EGF,bFGF单独及联合应用对原代培养的兔角膜缘干细胞增殖的影响

目的探讨EGF,bFGF及二者共同作用对培养的兔角膜缘干细胞增殖的影响。方法用DMEM和F12(1:1)培养基,20%胎牛血清,加入不同浓度EGF,bFGF和二者的混合液,采用MTT法检测细胞的OD值。结果EGF的5~160ng/mL各浓度组增殖效应均明显大于对照组(P<0.05),10ng/mL组明显大于其它各浓度组(P<0.01),bFGF各浓度组从5~80ng/mL各组均明显大于对照组(P<0.025),20ng/mL各组明显大于与其它各组(P<0.025);EGF与bFGF混合液各浓度组从5~80ng/mL各组增殖效应均明显大于对照组及单独使用EGF或bFGF组(P<0.05),EGF10ng/mL+bFGF20ng/mL组促增殖效果最强(P<0.025)。结论EGF,bFGF对培养的兔角膜缘干细胞有促增殖作用,此作用均呈剂量依赖性,EGF和bFGF共同表现为明显的促增殖作用。     

外源性基因在兔角膜缘干细胞中的表达及意义

目的 探讨外源性bFGF(fibronlast growth factor,bFGF)基因转染体外培养的兔角膜缘干细胞(human limbal stem cells,LSCs)的可行性.方法 体外培养兔LSCs并用AE5作鉴定.通过脂质体将重组质粒pEGFP-bFGF转染兔LSCs,观察转染结果 ,表达情况及对靶细胞活力的影响.结果 体外成功培养并用AE5鉴定原代免LSCs,基因转染48h后荧光显微镜下可见特异性的绿色荧光,没有发现明显的细胞毒性作用及对细胞活力的显著影响.结论 采用真核质粒可以介导外源性基因转染兔LSCs,为将来采用基因增强组织工程方法 治疗难治性眼表疾病提供初步的实验基础.     

兔角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立兔角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20％胎牛血清1640培养液对兔角膜缘干细胞进行体外培养,倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态,电镜观察培养细胞的超微结构并进行免疫细胞化学和间接免疫荧光鉴定。结果 植块48～72h细胞开始贴壁生长,7～10d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接,胞质丰富,胞质细胞器较多,含有线粒体等结构;免疫细胞化学和间接免疫荧光染色显示,培养第8天少量细胞角蛋白K3(AE5)免疫反应呈阳性,细胞质被染色,培养第14天和第21天,较多细胞．AE5免疫反应阳性。结论 含20％胎牛血清1640培养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。应用组织培养方法获得的原代培养细胞具有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。     

深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养方法。方法 将2mm宽的兔角巩膜组织通过程序降温仪降温后置于-196℃液氮中深低温保存。1年后复温，应用消化培养法分别对冻存及新鲜的兔角膜缘干细胞进行体外培养，观察并记录细胞生长情况，HE染色观察培养细胞的形态特征。结果 经过深低温保存的兔角膜缘干细胞可以在体外被成功培养并传代，其在原代培养48h后开始贴壁生长，5d后生长较旺盛，但可见部分破裂和死亡细胞，约12d基本形成单层；传代培养时次日贴壁，7d形成单层。新鲜兔角膜缘干细胞原代培养时细胞形态相似，但破碎死亡细胞少见，且于7d左右即基本形成单层，传代时两者无明显差别。结论 深低温保存的角膜缘干细胞能被成功地进行体外培养，培养后细胞具有与培养的新鲜角膜缘干细胞基本相似的特性，为深低温保存的角膜缘干细胞培养后移植治疗临床眼表疾病提供了实验依据，并为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径。     

