转hCTLA4Ig树突状细胞诱导T细胞免疫耐受的实验研究

目的　通过逆转录病毒载体将人CTLA4Ig转染DCs ,探讨转人CTLA4Ig(hCTLA4Ig)树突状细胞 (DCsRev)诱导T细胞免疫耐受的可能性。方法　通过重组逆转录病毒将目的基因hCTLA4Ig转染到大鼠骨髓来源的DCs中 ,通过流式细胞检测目的基因hCTLA4Ig表达及DCs表面分子的改变 ;通过混合淋巴细胞反应 (MLR)检测DCsRev抑制T细胞免疫反应的能力。 结果　重组逆转录病毒转染DCs的最大效率为 91 2 5 % ;在功能上 ,DCsRev不但丧失了刺激MLR的能力 ,并且能够强烈抑制MLR中反应T细胞的增殖 ,而且抑制率与加入DCsRev的数量和DCsRev预处理反应T细胞的时间长短有关。具体来说 ,DCsRev数量在 10 3 ～ 10 4之间时 ,抑制率与剂量呈正相关 ,最高为 71 96%。而当DCsRev数量达到 5× 10 4抑制率下降为 5 9 2 %。在 12～ 48h之间 ,随着预处理时间的延长 ,抑制率却不断下降 ,预处理 12h抑制率最高 ,为 99 6%。但不做预处理 ,在反应开始时同时加入DCsRev ,则抑制率明显降低 ,仅为 5 9 2 %。对腹腔注射DCsRev大鼠脾T淋巴细胞体外分析表明 ,DCsRev也能在动物体内诱导耐受 ,但这种免疫耐受状态不能维持终身。结论　通过逆转录病毒载体将人CTLA4Ig转染DCs,不但DCs表面CD86分子被CTLA4Ig有效的封闭 ,并且能够诱导抗原特异性T细胞的免疫耐受     

供体脾细胞输注增强CTLA4Ig致小鼠皮肤移植耐受的研究

目的：研究联合应用供者特异性脾细胞输注（donor-specific-spleen-cell-transfusion,DST)与CTLA4Ig对促进小鼠皮肤移植物存活的作用。探索CTLA4Ig促进移植物存活的作用机制。方法：单独或联合应用CTLA4Ig及供者特异性脾细胞输注，同时行皮肤移植，观察皮肤移植物存活时间并检测受者脾细胞对供者细胞的单向混合淋巴细胞反应。结果：联合应用供者特异性脾细胞输注及CTLA4Ig使小鼠皮肤移植物的存活时间延长，并使受者脾细胞对供者细胞的反应性特异性降低，与未处理组、单用CTLA4Ig或供者特异性脾细胞输注处理组相比有显著性差异（P＜0．01）。结论：联合应用供者特异性脾细胞输注及CTLA4Ig可促进皮肤移植物的存活。移植物中过客淋巴细胞的存在可能对CTLA4Ig诱导免疫耐受有促进作用。     

CTLA4Ig基因表达对鼠心脏移植免疫抑制作用的研究

大鼠ＤＡ和Ｌｅｗｉｓ分别作为移植的供受体。心脏移植前１周,用腺病毒作载体将ＣＴＬＡ４Ｉｇ基因导入Ｌｅｗｉｓ鼠体内,研究该基因在鼠体内的表达以及对同种心脏移植后的免疫抑制作用。以编码β－半乳糖苷酶有复制缺陷的腺病毒重组体（Ａｄｅｘ／ＬａｃＥ）为对照组。ＲＴ－ＰＣＲ法检测基因的表达,并用流式细胞仪测定ＣＴＬＡ４Ｉｇ蛋白质浓度变化。用移植物生存时间判断免疫抑制效果。结果显示：导入鼠体现人的ＣＴＬＡ４Ｉdi     

