60Co照射对肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞的增殖及TNF-α分泌的影响

目的用60钴(60Co)照射肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞(BEL-7404-TNF细胞),用于制备一种肿瘤疫苗.方法用不同方式及不同剂量的60Co照射BEL-740-TNF细胞及未转基因的BEL-7404细胞,观察照射后细胞增殖情况及肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌量.结果经80Gy60Co连续分量照射的BEL-740-TNF细胞增殖能力丧失,但仍然生存并能持续分泌TNF-α2周以上,细胞在3周内全部死亡.结论用60Co照射BEL-7404-TNF细胞制备肿瘤疫苗是可行的, 80Gy60Co连续分量照射可能是合适剂量.     

^60Co照射对肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞增殖的影响

用肿瘤疫苗增强机体抗肿瘤免疫反应是预防和治疗肿瘤的重要途径之一。我们采用不同照射方式及不同剂量的~(60)Co照射人TNF-α基因转导的人肝癌细胞(BEL-7404-TNF),观察其增殖及TNF的分泌量,以便选择合适的细胞作为肝癌疫苗进行动物实验。     

CD4 + CD25 + 调节性T细胞与肿瘤免疫治疗

 CD4＋CD25＋调节性T淋巴细胞（regulatory Tcell，Treg）是一类具有独特免疫调节功能的T淋巴细胞亚群，一般占人外周血CD4＋T细胞的5％～15％。近年来，国内外对这类调节性T细胞的研究已从自身免疫耐受、移植免疫逐渐扩展到肿瘤免疫，认为Treg是形成肿瘤免疫耐受的关键成分。     

α-肿瘤坏死因子基因修饰人肝癌细胞经60Co辐射后细胞因子的持续分泌

α-肿瘤坏死因子(α-TNF)具有促肿瘤细胞自溶和增加肿瘤细胞的HLA抗原表达的作用,故将含信号肽的人α-TNFcDNA构建入可表达载体质粒pLXSN,体外包装成缺陷型逆转录病毒后感染人肝癌细胞株(HHCL),经筛选后得到HHCL-TNF细胞株。经不同强度的~(60)Co辐射后,测其24小时的TNF分泌量。观察~(60)Co辐射强度与TNF分泌量的关系及辐射后细胞存活期的差异。将上述辐射后细胞放入液氮冻存,复苏观察TNF分泌量的变化。经研究发现:(1)HHCL-TNF经过~(60)Co辐射后仍能持续分泌约四周,40～100G辐射强度间无显著差异;(2)HHCL-TNF细胞~(60)Co辐射后液氮冻存一段时间,复苏后仍能持续分泌TNF约三周。这些结果为进一步研究应用‘肿瘤疫苗’提供了一定的依据。     

188 Re 标记DTPA-DG对肺癌A549 细胞增殖的影响

 目的 研究不同浓度¹⁸⁸ Re-DTPA-DG（^188Re标记二乙三胺五乙酸-葡糖胺）对人肺癌细胞A549增殖的影响，探讨其作用机制。方法 将人肺癌细胞A549分成3组，实验组（¹⁸⁸ Re-DTPA-DG组）、对照组（¹⁸⁸ Reoi淋洗液、缓冲液及等量的DTPA—DG）及生理盐水组（含生理盐水及等量缓冲液），前两组均设三种不同浓度，148、296、444MBq／L。观察细胞形态，采用四氮唑盐比色法（MTT法）评价¹⁸⁸Re-DTPA-DG对癌细胞A549增殖的影响。结果¹⁸⁸Re-DTPA-DG导致的细胞损伤比^188Re04-明显；随着药物浓度增加^{188 Re-DTPA-DG}导致的损伤越显著。结论¹⁸⁸ Re-DTPA-DG对肿瘤细胞增殖有较明显的抑制效应，其机制可能是由于¹⁸⁸ Re-DTPA-DG进入到细胞内，其辐射效应更能导致肺癌细胞损伤。     

