转基因细胞模型L02/HBx的构建及HBx对细胞周期的影响

目的:构建L02/HBx转基因细胞模型并研究HBx对肝细胞周期的影响.方法:运用脂质体转染和G418筛选获得L02/ HBx阳性克隆,并分别用RT-PCR和Western blot鉴定HBx mRNA与蛋白的表达.进一步用四唑蓝(MTT)比色试验、流式细胞仪检测L02/HBx的增殖、凋亡和细胞周期.结果:RT-PCR和Western blot分别检测到L02/ HBx细胞中HBx mRNA和蛋白的表达.MTT比色试验显示L02/HBx生长速度加快,流式细胞仪检测发现L02/HBx凋亡率低(0.09%±0.13% vs 3.74%±1.29%,P<0.05),G1期细胞比例减少(61.35%±0.82% vs 67.80±6.84%,P<0.05),S期细胞比例相应增加(36.59%±2.54% vs 22.37%±2.17%,P<0.05).经阿霉素(ADM)培养后,L02/HBx的凋亡率显著增加(34.91%±5.85% vs 0.09%±0.13%,P<0.05),G1期细胞比例明显增加但低于对照组(82.81%±6.48% vs 61.35%±0.82%,P<0.05;82.81%±6.48% vs 87.19%±1.92%,P<0.05),S期细胞比例降低但较对照组高(13.84%±6.16% vs 36.59%±2.54%,P<0.05;13.84%±6.16% vs 2.22%±1.26%,P<0.05).结论:L02/HBx构建成功,HBx能促进细胞周期进程,加快细胞的生长并抑制细胞的凋亡;转染HBx基因的肝细胞凋亡更易受凋亡因子所触发,表明HBx可能会增加正常肝细胞对诱导凋亡因素的敏感性.     

腺苷酸环化酶相关蛋白2在肝癌组织中的表达及其意义

有关腺苷酸环化酶相关蛋白(adenylate cyclase-associated protein,CAP)2在肝癌中的生物学作用机制尚不明确.本研究应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学技术检测CAP2在人正常肝脏、肝硬化和肝癌组织中的表达,探讨CAP2在肝癌发生发展过程中的作用.     

T-cadherin启动子甲基化与人肝癌T-cadherin表达的关系

目的:探讨T-cadherin启动子甲基化与T-cadherin在肝细胞癌中表达的关系.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)和免疫印迹(Western blot)检测T-cadherin在肝细胞癌中启动子甲基化的状态及其对T-cadherin表达的影响.培养肝癌HepG2细胞,采用去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine处理后.Western blot检测T-cadherin表达,并观察T-cadherin表达对肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响.结果:T-cadherin在肝细胞癌中存在启动子甲基化(40%),肝细胞癌组织中T-cadherin启动子甲基化导致其表达明显下调(表达评分:0.227±0.875 vs 0.188±1.667,P<0.05):对存在T-cadherin启动子甲基化的HepG2细胞应用去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine培养能诱导HepG2细胞T-cadherin分子的重新表达,T-cadherin分子重新表达能抑制HepG2级胞增殖.结论:T-cadherin启动子的甲基化导致其表达下调;去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine能恢复HepG2细胞T-cadherin的表达,并抑制HepG2级胞增殖.     

肝癌组织中KLF4的表达及意义

目的探讨Kruppel样因子4（KLF4）在肝细胞癌（简称肝癌）中的表达及意义。方法应用寡核苷酸基因芯片、逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学技术检测KLF4在健康人、肝硬化及肝癌组织中的表达,并分析KLF4与肝癌临床病理特征的关系。结果寡核苷酸基因芯片分析,KLF4在肝癌差异表达基因谱中明显下调（Ratio=0.438）;RT-PCR及免疫组织化学方法证实,KLF4在肝癌中低表达,其表达缺失与病理学分级显著相关。结论KLF4在肝癌组织中的低表达与肿瘤分化程度密切相关。     