重组腺病毒介导的CTLA4Ig基因在哺乳动物体内表达的研究

目的 了解CTLA4Ig腺病毒在不同哺乳动物体内的转染能力及表达情况。方法 用所构建的CTLA4Ig腺病毒通过静脉或腹腔注射到Balb/c小鼠，Wistar大鼠，兔，小香猪，羊体内，应用蛋白质斑点印记检测CTLA4Ig在以上动物血清中的表达情况，同时还观察各动物脏器的病理改变及动物的生存情况。结果 重组腺病毒转染7d后大鼠，小鼠血清出现CTLA4Ig持续表达2周。各动物未见异常死亡，各脏器未见明显病理改变。结论 CTLA4Ig重组腺病毒能够有效转染Balb/c小鼠，Wistar大鼠。     

丙二醛对小鼠淋巴细胞的抑制作用

体内外实验观察脂质过氧化的终产物丙二醛对小鼠脾淋巴细胞活性和功能的影响，结果表明，丙二醛可明显抑制鼠自身混合淋巴细胞反应，并抑制刀豆素Ａ（ＣｏｎＡ）和细菌脂多糖，（ＬＰＳ）分别诱导的Ｔ、Ｂ淋巴细胞增殖，对Ｔ细胞作用更明显，此抑制作用发生在有丝分裂原激活淋巴细胞之后，提示：脂质过氧化产物参与了对机体淋巴细胞的损伤过程，为阐明由丙二醛造成的免疫抑制的过氧化机理提供部分实验依据。     

CTLA4Ig基因表达对鼠皮肤移植免疫抑制作用的研究

目的　探讨静脉注射CTLA4Ig腺病毒后在大鼠体内的表达和对同种异体移植皮肤存活的影响 ,以及该载体应用的安全性 ,为该基因治疗方法在抑制器官移植排斥反应的临床应用奠定基础。方法　供体SD大鼠皮肤移植前 1周 ,用腺病毒作载体将CTLA4Ig导入Wistar大鼠体内 ,用蛋白质斑点印迹实验检测血清中CTLA4Ig的表达 ,用腺病毒荧光抗体检测腺病毒在脏器的分布。同时还观测了各脏器的病理改变及移植物生存时间。结果　CTLA4Ig腺病毒在肝、脾、心、肺、肾均有明显分布 ,但实质细胞均未见严重损伤性改变。CTLA4Ig基因能在血清中的表达高峰时间一般在 7d左右 ,移植皮肤的生存显著长于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　从静脉注射导入的CTLA4Ig基因能在大鼠体内表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。     

CTLA-4 Ig融合蛋白抗小鼠同种心脏移植排斥的效果及其机制

目的：研究细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA－4,CD152）Ig融合蛋白（CTLA－4Ig)抗小鼠同种心脏移植排斥的效果及其体内作用的机制。方法：以C57BL／6小鼠为供,BALB／c小鼠为受行异位心脏移植术,分别腹腔注射CTLA4Ig[100μg/d,共15次]γ-球蛋白对照抗体及PBS,观察移植供心的存活时间;研究腹腔注射CTLA－4Ig后受体小鼠T细胞对同种抗原反应性的变化以及对T细胞亚群分化的影响。结果：同种心脏移植的小鼠腹腔注射CTLA－4Ig后,移植心脏存活时间较对照组显延长,40％移植心脏的存活时间长达2个月以上。CTLA－4Ig治疗后诱导受体小鼠T细胞对同种抗原低反应性,但对第三抗原的反应性无影响。受体血清中的Th1来源的IL－2、IFN－γ均明显低于PBS对照组,而Th2来源的IL－10的水平则明显高于对照组,IL－4未见明显的改变。结论：CTLA－4Ig治疗后可通过诱导受体小鼠T细胞对同种抗原低反应性以及受体T细胞由Th1向Th2分化,诱导供特异性免疫耐受的产生,显延长同种小鼠心脏移植存活期。     