角膜缘干细胞分布变化对角膜曲率的影响

目的　研究上下方角膜缘上皮非对称性损害对角膜曲率的影响。方法　将兔的 11 1点方位的角膜缘上皮保留 ,其他方位角膜缘在外围保留 0 2mm宽的上皮带 ,其余上皮全部刮除 ,造成角膜上下方干细胞储备的差异。采取角膜地形图测量、组织学等方法观察角膜形态变化。结果　角膜中央区出现锥形凸起 ,锥形凸起处屈光值 (5 7 2 5± 2 73屈光度 )比术前角膜对应点屈光值 (5 2 2 3± 1.91屈光度 )明显增大 ,差异有显著意义 (P <0 0 1) ,组织学观察角膜锥形凸起处有代偿性增生的上皮细胞团。结论　角膜中央代偿性上皮增生可以显著地改变角膜曲率 ,角膜缘干细胞的分布异常是造成角膜中央上皮代偿性增生的原因之一。     

兔角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察

目的 探讨兔角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法 采用消化培养法，分2组培养，1组为消化并过滤后的角膜缘干细胞培养组，另1组为消化后未过滤的带组织块培养组，均用含20％胎牛血清的培养液培养，待细胞长成良好单层后消化传代，分别观察记录细胞在原代和传代培养时的生长特性并行HE染色观察。结果 过滤组角膜缘干细胞在培养24h后开始贴壁生长，7～10d形成良好单层，细胞以圆形或椭圆形为主，核较大，呈原始细胞特征，传代培养时见细胞体积逐渐增大，核变小，成纤维细胞少见；带组织块培养组原代培养时与过滤组无明显差异，传代时则见成纤维细胞渐增多，至第3代时占主导并抑制了角膜缘干细胞的生长。结论 采用消化培养法可成功培养出兔角膜缘干细胞，培养时应滤除组织块以减少成纤维细胞的影响。     

兔角膜缘干细胞的形态学研究

目的 探讨兔角膜缘干细胞(1imbal stem cells,LSCs)的形态学特征、数量及分布.方法 健康成年新西兰大耳兔30只,体质量2.0～2.5 kg,雌雄不分,取双侧眼球,常规石蜡切片,HE染色及免疫组化p63染色显示角膜缘一般特征及LSCs的分布,并用BioMias图像分析软件对LSCs进行计数.另外取3只兔眼角膜缘制作超薄切片,透射电镜观察.结果 ①角膜缘上皮细胞排列紧密,层数较多,基底层细胞呈矮柱状或立方形,核大而圆,位于细胞中央,着色较深.LSCs(p63阳性细胞)呈矮柱状或立方形,多位于角膜缘上皮基底层,在角膜缘浅层及角膜边缘有少量分布,在角膜中央上皮未见LSCs出现.②透射电镜观察LSCs核较大,形状不规则,核内常染色质较多,异染色质散在分布,未凝集成块.细胞质少,含较丰富的游离核糖体,其他细胞器少,细胞间可见较多的缝隙连接.③图像分析显示高倍镜视野下角膜缘上皮LSCs数量为(35.25±8.93)个.结论 ①LSCs具有原始细胞的超微结构特征,与其他干细胞形态相似.②LSCs主要位于角膜缘上皮基底层,在角膜缘浅层上皮及角膜边缘上皮内也有少量LSCs存在,在中央角膜上皮未见LSCs分布.     

兔角膜缘干细胞的体外培养、鉴定及形态学特点

目的 体外培养兔角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),观察其生物学特性.方法 用含20%胎牛血清DMEM:F12(1:1)培养基对兔LSCs进行体外培养,倒置显微镜及HE染色观察培养细胞体外生长的形态,免疫细胞化学AE5和P63染色鉴定并进行图像分析,透射电镜观察超微结构特点.结果 培养2～3 d细胞从组织块游出,6～8 d形成良好的单层,细胞多呈圆形或卵圆形.电镜观察,培养7 d LSCs呈卵圆形,表面有少量微绒毛突起;胞质内细胞器少,核大,核仁明显,核浆比例大,部分细胞可见双核现象.免疫组化观察,培养第7天,大量细胞AE5免疫反应染色呈阴性,阳性细胞数量较少,大量细胞P63免疫反应染色呈阳性;培养第14天,AE5阳性细胞数明显增多,免疫反应染色增强,阳性细胞的平均灰度值显著降低(7 d:184.30±9.85,14 d:133.36±25.00,P<0.01).P63免疫反应阳性细胞数第14天与第7天相比明显减少,而阳性细胞的平均灰度值显著增高(7 d:108.13±17.96,14 d:177.59±7.86,P<0.01).结论 应用组织培养方法获得的原始细胞具有与体内正常LSCs相一致的形态特征;培养第7天为LSCs生长的峰值期.     