骨形态发生蛋白2、6在肝癌中的表达及意义

目的:研究骨形态发生蛋白2、6(BMP-2、6)在肝癌组织中的表达,并探讨其与肝癌生物学行为的关系.方法:应用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和Western blot检测30例正常肝脏组织和30例肝癌组织的BMP-2、6的表达水平.结果:正常肝脏组织BMP-2、6 mRNA相对表达量显著低于肝癌组织(0.3245±0.1127vs 0.8298±0.1187,0.2947±0.1853 vs 0.7145±0.1373,均P<0.05),Ⅲ、Ⅳ期肝癌组织BMP-2、6 mRNA相对表达量显著高于Ⅰ、Ⅱ期(0.92431±0.1234 vs 0.69355±0.1925,0.8354±0.1423 vs 0.6043±0.1234,均P<0.05).We s t e r n b l o t检测有远处转移的肝癌组织BMP-2、6表达高于无远处转移的肝癌组织(0.9854±0.2888 vs 0.6244±0.3087,0.9076±0.1276 vs 0.5678±0.2493,均P<0.01).结论:BMP-2、6在肝癌中表达上调,可能在肝癌的发生发展中起着重要的作用,其表达上调可能促进肝癌的浸润和转移.     

茎环结构的逆转录实时定量PCR对Huh7细胞microRNAs的检测

目的 建立一种简便检测人肝癌细胞株Huh7细胞microRNAs的实时定量PCR方法,并探讨其敏感性和特异性.方法 提取Huh7细胞总RNA,通过microRNA芯片检测出3个分别代表高、中、低拷贝的microRNA 122、24、146a,并用Northern blot证实.然后分别采用poly(A)加尾和茎环结构的逆转录实时定量PCR方法检测上述3个microRNAs.用Quantity One软件和7500系统软件进行分析.结果 Huh7细胞芯片microRNA 122、24、146a的信号强度分别为2201.49、410.20、4.70,Northern blot证实相对表达量分别为0.0383、0.0249、0.0001.poly(A)加尾逆转录实时定量PCR方法只能检测出microRNA 122,而茎环结构的逆转录实时定量PCR方法对microRNA 122、24,146a均能检测出,其相对于U6平均dCt值分别为2.5、5.8、12.1,与MicroRNA芯片和Northern blot结果一致.结论 应用茎环结构的逆转录实时定量PCR方法能够特异、敏感地检测出Huh7细胞高、中、低拷贝的microRNAs.     

mTOR/P70S6K信号通路在肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的:研究mTOR/P70S6K信号通路在肝细胞肝癌(HCC)中的表达,探讨其在HCC发生发展中的作用及意义.方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测120例HCC患者癌组织、癌旁肝组织以及10例正常肝组织中mTOR及P70S6K mRNA表达情况;并分析mTOR及P70S6K mRNA的表达与相关临床参数的关系.结果:mTOR及P70S6K mRNA在HCC组织中的表达水平显著高于在癌旁肝组织和正常肝组织中的表达水平(mTOR mRNA:0.594±0.218 vs 0.437±0.156.0.594±0.218 vs 0.383±0.081,均P＜0.05;P70S6K mRNA:0.610±0.147 vs 0.486±0.162.0.610±0.147 vs 0.440±0.141,均P＜0.05).mTOR mRNA和P70S6KmRNA在HCC组织中的表达呈正相关(r=0.548,P=0.012),且两者在癌旁肝组织及正常肝组织中的表达亦正相关性(r=0.607,0.737,P=0.005,0.015).mTOR及P70S6K mRNA在HCC组织中的表达水平与病理分期、门静脉癌栓等明显相关,而与肿瘤直径、血清AFP水平、性别等无明显关系.结论:mTOR/P70S6K信号通路在HCC中特异性激活.mTOR/P70S6K信号通路可能在肝细胞肝癌的发生、发展中起重要作用.     

