不同微泡浓度对NT-3基因转染神经干细胞的影响

目的探讨低频超声下体外介导神经营养因子3（NT-3）基因转染神经干细胞的适宜超声微泡浓度。方法体外培养神经干细胞,在24孔板中加入200μl不同浓度（分别为10％、20％和30％）微泡和20μl pEGFP-NT-3基因重组质粒（1μg／u1）混合静置30min。将500μl神经干细胞悬液（3×10^5／ml）加入微泡和质粒混合液中,固定声强1．5W／cm^2,照射时间60s,占空比10％,用1MHz超声探头辐照。转染后流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白表达情况,MTT法检测神经干细胞存活率。空白对照组为质粒与神经干细胞的混合物,不经超声辐照。结果微泡浓度为10％时,细胞存活率〉80．00％,但细胞转染率只有（6．26±0．58）％;微泡浓度为30％时,细胞存活率〈40．00％,同时转染率最低;而当微泡浓度为20％时,细胞存活率较高[（69．66±2．08）％],且细胞转染率最高[（14．39±1．79）％]。结论在一定超声辐照参数条件下,微泡浓度20％的细胞转染率较高,且对细胞损伤较小,可作为神经干细胞基因转染的适宜条件。     

超声微泡介导基因转染在肾脏病研究中的应用

超声微泡介导的基因治疗是近年兴起的新型基因转染技术,它利用超声或超声联合微泡的声致孔隙效应（sonoporation）介导基因高效转染。微泡造影剂可以加强这种效应,     

超声靶向微泡破裂介导EGFP质粒转染肝癌细胞的研究

目的探讨超声靶向微泡破裂(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD)介导EGFP质粒转染肝癌细胞株HepG2的有效性、安全性并优化超声辐照参数。方法体外培养HepG2细胞,在不同治疗超声的声强、占空比和辐照时间作用下,观察pEGFP-N3质粒在HepG2细胞中的转染。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪检测细胞的转染率,MTT法检测细胞活性。结果在超声声强为2 w/cm2、占空比为20%、照射时间为60 s时,HepG2细胞的7转染率最高,达到11.53%±2.15%,且细胞生存率大于85%。结论 UTMD是一种有效的基因转染方法,不同的超声转染参数对细胞活力和基因传输效率有较大影响,对其进行优化后可减少细胞损伤,增强基因转染。     

神经干细胞转染胶质细胞源性神经营养因子基因后的分化表现

目的观察转基因神经干细胞(NSC)体外外源基因的表达及转基因后的分化。方法体外转基因筛选得到稳定表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的脊髓源神经干细胞系(SP-NSC),通过流式分选(FACS),比较转基因前、后及血清对NSC分化为神经元及神经胶质细胞比例的变化;并采用Westernblot法检测传代后目的基因的表达。结果转基因后GDNF表达至少能稳定到转基因后6周;转基因后NSC分化为神经元的比例由转基因前(53.9±3.5)%提高到转基因后的(67.5±1.2)%,而血清组胶质细胞分化明显。结论SP-NSC转染GDNF后能稳定表达目的基因,转基因能显著增加后裔细胞中神经元比例,为转基因治疗中枢神经系统疾病研究奠定了基础。     

超声辐照参数对体外基因转染效果的影响

目的探讨超声辐照参数对体外基因转染效果的影响及最佳转染条件。方法将293T细胞种植于24孔板内,24h后更换为转染液进行超声辐照,EGFP质粒浓度为1mg/ml,每孔加入15μg;超声强度分为1.5、2.0、2.5W/cm2,辐照时间分为30、45、60s,微泡浓度分为20%、30%、40%;每个参数相互组合并重复4次。转染后72h于荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白的表达,以流式细胞仪检测荧光细胞比例,CCK-8检测细胞存活率,计算转染效率。结果超声声强、辐照时间、微泡浓度均对转染效率有显著影响。辐照条件为2.0 W/cm2、辐照时间45s、微泡浓30%时转染效率最高,可达(35.25±1.40)%。结论超声辐照参数共同影响转染效果,低条件下相互协同,高条件下相互抑制,选择合适的辐照参数是超声介导体外基因转染的重要因素。     