CTLA4Ig诱导小鼠心脏移植免疫耐受的研究

目的　研究利用CTLA4Ig阻断B7/CD2 8相结合 ,诱导同种异体小鼠移植心脏免疫耐受。方法　建立同种异体小鼠移植心脏模型 ,研究组腹腔注射CTLA4Ig ,观察小鼠移植的心脏存活天数和病理改变。结果　研究组移植的心脏存活时间为 (81 0± 5 1 2 )d ,对照组为 (7 8± 1 3 )d ,两组差异有显著性 (P <0 0 5 )。组织学改变 :对照组可见大量淋巴细胞、单核细胞浸润 ,组织充血水肿 ,心肌变性、坏死 ,出血 ,病理分级为Ⅳ级。研究组术后 7d病理改变较轻 ,表现为局灶性血管周围和心肌间质炎症细胞浸润、局灶性心肌损伤 ,病理分级为Ⅰ～Ⅱ级。术后 3 0d研究组可见部分心肌变性、水肿、纤维增生 ,炎细胞浸润 ,血管管壁增厚、水肿、炎细胞外渗 ,病理分级为Ⅱ～Ⅲ级。结论　利用CTLA4Ig阻断B7/CD2 8相结合可诱导同种异体小鼠心脏移植免疫耐受。     

rhCTLA4Ig对烧伤创面异基因移植皮肤存活期的影响

目的 探讨重组CTLA4Ig蛋白延长烧伤创面异基因移植皮肤存活情况。方法 大鼠背部烧伤创面移植人断层皮肤，观察术后不同时间给予不同剂量rhCTLA4Ig对移植皮肤存活情况的影响。结果 rhCTLA4Ig能一定剂量依赖性延长大鼠烧伤创面移植人断层皮肤的存活时间，且存活时间及病理学检查均发现术后24h给药较术后立即给药效果更好。结论 重组CTLA4Ig可用于延长烧伤创面异基因移植皮肤的存活期。     

CTLA_4Ig基因表达对鼠心脏移植免疫抑制作用的研究

大鼠 DA和 L ewis分别作为移植的供受体。心脏移植前 1周 ,用腺病毒作载体将 CTL A4Ig基因导入 L ewis鼠体内 ,研究该基因在鼠体内的表达以及对同种心脏移植后的免疫抑制作用。以编码 β-半乳糖苷酶有复制缺陷的腺病毒重组体 ( Adex/L ac E)为对照组。RT-PCR法检测基因的表达 ,并用流式细胞仪测定 CTL A4Ig蛋白质浓度变化。用移植物生存时间判断免疫抑制效果。结果显示 :导入鼠体内的 CTL A4Ig基因能够在鼠的肝脏中表达 ,并使其表达产物 CTLA4Ig在血中浓度明显高于对照组 ( P<0 .0 5 )。而且移植心脏的生存时间显著长于对照组 ( P<0 .0 5 )。实验表明 CTLA4Ig基因能在鼠体内良好表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。     

腺病毒载体介导CTLA4Ig基因治疗小鼠变应性鼻炎

目的 检测CTLA4Ig-重组腺病毒载体（Ad-CTLA4Ig）在变应性鼻炎治疗中的作用。方法 采用卵清蛋白（OVA）致敏和激发诱导小鼠变应性鼻炎。实验组在OVA激发前30min予以Ad-CTA4Ig腹腔注射。未转CTLA4IgcDNA的腺病毒载体（Adv）作对照。比较各组动物鼻部症状和鼻粘膜形态学改变，并采用ELISA法测定血清中OVA－特异性IgE水平。结果 CTLA4Ig重组腺病毒实验组小鼠鼻部症状和鼻粘膜病理改变不明显，并且血清中OVA－特异性IgE水平明显低于对照组（P＜0.05）。结论 Ad-CTLA4Ig可防治小鼠应变性鼻炎的发生，提示CTLA4Ig-重组腺病毒载体有可能运用于临床变应性鼻炎的治疗。     

人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒,以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法:双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8-CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig;经酶切线性化后的pAdTrack-CTLA4Ig与AdEasy-1进行同源重组,经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果:卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAd-CTLA4Ig,PacⅠ酶切产生30 kb和4.5 kb 2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6×109).结论:成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.     

Gene therapy for allergic rhinitis with recombinant adenovirus vector containing CTLA4Ig in mice

Objective: To examine the role of recombinant adenovirus vector containing CTLA4Ig gene( Ad-CTLA4Ig) in the treatment of induced allergic rhinitis in mice. Methods: Allergic rhinitis was induced by sensitizing and challenging with ovalbumin ( OVA). Ad-CTLA4Ig was intraperitoneally injected 30 min before OVA challenge. Adenovirus vector without inserted CTLA4Ig cDNA served as the control. The symptoms and morphological changes of nasal mucosa of each group were observed, and the serum levels of IgE against OVA were detected with ELISA. Results: There were no obvious symptoms and pathological changes in Ad-CTLA4Ig treated group, in which the serum OVA-specific IgE levels were significantly lower than that in control groups (P < 0. 05). Conclusion: Ad-CTLA4Ig prevents and treats allergic rhinitis of mice, implying the possibility of the usage of Ad-CTLA4Ig against allergic rhinitis in clinic in future.     