WEE1与肝癌的关系

目的:探讨WEE1在肝细胞癌(HCC)发生、发展中的异常表达及与肿瘤病理分期的关系.方法:收集2010-03/2010-05河南省人民医院肝胆外科手术标本正常肝组织23例,肝硬化20例,HCC42例.采用RT-PCR检测mRNA水平的表达,Western blot及免疫组织化学检测蛋白的表达,并分析其与肝癌临床病理学分期的关系.结果:WEE1mRNA阳性表达率分别为21.7%、55.0%和90.5%,三组间差异有统计学意义(P<0.01).Western blot和免疫组织化学方法分别检测蛋白阳性表达率分别为13.04%/17.4%、40%/60%和78.6%/83.3%,三组间相比差异有统计学意义(P<0.01).肝癌组织中WEE1强度与肿瘤的分化程度及病理分级相关(χ2=17.454,P<0.01;χ2=14.559,P<0.01).结论:WEE1基因在肝癌中呈上调表达,其参与的DNA的修复异常与肝癌的发生密切相关; 且与肿瘤的分化程度和病理分级相关.     

人肝癌多药耐药细胞模型的建立

目的:为研究肝癌多药耐药(MDR)机制,采用5种抗癌药物通过不同的诱导方式建立一组人肝癌MDR细胞模型。方法:利用RT-PCR、流式细胞术和四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定MDR细胞中5种MDR基因的表达及耐药倍数。结果:SMMC7721/DOX亚系由mdr_1基因介导耐药,SMMC7721/VCR亚系由MRP基因介导耐药,SMMC7721/CBP亚系由LRP基因介导耐药,SMMC7721/VP16亚系由TopoⅡα基因介导耐药,SMMC7721/MMC亚系由GST_(P1)基因介导耐药,多重MDR亚系SMMC7721/M的耐药涉及mdr_1、MRP、URP、TopoⅡα和GST_(P1)。结论:MDR细胞模型可用于耐药研究。     

不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异表达

目的对比观察不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异性表达。方法Pre- mier软件设计18对趋化因子受体引物,RT-PCR分析SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM6细胞侵袭转移潜能逐渐增强的人肝癌细胞株趋化因子受体谱。结果4组不同转移潜能细胞株趋化因子受体表达谱存在明显差异（P＜0．01）,其中CCR10、CXCR4、CXCR6表达随转移潜能增加逐渐降低。HCCLM6表达谱中CCR3、CCR4、CCR10、CCR12及XCR1比SMMC-7721表达明显降低甚至缺失（P＜0．01）,而CXCR1（P=0．006）、CXCR5（P=0．003）表达高于低转移潜能组SMMC-7721。MHCC97-H和MHCC97-L比较,除CXCR2、CXCR6、XCR1外差异均有统计学意义,其中CCR1（P=0．002）、CCR2（P=0．004）、CCR5（P=0．046）表达高于MHCC97- L。CXCR4在模板减量时只能在SMMC-7721组检测到。结论高低转移潜能肝癌细胞株趋化因子受体表达在mRNA水平存在差异性表达,与肝癌细胞株差异性转移潜能相关。     

HBx及其截短体在乙型肝炎病毒复制中的作用

HBV感染作为引起慢性乙型肝炎、乙肝后肝硬化、原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的起始因素,已成为世界性的健康问题.据统计,目前世界上已有超过5亿人感染HBV,每年有1百万人死于乙肝相关疾病.HBx蛋白作为HBV的一个多功能调节蛋白,已被证实在HCC的发生过程中起了重要作用.近年来,关于乙肝病毒X蛋白(HBV X protein,HBx)影响HBV的复制研究也有了一定的进展.同时,越来越多的HBx截短体在肝病发展过程中的作用也被重视.本文将对HBx及其截短体在HBV复制中的作用作一综述.     