微泡造影剂结合超声介导一氧化氮合成酶基因转染防治移植静脉再狭窄

目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因转染防治移植静脉血管桥再狭窄的可行性.方法 重组真核表达载体pcDNA3.1-eNOS经微泡造影剂及超声辐照介导体外转染大鼠颈外静脉,再将静脉段间置植入颈总动脉,建立SD大鼠颈外静脉-颈总动脉移植模型.于术后4周取移植静脉标本分别进行苏木素-伊红(HE)染色,免疫组织化学染色及Western blot法分析,观察eNOS基因在静脉桥中的功能表达和静脉桥新生内膜的增生.结果 Western blot法分析表明微泡造影剂及超声辐照介导eNOS基因转染组的移植血管桥内eNOS表达最明显;增殖细胞核抗原( PCNA)检测阳性率为(21.04±3.51)％,细胞凋亡指数为(12.11±1.23)％,新生内膜厚度(25.0±3.5) μm,内膜/中膜比值为0.43,均明显低于其他组(P＜0.05).结论 微泡造影剂及超声辐照介导eNOS基因转染可以有效抑制移植静脉桥新生内膜的增生.     

超声微泡造影剂介导基因转染的研究进展

基因治疗疾病的有效性主要取决于基因转染率,基因转染载体包括病毒载体和非病毒载体。超声微泡造影剂为一种新型非病毒载体,介导基因转染具有安全、靶向、目的基因转染率高等优点,本文对近年来超声微泡造影剂介导基因转染的研究进展进行综述。     

超声微泡介导白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因体外转染兔软骨细胞的研究

目的 观察超声介导下携白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因(IL-1Ra)的微泡体外转染兔软骨细胞的效率和表达.方法 体外分离培养兔软骨细胞,分为单纯质粒组(P)、微泡+质粒组(M+P)、超声+质粒组(U+P)和超声+微泡+质粒组(U+M+P),照射后48 h,荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测IL-1Ra基因的mRNA和蛋白表达,台盼兰染色检测细胞生存率.结果 U+M+P组转染效率较其他三组明显提高,为(11.6±1.0)%;且eGFP-C1-IL-1Ra质粒经超声微泡介导转染后可表达IL-1Ra的mRNA和蛋白.结论 超声微泡可介导IL-1Ra基因在兔软骨细胞内的转染和表达,可望成为软骨损伤基因治疗的新方法.     

腺病毒介导的NT-3基因在骨髓间质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒介导的NT-3基因在培养的大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达.方法:在293细胞中培养扩增NT-3重组腺病毒(adenovirus vector for NT-3,Ad-NT-3),测定病毒滴度,然后用Ad-NT-3感染传代培养的MSCs,RT-PCR技术检测NT-3基因的表达.结果:Ad-NT-3扩增后获得了较高滴度的病毒,MSCs经Ad-NT-3感染后有NT-3 mRNA的转录.结论:腺病毒介导的NT-3基因可转入培养的MSCs并高效表达,为NT-3基因治疗的研究奠定了基础.     

超声微泡与阳离子多聚物联合应用促进基因转染的研究进展

超声能够促发携核酸分子微泡于靶部位破裂并释放核酸分子,同时声致孔隙效应使得细胞膜通透性增加,促使外源基因进入细胞,实现安全有效的靶向基因转染,但其转染效率较低,转染质粒表达持续时间短暂。阳离子多聚物可通过凝聚带负电荷的核酸形成复合物并结合于细胞膜表面,通过细胞内吞或膜融合作用进入胞内,转染效率相对较高,但具有一定细胞毒性。超声联合微泡与阳离子多聚物结合应用能够进一步促进基因转染,并降低阳离子多聚物的细胞毒性,是一种有前景的非病毒载体联合基因转染技术。     