CTLA-4Ig预防小鼠自身免疫性肝炎的实验研究

目的：研究CTLA－4Ig在防治C57BL／6小鼠自身免疫性肝炎上的作用。方法：通过用C57BL／6近交系小鼠的肝特异性抗原与弗氏完全佐剂混合物免疫攻击小鼠,同时用CTLA－4Ig治疗,观察小鼠的肝脏组织学改变。结果：随着免疫次数的增多,治疗组结果与正常对照组相似;而病理模型组发现炎细胞的浸润,肝细胞的肿胀、灶性坏死甚至广泛坏死,这与正常对照组有明显差异。结论：CTLA－4Ig能有效地预防C57BL／6小鼠自身免疫性肝炎。     

应用重组腺病毒载体制备人CTLA4Ig融合蛋白

目的在实验室水平制备并鉴定人CTLA4Ig融合蛋白.方法将人CTLA4Ig cDNA片段构入重组腺病毒载体中,用该表达载体感染293细胞并在其中表达人CTLA4Ig,再应用SPA亲合层析柱自细胞培养上清中纯化出该融合蛋白,以WESTERN印迹验证后,观察了所制备CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应的影响.结果经亲合层析柱洗下的蛋白为分子量为53.0kd的单一组分,经WESTERN印迹证实为CTLA4Ig,并发现所制备CTLA4Ig能呈剂量依赖性抑制混合淋巴细胞反应.结论本法成功制备了具有生物学活性的重组人CTLA4Ig融合蛋白.     

CTLA4Ig-重组腺病毒载体延长大鼠异基因原位移植气管存活期

目的　研究腺病毒介导的CTLA4Ig基因在大鼠异基因原位气管移植中的作用。 方法　建立异基因大鼠原位气管移植模型。分别采用腹腔注射生理盐水 (Saline组 ,2ml/只 )、腹腔注射CTLA4Ig重组腺病毒载体 (Ad CTLA4Ig组 ,2× 10 9PFU/只 )和肌肉注射环胞素A(CsA组 ,5mg/kg) ,观察术后大鼠的存活时间和移植气管的病理改变。 结果　Ad CTLA4Ig组大鼠存活时间为(2 7 3± 5 88)d ,较Saline组 (7 3± 1 63 )d和CsA组 (18 3± 1 70 )d明显延长 (P <0 0 5 )。同时 ,术后 10dAd CTLA4Ig组大鼠气管组织学改变与CsA组大鼠比较无明显差异。结论　Ad CTLA4Ig可延长大鼠异基因原位移植气管的存活时间     

腺病毒介导CTLA4Ig基因在体外培养细胞中的表达

目的 鉴定腺病毒介导免疫调节基因CTLA4Ig在体外培养细胞中的表达能力和细胞毒性。方法 以肾小管上皮细胞（PK－15），血管内皮细胞（ECV－304）为靶细胞，观察感染强度为100，200，400时CTLA4Ig重组腺病毒转梁靶细胞后不同时相细胞存活百分率；以免疫组化以及Westerb blot分别检测CTLA4Ig在细胞以及上清中的表达。结果 转染后2d,4d，转染组两种细胞存活百分率与对照组相比无显著差异；转染后24h,CTLA4Ig在PK－15和ECV－304中的阳性率表达率分别为93．7％和90．2％；Westerb blot检测到两种细胞上清中均有CTLA4Ig表达。结论 重组腺病毒对非包装靶细胞毒性很小，能够介导CTLA4Ig基因对靶细胞的高效转染，并使其表达分泌型CTLA4Ig，具备了以基因治疗诱导免疫耐受的潜能，为介导CTLA4Ig基因转染移植物和抗原提呈细胞提供了一种安全有效的载体。