60Co分割照射对鼻咽癌细胞生长增殖影响的观察

目的:观察不同剂量射线分割照射对鼻咽癌细胞株CNE-2细胞生长和细胞周期素(Cyclin)D1及增殖细胞核抗原(PC-NA)的影响.方法:0、2.0、4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射CNE-2细胞1次/d,共5 d.四唑盐(MTT)比色法测定细胞抑制率;流式细胞术检测细胞周期.PCR检测PCNA和CyclinD1表达水平.结果:2.0、4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射5次/5 d后各组细胞生长抑制率分别为-17.05%、4.01%和1 5.52%;各照射组G1期细胞数量减少,S+G2/M期细胞数比例增多,X2=16.53,P<0.001.0、2.0、4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射CNE-2细胞5次/5 d,Cyclin D1表达水平随照射分割剂量增加而下降直至不表达,P值分别为0.035、0.022和0.000.2.0 Gy照射CNE-2细胞5次/5 d,细胞生长增殖未受到抑制,PCNA表达无下调,P=0.471;4.0和6.0 Gy照射CN E-2细胞5次/5 d,细胞生长增殖受到抑制,PCNA表达下调,P值分别为0.028和0.016.结论:4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射5次/5 d,细胞生长增殖受到抑制;2.0 Gy照射5次/5 d细胞生长增殖未受抑制;2.0、4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射5次/5 d后,Cyclin D1和PCNA表达受抑制.     

蛋白酶体抑制剂PS-341 诱导U266 细胞凋亡与胞浆内[Ca 2+]变化的关系

 目的 探讨蛋白酶体抑制剂PS-341（Bortezomib）诱导骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡时对其胞浆内[Ca²⁺]（[Ca²⁺]i）的影响。方法 以浓度梯度的PS-341干预U266细胞4h后收集,荧光显微镜观察细胞凋亡,Annexin V-FITC／PI双参数流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡,Fluo-3／AM荧光素标记FCM检测[Ca²⁺]i。结果 （1）PS-341作用U266细胞4h后荧光显微镜观察到凋亡细胞数随浓度增加而增多;（2）FCM检测凋亡细胞的比例分别为0．56％、7．71％、19．84％、31．10％、40．72％,与PS-341浓度成正比;（3）PS-341作用后U266细胞[Ca²⁺]i均值分别为403．65nmol／L、418．20nmol／L、378．65nmol／L、356．36nmol／L、349．21nmol／L;（4）PS-341诱导U266细胞凋亡时伴随[Ca²⁺]i的改变,浓度〉50nmol／L时诱导的细胞凋亡伴随[Ca²⁺]i下降。结论 蛋白酶体抑制荆PS-341诱导骨髓瘤细胞凋亡呈浓度依赖性;PS-341浓度〉50nmol／L时下调[Ca²⁺]i,并由此发挥抗骨髓瘤细胞作用。     

不同照射剂量对脐血贴壁层细胞功能的影响

目的了解不同剂量照射后,脐血贴壁层细胞的吞噬功能及肿瘤坏死因子(TNF)表达水平的变化.方法不同剂量60Co照射脐血贴壁层细胞,采用酶联法测定其吞噬功能及肿瘤坏死因子(TNF)表达.结果脐血贴壁层细胞在接受7.5 Gy 60Co照射后其吞噬功能最强,而肿瘤坏死因子(TNF)表达水平则在接受2.5 Gy～5.0 Gy 60Co照射时达高峰.结论脐血贴壁层细胞对照射抵抗力较强,可促进放疗患者机能恢复.     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的：建立稳定的基因工程细胞系。方法：将含有人肿瘤坏死因子α（hTNFα）全长cDNA插入表达载体pSNAV2．0，产生重组质粒pSNAV2．0-TNFα，利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中，G418筛选阳性克隆hTNF／293，采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果：通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明：在质粒pSNAV2．0中插入片段正确。采用RT—PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达，分子量为17KDa。结论：成功构建重组质粒pSNAV2．0-TNFα，真核表达载体构建正确，转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白，并能分泌到细胞外。     

