亡和化疗敏感性的影响.方法 采用脂质体转染技术将化学合成的Livin siRNA转入HT-29细胞,RT-PCR和Western印迹法检测转染效果.选用5-氟尿嘧啶(5-FU)作用于转染和未转染的细胞,MTT检测各组细胞的增殖、流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 si-Livin1转染组Livinα mRNA、Livinβ mRNA和Livin蛋白表达水平较其余干扰组和对照组显著降低(P<0.01).5-FU对HT-29细胞的生长抑制作用强于si-Livin1转染组(P<0.01),而si-Livin1+5-FU组对细胞的生长抑制率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01).与空白对照组比较,si-Livin1转染可使细胞出现明显凋亡现象(P<0.01),5-FU对细胞的促凋亡作用强于si-Livin1转染组(P<0.01),si-Livin1+5-FU组的凋亡率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01).结论 siRNA沉默Livin基因能够抑制HT-29细胞的生长,促其凋亡,提高5-FU的化疗敏感性.Livin基因有望成为大肠癌治疗的新靶点.     

PBCA纳米粒介导的hTERT反义寡核苷酸对肺癌A549细胞周期和凋亡的影响

目的以聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒（PBCA-NPs）作为端粒酶逆转录酶（hTERT）反义寡核苷酸（ASODN）载体，转染肺癌A549细胞，观察其对该细胞周期和凋亡的影响。方法PBCA-NPs携带hTERT ASODN转染A549细胞后，绘制细胞生长曲线表达细胞生长状态的变化；流式细胞仪（FCM）检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果ASODN转染后A549细胞增殖减慢FCM检测结果显示．ASODN转染后细胞周期变化明显，细胞被阻滞于G0／G1期，细胞凋亡率明显增加。结论hTERTA SODN能有效改变A549细胞的细胞周期，诱导细胞凋亡的发生。     

靶向HER2基因的siRNA联合卡铂对肺腺癌A549细胞的抑制作用

目的 探讨靶向HER2基因的siRNA联合卡铂对肺腺癌A549细胞的抑制作用.方法 设计并合成3对靶向HER2基因的siRNA(2621组、1724组、1491组),分别转染肺腺癌A549细胞,同时设阴性对照组及空白组.应用实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测细胞内HER2 mRNA及其蛋白的表达.应用流式细胞术检测卡铂与HER2 siRNA联合应用时肺癌A549细胞的凋亡率.结果 2621组和1724组HER2 mRNA及蛋白表达均低于1491组和阴性对照组.流式细胞术检查显示,各组间细胞凋亡率比较P＜0.01,HER2 siRNA+卡铂组细胞的凋亡率均高于对应浓度的卡铂组.结论 siRNA能抑制HER2基因在肺癌A549细胞中的表达,并与卡铂协同诱导癌细胞凋亡.     

外源性干预VEGF-C表达对肺癌细胞生物学行为的影响及机制

目的 探讨外源性血管内皮生长因子-C(VEGF-C)对肺癌细胞生物学行为的影响及机制。方法 将A549细胞分为BK组、VC组及SC组,BK组不转染,VC组及SC组均于EP管中加入200μL转染液和4μL脂质体,VC组及SC组分别加入5μg NC mimics、5μg miR-21 mimics。转染72 h后,采用免疫印迹法检测A549细胞中TCAB1蛋白表达;MTT法检测A549细胞生存率;Transwell小室检测A549细胞侵袭情况;流式细胞仪检测A549细胞凋亡率。结果 SC组A549细胞中VEGF-C mRNA表达低于BK组、VC组（P均<0.05）,转染成功。BK组、VC组中VEGF-C mRNA表达相似（P>0.05）。干预12、24、48、72 h时,BK组与VC组A549细胞生存率比较差异无统计学意义（P均>0.05）;SC组A549细胞生存率低于BK组、VC组,组间比较差异有统计学意义（P均<0.05）。BK组与VC组A549细胞侵袭细胞数目比较差异无统计学意义（P>0.05）,SC组A549细胞侵袭细胞数目低于BK组、VC组,三组比较...     

Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其诱导细胞凋亡的作用及其机制。方法 用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝系统变化,激酶活性检测方法测定细胞内caspase-3活性变化,免疫沉淀法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)活性的变化。结果 脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后Ⅰ～Ⅵ组(空白对照、正义对照、400、600、800、1000ng/ml反义转染组)细胞内p38MAPK活性分别为7.03、7.07、13.47、16.37、43.97及47.87;caspase-3活性分别为0.015±0.010、0.014±0.002、0.026±0.003、0.042±0.001、0.093±0.001及0.100±0.001;Ⅳ～Ⅵ组细胞内p38MAPK及caspase-3活性较对照组明显升高。转染后细胞发生G_2/M期阻滞,Ⅰ～Ⅵ组细胞凋亡率分别为0.70％、0.76％、2.43％、7.82％、23.11％及31.35％,各实验组细胞凋亡较对照组明显增加。细胞内微丝形态结构破坏,Ⅰ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度分别为189.69±6.68、184.23±8.76、173.14±8.15、99.48±6.57、76.69±10.05及63.80±6.79,Ⅳ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度较对照组明显降低。结论 脂质体介导转染survivi     

氯通道ClC-3反义寡核苷酸对过氧化氢诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的研究ClC3反义寡核苷酸对H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法蛋白免疫印迹法检测ClC3蛋白表达;形态学方法、DNA琼脂糖电泳、MTT法和流式细胞仪观察和分析H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变、DNA断裂、细胞存活率和凋亡率及ClC3反义寡核苷酸转染对其影响。结果ClC3反义寡核苷酸转染抑制内源性ClC3蛋白表达后,可加重H2O2诱导大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变及DNA断裂,细胞凋亡率由52.8%±13.6%增至75.7%±5.8%(n=6,P<0.01),而细胞存活率由48.9%±4.3%进一步降低为31.3%±4.3%(n=6,P<0.01)。结论ClC3反义寡核苷酸转染促进H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡。