梯度离心法分离、富集、纯化新生乳鼠心肌细胞

目的:探讨体外心肌细胞的分离与培养实验方法,建立研究心脏疾病的基础实验平台。方法:取新生小鼠心脏12只,利用胰酶和胶原酶双消化6次,利用percoll密度梯度离心法离心纯化分离细胞,贴壁培养1h,分离层纤维细胞,抗体标记分离后的心肌细胞,流式细胞仪鉴定细胞纯度。结果:分离新生小鼠的心肌细胞的纯度为91.3%。结论:本方法操作简单,获得心肌细胞的分离效率高,存活时间长。     

The culture of primary cardiac cells

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.     

原代心肌细胞培养

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察。方法:取出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度。结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92%,纯度90%,2～3 d出现同步搏动。结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好。     

乳小鼠心肌细胞体外培养方法的优化

目的探讨乳小鼠心肌细胞分离和体外培养的方法,并结合实际情况建立一种优化的体外培养乳小鼠心肌细胞的方法。方法胰酶-Ⅱ型胶原酶混合液分次消化乳小鼠心肌组织后行差速贴壁法达到心肌细胞纯化目的,并利用心肌细胞特意表达a-肌动蛋白的特性运用细胞免疫组织化学方法鉴定心肌细胞。结果差速贴壁48h后心肌细胞贴壁完全,并见大部分贴壁细胞出现搏动,但未观察到同簇搏动,经a-肌动蛋白细胞免疫组织化学鉴定,心肌细胞纯度达96.7%。结论本研究优化了原代乳小鼠心肌细胞分离和体外培养方法,为后续细胞实验打下了基础。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

目的 探讨更为简单、有效的新生大鼠心肌细胞分离、培养方法.方法 取出生24 h内大鼠左心室,剪碎,0.125%胰蛋白酶、0.08%胶原酶Ⅰ分离,离心收集心肌细胞,差速贴壁法和化学试剂抑制非心肌细胞生长,纯化后培养于DMEM培养基.免疫荧光鉴定纯度,0.4%台盼蓝染色检查心肌细胞成活率.结果 心肌细胞纯度为95%,平均成活率96%,并出现同簇细胞的同步跳动.结论 本研究应用改良的新生大鼠心肌细胞培养方法,心肌细胞存活率高,纯度高,且操作简便,重复性好,是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法,可满足实验要求.     

新生大鼠心肌细胞体外培养及其与心肌成纤维细胞形态比较

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,比较心肌细胞和成纤维细胞的形态差异。方法胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行体外培养,差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置显微镜跟踪观察心肌细胞的生长及搏动情况,台盼兰负染法检测心肌细胞活力,通过HE染色观察心肌细胞和成纤维细胞的形态学差异。结果接种24 h后细胞全部贴壁,部分细胞开始自发性搏动,48 h后,细胞体积增大,并伸出伪足,形状以三角形和梭形为主,3 d后细胞聚集成片并同步搏动且细胞活力均在90%以上。心肌细胞为梭形或三角形,胞质致密,多为单核细胞;心肌成纤维细胞呈泡状,双核和三核细胞较多,培养过程中不发生搏动。结论胰蛋白酶消化法培养新生大鼠心肌细胞快速有效,差速贴壁法纯化的心肌细胞可用于实验研究。     

体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌单个心肌细胞获取方法的建立

目的:探讨体外分化的小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织单个心肌细胞获取方法.方法:用胰酶、胶原酶溶液消化乳大鼠心室肌组织及小鼠胚胎干细胞源心肌细胞,获得细胞悬液经Percoll分离纯化后,再低密度接种富集的心肌细胞,通过光镜观察获得的单个跳动的心肌细胞,采用免疫组织化学和激光共聚焦方法鉴定心肌细胞.结果:乳大鼠心室肌组织及小鼠胚胎干细胞源心肌细胞用胰酶、Dispase酶消化,经Percoll分离纯化后,能获得纯的单个心肌细胞,光镜下单个心肌细胞收缩明显而有力.免疫组织化学和激光共聚焦观察发现单个心肌细胞中有肌原纤维束.结论:使用胰酶、Dispase酶消化后,经Percoll分离纯化可从体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织获得活性良好的单个心肌细胞.     

不同差速贴壁时间对心肌细胞培养的影响实验性研究

目的:探讨心肌细胞分离、纯化和培养方法.方法:采用不同差速贴壁时间分离、纯化、培养新生乳鼠心肌细胞.结果:心肌细胞培养,采用差速贴壁60min组与90min组之间无统计学意义,差速贴壁60min组、90min组与差速贴壁120min组两两之间均有统计学差别.结论:心肌细胞培养过程中,采用差速贴壁60min、90min较差速贴壁120min获得的心肌细胞数量高.     