^60Co分割照射对鼻咽癌细胞生长增殖影响的观察

目的：观察不同剂量60Coγ射线分割照射对鼻咽癌细胞株CNE-2细胞生长和细胞周期素（Cyclin）D1及增殖细胞核抗原（PC-NA）的影响。方法：0、2.0、4.0、6.0Gy60Coγ射线分割照射CNE-2细胞1次/d,共5d。四唑盐（MTT）比色法测定细胞抑制率;流式细胞术检测细胞周期。PCR检测PCNA和Cyclin D1表达水平。结果：2.0、4.0、6.0Gy60Coγ射线分割照射5次/5d后各组细胞生长抑制率分别为-17.05%、4.01%和15.52%;各照射组G1期细胞数量减少,S＋G2/M期细胞数比例增多,χ2=16.53,P〈0.001。0、2.0、4.0、6.0Gy60Coγ射线分割照射CNE-2细胞5次/5d,CyclinD1表达水平随照射分割剂量增加而下降直至不表达,P值分别为0.035、0.022和0.000。2.0Gy照射CNE-2细胞5次/5d,细胞生长增殖未受到抑制,PCNA表达无下调,P=0.471;4.0和6.0Gy照射CNE-2细胞5次/5d,细胞生长增殖受到抑制,PCNA表达下调,P值分别为0.028和0.016。结论：4.0、6.0Gy60Coγ射线分割照射5次/5d,细胞生长增殖受到抑制;2.0Gy照射5次/5d细胞生长增殖未受抑制;2.0、4.0、6.0Gy60Coγ射线分割照射5次/5d后,CyclinD1和PCNA表达受抑制。     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的:建立稳定的基因工程细胞系.方法:将含有人肿瘤坏死因子α(hTNFα)全长cDNA插入表达载体pSNAV2.0,产生重组质粒pSNAV2.0-TNFα,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中,G418筛选阳性克隆hTNF/293,采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达.结果:通过Sal I和EcoR I双酶切、PCR及测序鉴定证明:在质粒pSNAV2.0中插入片段正确.采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFct蛋白表达,分子量为17KDa.结论:成功构建重组质粒pSNAV2.0-TNFα,真核表达载体构建正确,转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外.     

BHRF1表达对~(60)Co照射后CNE2细胞周期分布的影响

目的：了解ＢＨＲＦ１基因表达对６０Ｃｏ照射后ＣＮＥ２细胞周期分布的影响。方法：构建ＢＨＲＦ１高表达载体并转入ＣＮＥ２细胞中，通过检测癌细胞增殖细胞核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）表达和在６０Ｃｏ照射后不同时期细胞周期分布的改变。结果：ＢＨＲＦ１可抑制细胞ＰＣＮＡ的表达及降低Ｓ期的百分率；经６０Ｃｏ照射后，ＢＨＲＦ１ＣＮＥ２细胞的凋亡率较低（Ｐ＜００１），Ｓ期细胞数下降不明显（Ｐ＞００５）；在辐射后的２４小时到７２小时，其Ｓ期和Ｇ２期细胞百分率先后升高。结论：ＢＨＲＦ１基因的表达可抑制细胞的增殖并增强其抵抗辐射诱发的细胞凋亡的发生。     

转人TNFα基因对肾细胞癌细胞癌基因表达的影响

 目的　研究转人 TNFα基因对肾细胞癌 ( Renal Cell Carcinoma,RCC)细胞 ( 786- 0细胞 )癌基因表达的影响。方法　将人 TNFα基因与逆转录病毒载体 p LNCX连接转染包装细胞 ,再感染 RCC细胞 ,MTT法测其中 TNFα的生物学活性 ,用免疫组化法检测细胞癌基因的表达情况。结果　转人 TNFα基因 RCC细胞除 bcl- 2的表达没有影响外 ,EGFR、p1 85 erb B- 2和 c- met的表达有一定程度的降低。结论　该结果为转人 TNFα基因治疗肾细胞癌提供了离体细胞实验基础.     

X线照射对人鼻咽癌细胞株耐药基因及其蛋白表达的影响

[目的]检测X射线照射前后鼻咽癌CNE-1细胞多药耐药基因(MDR1)及其编码产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白基因(MRP基因)及其编码产物多药耐药相关蛋白(MRP)的表达随时间变化的情况。[方法]对CNE-1细胞进行X射线照射,总剂量10Gy/(5d·5f)。利用RT-PCR检测照射前、照射开始后第7、14、21、28和35d细胞的MDR1、MRP基因的表达;Westernblotting检测照射前后P-gp、MRP的表达;MTT法检测照射前后顺铂(DDP)对细胞的半数抑制率(IC50)。[结果]CNE-1细胞X射线照射前MDR1、MRP基因、P-gp和MRP呈弱表达;照射后35d内耐药基因及蛋白表达均显著增高(P<0.05)。[结论]CNE-1细胞X射线照射后耐药基因(MDR1、MRP)及其蛋白(P-gp、MRP)表达显著增强,同时CNE-1细胞对顺铂产生抵抗。     