神经营养因子-3基因转入雪旺细胞的实验研究

目的观察阳离子脂质体转染神经营养因子-3（NT-3）基因在培养雪旺细胞（Schwann cell，SC）的表达和提高雪旺细胞分泌NT-3的能力。方法用消化后的组织块法和差速离心法分离、纯化雪旺细胞。用脂质体转染法将NT-3基因导入雪旺细胞，ELISA双抗体夹心法检测NT-3的表达；免疫组化S-100法鉴定SC的纯度。结果经免疫组化S-100法鉴定SC的纯度达95％以上。ELISA双抗体夹心法测定转染后不同时期的NT-3的浓度，2周后表达增加，4周后明显增加，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论NT-3基因可转入培养的SC并有高效表达。SC作为受体细胞，易于获取并能在体外大量培养繁殖；能较长时间表达所携带基因而不衰减，并能稳定地大量表达。     

Lentivirus介导表达多基因的人胚基因工程神经干细胞的实验研究

目的：探索以Lentivirus为载体，构建同时携带并表达多基因的基因工程人胚神经干细胞(human neural stem cell，hNSC)的可行性，为脊髓损伤治疗的研究提供材料。方法：培养和鉴定hNSC：用携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)和神经营养因子-3(neurotrophic factor-3，NT-3)的Lentivirus转染hNSC；用荧光显做镜观察、鼠胚背根神经结培养(dorsal root ganglion，DRG)和Slot blot等方法检测基因工程hNSC的多基因表达情况。结果：培养获得了大量的hNSC；荧光显微镜观察到几乎100％的hNSC表达GFP：基因工程hNSC的培养液能促使大鼠DRG旺盛生长；Slot blot检测到基因工程hNSC能高效分泌NT-3蛋白。结论：以Lentivirus为载体能构建同时携带并稳定表达多基因的基因工程hNSC．为脊髓损伤治疗的基础研究及进一步临床应用提供了有价值的细胞资源。     

电穿孔介导睫状神经营养因子基因转染延缓失神经肌萎缩

目的　探索一次性电穿孔介导睫状神经营养因子 (ciliaryneurotrophicfactor ,CNTF)转染延缓失神经骨骼肌萎缩的疗效。方法　制备 3 6只SD大鼠右下肢腓肠肌失神经支配模型 ,按手术先后顺序随机分成失神经对照组 (A组 )和CNTF基因转染组 (B组 ) ,每组 18只大鼠。于术后 2、4、8周测定肌湿重维持率、肌细胞截面积、肌肉蛋白含量、胶原纤维与肌细胞面积比和细胞凋亡数。结果　术后 2、4周B组的肌湿重维持率、肌细胞截面积和肌肉蛋白含量均明显高于A组 (P <0 .0 5 ) ,但胶原纤维与肌细胞面积比和细胞凋亡数明显低于A组 (P <0 .0 5 )。术后 8周 ,两组间各参数无明显区别 (P >0 .0 5 )。结论　一次性电穿孔介导CNTF基因转染可延缓失神经骨骼肌萎缩四周。     

不同方法转染人前列腺癌PC-3细胞pEGFP-N1基因的体外实验研究

目的:探讨转染人前列腺癌PC-3细胞pEGFP-N1基因的最佳转染方法。方法:以超声微泡造影剂、超声辐照、脂质体转染及其相互结合的方法,将质粒pEGFP-N1基因转染人前列腺癌PC-3细胞,24h后以荧光显微镜观察前列腺癌PC-3细胞中的绿色荧光蛋白表达情况,并用流式细胞仪测定转染率。结果:以超声+微泡+脂质体组基因转染效率最高,与其他组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:超声联合微泡与脂质体结合能明显提高pEGFP-N1基因在人前列腺癌细胞中的转染率,是一种较理想的基因转染方法。     

神经营养因子-3诱导大鼠脊髓神经干细胞分化为胆碱能神经元的实验研究

目的 观察神经营养因子-3（NT-3）在体内外能否诱导脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元。方法 从孕龄15d的胚胎sD大鼠脊髓组织中分离获得脊髓源性神经干细胞。体外诱导分化研究：实验组在培养脊髓源性神经干细胞时，去除表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子加入NT-3进行诱导；对照组则单纯培养脊髓源性神经干细胞。体内诱导分化研究：实验组将去除表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子加入NT-3的脊髓源性神经干细胞混合悬液移植于成年SD大鼠切断胫神经远端，对照组则移植未加NT-3脊髓源性神经干细胞悬液。细胞免疫荧光化学法鉴定分化结果。结果 经NT-3诱导的脊髓源性神经干细胞用细胞免疫荧光化学法鉴定，体内外培养均可检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞，而对照组则未检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞。结论 NT-3在体内外均可诱导脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元。     