靶向HBx基因shRNA载体稳定表达人肝癌细胞的建立

本研究采用整合有HBV DNA而HBsAg表达阴性的人肝癌细胞株MHCC97-H,应用免疫荧光法初步研究HBx表达,并从基因组中克隆HBx基因,采用RNA干扰(RNAi)技术,构建靶向该HBx基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,通过转染和筛选,研究shRNA载体在MHCC97-H细胞中稳定表达对HBx基因表达的影响,最终构建稳定表达靶向整合HBx基因的shRNA载体的人肝癌细胞模型,为进一步研究构建平台.     

稳定表达HBx基因的HepG2细胞对顺铂敏感性的变化及其机制研究

目的 探讨乙肝病毒x基因(HBx)对肝癌细胞株HepG2化疗敏感性的影响及其机制。方法 1.构建HBx的真核表达载体;2.脂质体法转染HepG2,G418筛选得到稳定表达HBx-ORF的阳性细胞克隆;3.Western blot法检测转染前后磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)的表达变化;4.MTT法检测转染前后HepG2对顺铂的反应,以及用PD98059特异性阻断ERK1/2激活通路后HBx+HepG2对顺铂敏感性的变化。结果 1.稳定表达HBx-ORF的HepG2中p-ERK1/2的表达明显强于阴性细胞;2.稳定表达HBx-ORF的HepG2在2μg/ml顺铂作用24小时后,顺铂对其抑制率为19.45％±2.50,明显低于阴性组的33.15％±2.85和转染空质粒组的30.79％±2.66(P<0.05);用PD98059阻断阳性细胞中ERK1/2的激活之后,相同剂量,时间作用下,对HBx+HepG2的抑制率上升至32.28％±4.22,明显高于阻断前(P<0.05)。结论 HBx通过ERK通路介导肝癌细胞的抗化疗反应,ERK通路有可能成为乙肝后肝癌辅助治疗的靶点。     

稳定表达HBx的人肝细胞系7702的建立

目的 构建HBx表达载体,筛选可稳定表达HBx的人肝细胞(HL)-7702细胞系。 方法 采用RT-PCR法扩增HBx 基因片段,并将其连接至pIRES载体,经酶切和测序鉴定pIRES-HBx重组质粒序列。然后,分别采用Real-time PCR和Western blot技术检测验证重组质粒的正确性。最后,应用G418抗生素筛选稳定表达HBx的HL-7702细胞系。结果 经PCR扩增得到正确的HBx片段,成功构建pIRES-HBx质粒,将重组质粒转染HEK 293 细胞和HL-7702细胞均实现了HBx过量表达;经免疫荧光法鉴定,我们获得了稳定大量表达HBx的HL-7702细胞系。结论 成功构建的pIRES-HBx表达载体能在HL-7702细胞稳定表达HBx,为后续研究提供了基础实验工具。     

乙型肝炎病毒x影响肝细胞增殖与凋亡的初步研究

目的 观察乙型肝炎病毒x(HBx)导入正常肝细胞后对细胞周期及凋亡的影响,探讨HBx致肝细胞癌的发生机制.方法 应用脂质体转染重组质粒pcDNA3.1( )/v5-hisB-HBx后,G418筛选获得阳性克隆L02/HBx,分别用RT-PCR和Western blot鉴定其HBx mRNA与蛋白的表达.噻唑蓝比色法(MTT)及细胞生长曲线观察细胞增殖情况,流式细胞术分析其细胞周期特征与凋亡率.结果 构建的L02/HBx细胞中可稳定表达HBx mRNA及蛋白.与对照组比较,L02/HBx细胞增殖速度明显加快(P＜0.05);其G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例显著增加,凋亡率明显降低(P＜0.05).结论 成功构建稳定表达HBx的转基因细胞株L02/HBx,初步显示HBx可促进肝细胞增殖,抑制细胞凋亡,从而加速细胞周期进程,可能参与肝细胞的恶性转化.     