BALB/c小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养

目的：建立分离、纯化和培养BALB/c小鼠乳鼠心肌细胞的方法。方法：取出生1～3天以内的BALB/c小鼠乳鼠心肌组织,用0.125%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型胶原酶消化,将心肌细胞收集到含15%胎牛血清的DMEM培养基中,用差速贴壁分离法和5-溴脱氧尿苷相结合分离、纯化心肌细胞。采用α-actin抗体进行免疫组化染色鉴定心肌细胞,用台盼蓝染色检查心肌细胞成活率。结果：24小时后可见部分单个心肌细胞搏动,48小时后可见心肌细胞相互连接同步搏动;免疫组化染色后可见培养的细胞是心肌细胞,心肌细胞成活率达95%。结论：本研究应用的方法可获得状态好、高成活率的BALB/c小鼠心肌细胞,是一种可靠的心肌细胞培养方法。     

成年大鼠心室肌细胞的分离、培养与鉴定

目的探讨成年大鼠心肌细胞的分离、培养方法.方法麻醉后取成年Wistar大鼠心脏连接于Langendorff装置上进行0.1%胶原酶 0.1%透明质酸酶灌注肖化分离心肌细胞,纯化后培养于DMEM培养基.用免疫荧光染色方法鉴定心肌细胞,并在倒置显微镜、电镜下观察细胞的形态结构.结果本方法分离、培养的心肌细胞纯度为98%,细胞活性为92%,杆状细胞率为82%.结论该方法简单有效,为深入研究成年心肌细胞打下了基础.     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进

目的：对新生大鼠心肌细胞分离培养方法进行改进,以期获得较高纯度和活力的心肌细胞;方法：采用胶原酶消化法分离大鼠心肌细胞,控制消化时间、消化温度、搅拌速度、离心次数和速度等,结合贴壁分离和Brd U干预纯化心肌细胞,流式细胞仪分析肌钙蛋白Ⅰ（troponin Ⅰ,Tn Ⅰ）表达,荧光探针进行胞浆游离钙离子染色;结果：多数心肌细胞自动收缩,逐渐聚集形成肌管,troponin Ⅰ阳性率达92％,所有心肌细胞钙离子染色阳性,并随细胞收缩呈周期性变化;结论：该方法分离培养的心肌细胞具有较高的纯度和活力。     

SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进

目的:探讨SD乳鼠原代心肌细胞最佳分离、纯化及培养方法,以提供可靠的心肌细胞模型。方法:用含0.1%的胰蛋白酶及0.1%Ⅱ型胶原酶的酶混合液分离乳鼠心脏组织,并用差速贴壁分离法和5-溴脱氧尿核苷抑制法进行纯化,用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化,免疫组织化学染色方法检测心肌细胞的纯度。结果:台盼蓝染色观察细胞存活率达(96.9±8.9)%以上。显微镜下心肌细胞由圆形渐变为梭形、多边形,逐渐形成细胞簇,搏动频率约120～150次/min。用抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体鉴定心肌细胞,阳性率为(90.5±1.6)%。结论:本方法所获SD乳鼠的心肌原代细胞纯度高、活力强。     

乳鼠心肌细胞体外培养的探讨

目的研究乳鼠心肌细胞培养的方法,以提高心肌细胞的单细胞收获率、存活率及搏动率。方法用机械解离法和酶消化法分离乳鼠心脏组织,并用差速黏附贴壁法和化学药物抑制法进行纯化,然后在倒置相差显微镜下动态观察细胞形态。结果第1天心肌细胞几乎全部贴壁,少数细胞出现自发性搏动;第3天形成细胞簇或细胞单层,收缩明显而有力。结论本方法单细胞收获率、存活率高,心肌细胞和非心肌细胞分离彻底,是比较理想的培养方法。     

改良的乳鼠心肌细胞分离与培养新方法

目的 探讨一种简单有效的SD大鼠乳鼠心肌细胞分离与培养方法.方法 取出生24 h以内的大鼠心室,0.08％的胰蛋白酶反复消化多次,离心收集心肌细胞,差速培养后5-溴脱氧尿嘧啶核苷纯化心肌细胞.用全细胞膜片钳方法,记录心肌细胞动作电位,并用激光共聚焦显微镜观察钙瞬变、线粒体膜电位.结果 心肌细胞存活率大于93％,心肌细胞纯度大于96％,细胞形态良好,出现节律性搏动,钙瞬变波形稳定、规律,动作电位和线粒体膜电位均正常.结论 本研究方法分离心肌细胞存活率高、活性好,是一种简单、高效的心肌细胞原代培养方法,可广泛应用于各种研究.     