去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的实验研究

目的探讨去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的可行性。方法取小块兔角膜缘组织,采用组织块 细胞悬液共培养,待细胞长至对数生长期,分别传代于去上皮羊膜和完整羊膜,甲基偶氮蓝比色(MTT)法对比两组细胞增殖率,并行AE_5免疫鉴定。结果原代细胞接种7d左右,生长至对数生长期,细胞融合成单层。去上皮羊膜组细胞传代培养效果明显优于完整羊膜组。AE_5单克隆抗体染色强阳性。结论去上皮羊膜上培养出的兔角膜缘组织既有角膜上皮特性,又具有强的增殖潜力。     

表皮生长因子与碱性成纤维生长因子对人牙髓干细胞增殖的影响

目的：探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)增殖能力的影响。方法：采用噻唑蓝（MTT）比色法分别测定不同浓度EGF和bFGF在不同时间,单独或联合应用对hDPSCs增殖能力的影响。结果：50 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF促hDPSCs增殖能力最强。以50ng/ml EGF、20ng/ml bFGF单独或联合作用,其促hDPSCs增殖能力均具有时间依赖性,第3 d、5 d、7 d, EGF、bFGF促hDPSCs增殖作用显著增强,二种生长因子联合作用,促增殖作用显著高于其单独作用效果,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：生长因子EGF和bFGF最大效应浓度分别为：50 ng/ml、20 ng/ml。EGF和bFGF单独作用均能显著促进hDPSCs的增殖,二者联合作用对hDPSCs的增殖有一定的协同作用。     

EGF、bFGF对兔自体穿透角膜移植伤口愈合的影响

目的 观察表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对自体家兔穿透性角膜移植（PKP）术后伤口愈合的影响。方法 利用家兔自体穿透性角膜移植模型,采用测量伤口愈合强度、液闪计数、AgNORs染色、VG染色和电镜等方法,观察家兔PKP术后伤口愈合情况。结果 （1）EGF、bFGF、EGF bFGF点眼均能增加伤口所能承受的极限压力和∧3H-TdR的掺入率。（2）bFGF和EGF bFGF点眼能刺激伤口处成纤维细胞及其所分泌的胶原纤维呈比较规则的排列。结论 （1）EGF、bFGF、EGF bFGF点眼均能增加PKP术后伤口愈合的强度,增加伤口愈合时DNA的合成。（2）术后14d以后EGF和bFGF联合点眼对伤口愈合的促进作用仅相当于单独用bFGF点眼的水平。（3）bFGF能提高PKP术后伤口愈合的质量。     

EGF与bFGF对体外大鼠巩膜成纤维细胞增殖的影响

目的研究表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维生长因子（bFGF）在体外对大鼠巩膜成纤维细胞生长的影响。为进一步了解近视发生的分子机制提供依据。方法采用植块法培养大鼠巩膜成纤维细胞。细胞经传代纯化鉴定后,取第3～4代细胞加入不同浓度的EGF（0．1～200ng／mL）、bFGF（0．1～50ng／mL）。分别培养24、48、72h用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞的增殖密度。观察不同浓度、时间下细胞增殖情况。结果发现0．1～100ng／mL的EGF和0．1～50ng／mL的bFGF对大鼠巩膜成纤维细胞均有明显的促增殖作用,且呈剂量相关性。结论一定浓度的EGF、bFGF对体外培养的大鼠巩膜成纤维细胞的生长具有促进作用。     