表达乙肝病毒YVDD变异株肝癌细胞模型的建立

目的：建立能稳定表达乙肝病毒（HBV）YVDD变异株的细胞模型，为研究HBV YVDD变异株的生物学特性和进行抗病毒药物筛选提供细胞模型。方法：以pcDNA3．1-HBV-YVDD为模板设计两对引物，扩增带不同酶切位点的HBV全基因，扩增产物纯化后，经酶切、连接，得到pcDNA3．1-HBV．YVDD重组体。采用脂质体转染技术，将pcDNA3．1-HBV-YVDD重组体转染体外培养的HepG2细胞。细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的检测用酶联免疫吸附法（ELISA）法，反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HBV多聚酶的表达。结果：建立了HBV-YVDD变异株体外感染的细胞模型HepG2-2HBV-YVDD。该细胞模型能表达较高水平的HBsAg和HBeAg，并能检测到多聚酶的表达。结论：成功构建了能较稳定表达HBV-YVDD变异株的细胞模型。     

HBx和VEGF与HBV相关性肝癌组织血管生成及转移的关系

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)和血管内皮生长因子(VEGF)与HBV相关性肝癌组织血管生成及转移的关系。方法选择84例HBV相关性肝癌组织和22例非HBV相关性肝癌组织,免疫组织化学法检测HBx、VEGF及血管内皮细胞表面抗原(CD34)表达,光镜下记录微血管计数(MVD)。结果84例HBV相关性肝癌组织中HBx阳性表达率为73.81%(62/84),阴性率为26.19%(22/84);62例HBx阳性表达组中的VEGF阳性率为74.19%(46/62),明显高于22例HBx阴性组36.36%(8/22)和非HBV相关性肝癌组36.36%(8/22)(P0.05);HBx阴性表达的HBV相关性肝癌组和非HBV相关性肝癌组中VEGF阳性表达差异无统计学意义(P0.05);HBx和VEGF的表达呈正相关(r=0.552,P0.01);二者在高分化肿瘤组织中的表达高于低分化组织(P0.05),且转移组表达高于无转移组;HBx阳性表达组平均MVD值明显高于HBx阴性组和非HBV相关性肝癌组(P0.01),有转移组MVD高于无转移组(P0.01);有门脉侵犯组高于非侵犯组(P0.05)。结论HBx和VEGF广泛表达于HBV相关性肝癌组织中,二者呈正相关;HBx可能通过上调VEGF的表达在HBV相关性肝癌组织血管生成及转移中起促进作用。     

HBx基因缺失突变体HBx-d382对L02细胞增殖及非锚定依赖生长能力的影响

目的:建立稳定表达HBx基因缺失突变体(HBx-d382)的L02肝细胞株,并探讨其对L02细胞增殖的影响.方法:含HBx-d382重组质粒(pCDNA3.0/HBx-d382)经过PCR扩增、双酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染和G418筛选获得稳定表达HBx-d382的L02肝细胞株.PCR鉴定基因组中HBx-d382基因整合.RT-PCR和Western blot鉴定其表达,进一步通过MTT法,软琼脂克隆形成实验检测HBx-d382对L02细胞增殖及非锚定依赖生长能力的影响.用流式细胞仪检测其对细胞周期的影响.结果:经PCR扩增、双酶切及测序鉴定HBx-d382重组质粒构建正确.稳定转染该质粒的L02细胞基因组存在HBx-d382整合.RT-PCI汲Western blot表明在RNA水平和蛋白水平存在HBx-d382表达,稳定表达HBx-d382的L02细胞其增殖能力和非锚定生长能力增强,S+G2期细胞比例升高.结论:成功构建了HBx缺失突变体的真核表达模型,证实HBx缺失突变体能影响细胞增殖,这种效应可能与其影响细胞周期调控相关.     

乙型肝炎病毒X蛋白在体外和体内对SMMC-7721细胞生长与分化的影响

近年来,HBV对肝癌细胞生物学行为的影响受到越来越多的关注.我们前期研究结果表明乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)可以诱导肝癌细胞株SMMC-7721发生上皮-间质样表型转化(EMT),并显著增强肝癌细胞侵袭转移潜能[1].