新生大鼠心肌细胞的原代培养方法的探讨

目的 改进心肌细胞的原代培养方法,提高心肌细胞收获率和存活率。方法 使用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分次消化心脏组织,差速贴壁分离法和化学试剂抑制法纯化心肌细胞。结果 8h后少数细胞出现自发性搏动;24h心肌细胞几乎全部贴壁,第1-3天形成细胞簇或细胞单层,心肌细胞收缩明显而有力。结论 胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶配合使用可以分离获得形态、活力良好的心肌细胞。     

急性分离的成年大鼠心肌细胞在免疫荧光染色中的应用

目的介绍用急性分离的心肌细胞进行免疫荧光染色的方法。方法采用急性分离的成年大鼠心肌细胞和培养的乳鼠心肌细胞为标本,分别用免疫荧光染色直接法和间接法对细胞的肌动蛋白和肌钙蛋白进行染色。结果无论是用肌动蛋白或肌钙蛋白抗体,两种心肌细胞染色效果无明显差别。结论可以尝试用急性分离的成年大鼠心肌细胞为标本进行免疫荧光实验。     

耐钙心肌细胞的分离及其L型钙通道电流观察

目的：建立大鼠心肌细胞分离方法，用于膜片钳实验，并记录L型钙通道电流，方法：基于Langendorff逆行主动脉灌流模型，以经改进的心肌细胞分离技术获得单个耐钙心肌细胞，用膜片钳全细胞方式记录L型钙电流。结果：在灌流所得50％存活单个心肌细胞中约70％为耐钙心肌细胞，并记录到典型的L型钙电流，结论：这种心肌细胞分离技术能获得大量具有正常电生理特性的耐钙心肌细胞，可用于心肌细胞离子通道和信号转导机制的研究。     

成年大鼠心肌细胞的分离与培养

目的研究成年大鼠心肌细胞的分离与培养方法。方法成年SD大鼠麻醉后,迅速开胸取心连接于Langendorff装置上进行逆行灌注,用0．06％-0．1％Ⅱ型胶原酶灌注消化分离心肌细胞,采用自然沉降法纯化心肌细胞,用改良M199培养基进行细胞培养。结果本方法可获得60％～85％具有活性的成年大鼠心室肌细胞,每只SD大鼠心脏的细胞产量可达1×10^7个。结论该方法简单、有效,同时具有一定的可控性。     

基于细胞骨架差异的心肌细胞纯度快速鉴定方法

目的 寻找并确定一种优于传统且简单快速的心肌细胞鉴定方法。方法 取1～3d龄SD大鼠心脏,0.1%Ⅱ型胶原酶消化,差速贴壁分离心肌细胞与心肌成纤维细胞,对心肌细胞使用5-溴脱氧尿嘧啶进行纯化,并通过传代对心肌成纤维细胞进行纯化。采用免疫荧光法,Phalloidin固定染色和Tubulin Tracker活细胞染色鉴定心肌细胞与心肌成纤维细胞。结果 心肌细胞的微丝与微管可分别被Phalloidin和Tubulin Tracker标记,而心肌成纤维细胞的微丝和微管均未被标记,且这两种染色方法耗时极少。结论 基于细胞骨架差异的特征,通过标记微丝或者微管能够简便快速鉴别心肌细胞和心肌成纤维细胞。本方法明显优于免疫荧光染色,将提高心血管疾病在细胞水平上的研究效率。     

体外自发性搏动乳鼠原代心肌细胞的分离培养及超微结构

目的：通过对sD乳鼠体外自发性搏动的心肌细胞（CMs）分离培养,并观察其超微结构,以了解心肌干细胞的特性。方法：用体外分离、纯化培养sD乳鼠自发性搏动的心肌细胞,应用倒置显微镜及透射电镜观察其形态结构与超微结构,并进行心肌特异性标志troponinI（cTnI）的免疫细胞化学鉴定。结果：体外分离、纯化培养出心肌细胞,细胞具有自发性搏动特性,表达心肌特异性抗体TropninI。电镜下可见细胞内出现肌丝样结构及z线结构,细胞普遍存在肌小节,细胞间有闰盘连接;部分细胞表面有大量微绒毛,细胞器丰富,可见内质网、线粒体。结论：体外可分离培养扩增出自律性搏动的CMs,这些细胞表现增殖活跃,具有千细胞的增殖旺盛特性。