应用bFGF与EGF促进皮肤扩张的临床研究

目的:探索碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)在扩张术中的临床应用方法与效果.方法:27例患者共埋置62个扩张器,随机分为治疗组和对照组,采用自身对照.治疗组在常规扩张的同时于扩张器周围注入bFGF与EGF,对照组仅常规扩张.测量两组扩张率、即时回缩率并进行统计学处理.结果:治疗组的扩张至额定容量的时间、即时回缩率较对照组减少(P＜0.05),扩张率较对照组明显增加(P＜0.01).结论:bFGF与EGF能够促进扩张,降低皮瓣回缩率,提高皮瓣质量,改善治疗效果.     

孵育鸡蛋膜对深Ⅱ度烧伤创面bFGF、EGF表达的影响及意义

目的:研究孵育鸡蛋膜对大鼠深Ⅱ度烧伤创面碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)、上皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)表达的影响及意义.方法:以鸡蛋膜、暴露处理为孵育鸡蛋膜对照,测定伤后7、14、21 d创面愈合率、创面羟脯氨酸含量、EGF和bFGF表达量.结果:孵育鸡蛋膜在各时间点愈合率高于暴露组,伤后7 d EGF,bFGF表达高于对照组.结论:孵育鸡蛋膜对深Ⅱ度烧伤创面愈合有促进作用,其促愈机理与覆盖孵育鸡蛋膜后创面EGF,bFGF表达增高相关.     

生长因子(EGF和PDGF-BB)对小鼠骨髓基质干细胞增殖的作用及其意义

目的探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和血小板源生长因子(platet-derived growth factor,PDGF-BB)对体外培养的小鼠骨髓基质干细胞(murine bone marrow stromal stem cells,mMSCs)增殖的作用,探索小鼠骨髓基质干细胞体外快速增殖的条件和方法.方法将小鼠骨髓基质干细胞进行分离和纯化培养后,加入EGF和PDGF-BB,利用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入反映细胞增殖效果,倒置显微镜下观察细胞增殖及分化状态.结果EGF和PDGF-BB干预后,3H-TdR掺入(11456.14±968.86)dpm较对照组(3271.88±420.91)dpm明显增高,说明EGF和PDGF-BB可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖;倒置显微镜下观察可见EGF和PDGF-BB处理组mMSCs具有增殖优势,分化相对延迟,而对照组提前显示出自然分化现象.结论生长因子(EGF和PDGF-BB)可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖,是小鼠骨髓基质干细胞体外大量培养和快速增殖的有效刺激因子.     

兔自体血清与胎牛血清培养兔角膜缘细胞的比较性研究

目的：探讨自体血清与来源于同一个体的组织培养之间的关系及比较兔自体血清与胎牛血清培养兔角膜缘细胞的不同。方法：采用组织块培养法,分别采用兔自体血清及胎牛血清培养兔角膜缘细胞。结果：兔血清培养72h,细胞从组织边缘流出,第8天,膜布满整个孔底,第10天细胞呈空泡样,第14天,膜化解;胎牛血清培养48小时,细胞从组织边缘游出,第8天,膜布满整个孔底,第11天细胞呈空泡样,第16天,膜化解。结论：从形态学上观察,兔自体血清和胎牛血清培养的兔角膜缘细胞无明显差别,兔自体血清可用于兔角膜缘细胞的培养。     

自体角膜缘干细胞培养移植研究进展

随着角膜缘干细胞概念的确立，临床和实验证实角膜上皮干细胞位于角膜缘，角膜上皮病变是由于角膜缘干细胞功能缺陷或数量不足而引起。解决这些角膜疾病的根本方法是采取含有角膜缘干细胞的组织移植术。目前认为最有前途的治疗方法应是自体角膜缘干细胞培养后自体移植。作就这一方面的研究进展做一综述。