转染人肿瘤坏死因子-α、白介素-2基因对肺癌细胞耐药基因MDR1、LRP表达的影响

目的 研究转染人体肿瘤坏死因子-α(huTNF-α)、白介素-2(hIL-2)基因对肺癌细胞耐药基因MDR1、LRP表达的影响，探讨基因治疗逆转肺癌多药耐药的可行性。方法 通过阳离子脂质体将克隆的huTNF-α和hIL-2基因导入肺癌细胞系A549、GLC-82、H446、H460，经筛选阳性单克隆，用半定量RT-PCR方法检测转染目的基因前后肺癌细胞系MDR1、LRP基因在mRNA水平的表达情况。结果 MDR1在A549、GLC-82、H446、H460，LRP在A549、GLC-82、H460中均呈阳性表达；转染huTNF-α目的基因后各肺癌细胞系MDR1、LRP基因的表达无影响，而转染hIL-2目的基因能够明显抑制A549、H446、H460细胞系MDR1的表达。结论 MDR1、LRP基因在肺癌细胞系中的阳性表达与肺癌的固有耐药性有关；huTNF-α、hIL-2目的基因能够在被转染细胞中获得表达，而且转染hIL-2目的基因能够明显抑制MDR1在A549、H446、H460的表达。该结果不仅为探讨肺癌多药耐药性的病理机制提供了一个新的线索，而且为基因治疗逆转肺癌的多药耐药性提供了一个新的实验依据。     

HOXB7基因敲除对人肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力的影响

目的 研究同源异型盒基因HOXB7（Homebox7）对人肝癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及部分机制。方法 采用荧光定量PCR法选取HOXB7 mRNA高表达的人肝癌SMMC-7721细胞和HepG2细胞;设计靶向HOXB7的shRNA,瞬时转染肝癌SMMC-7721细胞,荧光定量PCR和Westernblot法检测shRNA靶向沉默的效果,CCK8、Transwell和划痕实验分别用于检测细胞增殖、侵袭和迁移能力;Western blot法测量肝癌SMMC-7721细胞中Smad3、p-Smad3表达水平。结果 HOXB7 shRNA转染的肝癌SMMC-7721细胞中HOXB7基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低,同时细胞增殖、侵袭和迁移能力随之下降,且TGF-β通路中p-Smad3蛋白表达水平下调。结论 HOXB7可促进肝癌细胞增殖、侵袭以及迁移能力,其机制可能与调节Smad3磷酸化水平有关。     

重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白3基因多态性对食管鳞癌预后的影响

摘 要：［目的］ 探讨重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNFAIP3）的多态性位点6304 A>G和食管鳞癌预后的相关性。［方法］ 纳入175例接受完全手术切除的食管鳞癌患者。在手术前收集患者的外周血5ml提取基因组DNA,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)的方法对6304 A>G位点进行基因分型,应用SPSS19.0软件对该位点基因型和基线临床资料进行相关性分析,并用Kaplan-Meier方法进行该位点和预后的生存分析。［结果］ 6304 A>G位点在研究人群的基因分布频率为：AA型133例（76.00%）,AG型39例（22.29%）,GG型3例（1.71%）,最小等位基因频率为0.13,三种基因型分布频率符合哈迪温伯格平衡（P=0.942）。野生型AA型相对于AG/GG型患者者具有明显较晚的肿瘤分期（P<0.001）。AA型和AG/GG型患者的复发比例分别为71.43%和52.38%,差异有统计学意义（P=0.022）。AA型患和AG/GG型患者的中位总生存期（OS）分别为36.2个月和48.5个月,差异有统计学意义（P=0.017）。经多变量Cox模型校正后该位点对患者OS具有独立的影响（OR=0.85,P=0.043）。［结论］ TNFAIP36304G>A多态性位点和食管鳞癌患者总生存期显著相关,G等位基因携带者的预后更好。     

~(60)Co γ射线对HeLa细胞端粒酶活性的影响

 目的　探讨γ射线对人宫颈癌细胞系HeLa端粒酶活性的影响。方法　不同剂量的γ射线照射HeLa细胞后 2 4h、72h、12 0h ,用TRAP ELISA法检测端粒酶的活性。结果　γ射线照射细胞后 2 4h ,较低剂量 (0 .5～ 1.5 )Gy时 ,端粒酶的活性呈剂量依赖式增加 ;(2～ 3)Gy时增加的幅度减低 ;而较高剂量 (4～ 12 )Gyγ射线照射时 ,又呈剂量依赖式增加。与照射后 2 4h相比 ,在较高剂量 (4～ 12 )Gy照射后 72h及 12 0h ,酶的活性呈剂量依赖式减少。结论　HeLa细胞在较高剂量γ射线照射后 2 4h出现的端粒酶活性上调反应 ,可能是其组分从DNA释放增加或者与端粒酶的核内位置调节有关 ;较低剂量照射后的上调反应 ,可能与DNA的修复 ,稳定断裂的染色体有关。