Lipofectamine介导转染神经干细胞的研究

目的观察阳离子脂质体法转染体外培养神经干细胞的转染效率和外源基因的表达。方法从1d龄新生鼠大脑皮层组织培养神经干细胞，带有报告基因GFP的穿梭质粒pAd．Tract-CMV经Lipofectamine介导转染神经干细胞后观察GFP表达，用流式细胞仪测定转染率。并观察阳离子脂质体对神经干细胞的毒性作用。结果荧光显微镜观察到被转染的神经干细胞长期表达绿色荧光蛋白。流式细胞仪结果显示转染率最高可达到39．99％。转染时，阳离子脂质体浓度超过24ml／L时表现出细胞毒性。结论阳离子脂质体hpofectamine介导转染神经干细胞效率较高，外源基因表达时间长。     

超声联合微泡介导肝癌靶向治疗的研究进展

随着超声影像技术的不断发展和造影剂制备工艺的不断改进,超声造影剂正在从诊断领域向治疗领域拓展。作为一种新的药物和基因载体,造影剂受到广泛关注,同时其在增强超声介导疾病治疗方面也显示出一定优势。本文就造影剂联合超声辐照介导肝癌靶向治疗的研究进展进行综述。     

血管内皮生长因子基因体外转染大鼠神经干细胞的研究

目的 探讨经脂质体介导转染血管内皮生长因子(VEGF)121基因的大鼠胚胎神经干细胞体内外基因表达的特点。方法脂质体介导法将VEGF121基因转染到大鼠神经干细胞中。经逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫荧光染色检测转基因神经干细胞及其分化细胞的基因表达情况。用立体定向法将BrdU标记的转基因神经移植到大鼠大脑中动脉梗死模型的纹状体缺血半暗区。免疫荧光染色观察移植后1周转基因神经干细胞在脑内的基因表达情况。结果转基因神经干细胞及其分化的子代细胞均有VEGF121的表达并持续2周左右。转基因神经干细胞移植后1周在宿主脑内迁徙并表达VEGF基因产物。结论经脂质体介导转染VEGF121基因的大鼠胚胎神经干细胞在体内外均有良好的基因表达。     

血栓内微泡联合尿激酶介导的超声溶栓体外实验

目的探讨血栓内微泡联合尿激酶介导的超声溶栓对体外血栓的溶解效果。方法取牛全血制作血栓样本50个,随机平均分为5组后于带有侧支循环的体外循环装置中进行处理。实验1组为超声微泡尿激酶组,实验2组为超声微泡组,实验3组为超声尿激酶组,实验4组为单纯尿激酶组,实验5组为无处理组。计算并比较各组的溶栓率。并进行HE染色及免疫荧光组织学观察。结果实验1组溶栓率为(73.64±14.16)%,实验2组为(47.97±11.66)%,实验3组为(57.33±8.65)%,实验4组为(50.85±9.63)%,实验5组为(29.76±18.06)%。其中实验1组溶栓率高于其余各组,差异均有统计学意义(P均0.05);该组HE染色组织学检查可见明显多灶状血栓溶解,边缘可见血栓崩裂,免疫荧光可见纤维蛋白网断裂。结论血栓内微泡联合尿激酶介导的超声溶栓在体外实验中可提高血栓的溶解率。     

超声微泡造影剂携基因或药物治疗研究

超声微泡造影剂经静脉注射到靶组织后,在超声能量作用下,因“空化效应”,能有效穿透血管内皮屏障,定向释放内部包裹的基因或药物,使局部浓度大大增高,达到靶向治疗目的。微泡可能成为靶向治疗的载体,超声造影剂作为一种新型、无创的运载系统具有广阔的应用前景。