肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

背景：对于诱导骨髓间充质干细胞成肝细胞样细胞的研究,在大鼠及小鼠及人类中已有相关报道。甲胎蛋白和白蛋白均为肝细胞系较为特异的标志。 目的：进一步验证肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用。 方法：采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离培养人骨髓间充质干细胞,以含20 μg/L 肝细胞生长因子和10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子的低糖DMEM培养基诱导培养,对照组取同代细胞,常规培养液培养。诱导培养7,14,21和28 d采用免疫组织化学方法检测甲胎蛋白和白蛋白的表达及RT-PCR技术检测白蛋白 mRNA表达。 结果与结论：诱导组骨髓间充质干细胞呈类上皮样细胞。诱导组在培养7 d时,甲胎蛋白表达阳性率为81.5%,随着培养时间延长,甲胎蛋白阳性表达率逐渐减弱,而白蛋白阳性表达率及白蛋白mRNA表达逐渐增强,至培养28 d,白蛋白阳性表达率达91.2%,对照组细胞均无白蛋白、白蛋白mRNA及甲胎蛋白表达。结果证实,肝细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白。     

酒精性肝硬化患者血清诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为肝细胞样细胞

背景：肝脏损伤后机体能够分泌一系列细胞因子和化学增活素,重型肝病患者血清中肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等具有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。 目的：探讨在酒精性肝硬化患者血清诱导条件下,人骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞的定向分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-07/2007-07在吉林省肝胆病医院科研室完成。 材料：创伤患者术后废弃肋骨,由吉林省人民医院胸外科提供。实验血清来源于吉林省肝胆病医院住院的1例40岁男性酒精性肝硬化患者。 方法：冲洗骨髓腔,采用密度梯度离心、贴壁培养法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,接近融合时按1:4传代扩增。取第3代人骨髓间充质干细胞,按1×107 L-1密度接种,设立2组：诱导组加入含体积分数为0.2酒精性肝硬化患者血清的L-DMEM培养基,对照组仅加入常规L-DMEM培养基。 主要观察指标：相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫组化法检测甲胎蛋白和白蛋白的表达。 结果：诱导组骨髓间充质干细胞在含体积分数为0.2酒精性肝硬化患者血清的L-DMEM培养基中生长状态良好,呈类上皮样细胞形态;对照组细胞未发生形态学改变,呈成纤维细胞样。培养7 d时,诱导组大部分细胞呈甲胎蛋白阳性,随培养时间延长甲胎蛋白表达减弱,而白蛋白阳性表达情况完全相反,呈逐渐增强趋势;整个培养过程对照组细胞始终未出现甲胎蛋白及白蛋白表达。 结论：密度梯度离心和贴壁培养法相结合可在体外分离获得纯度较高的人骨髓间充质干细胞,酒精性肝硬化患者血清能够诱导人骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白及白蛋白,向肝细胞样细胞分化。     

不同浓度肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化******

背景：研究证实在多种微环境下可以将骨髓间充质干细胞诱导分化为成熟肝细胞,但诱导条件及诱导分化率尚无定论,选择合适的诱导剂及诱导剂浓度尤为重要。 目的：观察肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的最适浓度。 方法：不同浓度肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子联合诱导培养原代兔骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,并检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白、白蛋白表达及肝细胞合成功能。 结果与结论：随诱导时间延长,可观察到多极性的肝细胞样细胞。7 d时甲胎蛋白表达阳性,14 d达最大值后即开始下降(P < 0.05),此后各浓度组间表达无差别(P > 0.05)。14 d时白蛋白表达阳性,随时间延长,阳性细胞数递增(P < 0.05),且细胞生长因子浓度越高,阳性细胞数越高(P < 0.05)。诱导早期(9~15 d) 白蛋白上清液中白蛋白水平与诱导剂浓度成正比(P < 0.05)。18 d或21 d达高峰后下降,此时各浓度组间含量无差别(P > 0.05)。结果显示高浓度的肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子可提高骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化率,诱导剂最适浓度为肝细胞生长因子60 μg/L、表皮细胞生长因子4.5 mg/L。     

大鼠骨髓来源肝干细胞的成瘤性*★

背景：通过动员自身或移植外来的骨髓来源肝干细胞可促进肝再生，但是，在大规模临床应用前，其安全性需要进一步研究。 目的：采用含体积分数5%淤胆血清的培养基诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化，将这些骨髓来源肝干细胞接种到裸鼠体内，观察其是否具有成瘤性。 方法：用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞；以免疫荧光法检测白蛋白、甲胎蛋白及细胞角皮素18在诱导后细胞的表达；以糖原染色及尿素合成检测细胞功能。 将培养14 d的大鼠骨髓来源肝干细胞接种于裸鼠皮下，观察局部有无新生物形成。 结果与结论：用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞，4 d后出现细胞集落，细胞为圆形；7 d后集落变大，其周围开始出现多角形细胞；培养14 d后可见细胞呈多角形和排列成铺路石样，免疫荧光染色发现这些细胞表达角皮素18、甲胎蛋白和白蛋白，糖原染色显示细胞内有糖原颗粒；培养第12~15天的培养液中尿素氮浓度逐渐升高。经诱导的大鼠骨髓来源的肝干细胞接种到裸鼠皮下，30 d后局部未见新生物形成，组织结构未见异常。结果提示用体积分数5%淤胆血清培养基诱导的大鼠骨髓源性肝干细胞可能无成瘤性。     

三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化**

背景：间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要。 目的：以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成。 材料：Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供。 方法：采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组：空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 µg/L成纤维生长因子、8 µg/L肝细胞生长因子、8 µg/L表皮生长因子。 主要观察指标：倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平。 结果：联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形。联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞;诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降。上述各指标空白对照组细胞均呈阴性。 结论：成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化：肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用*

背景：研究证实人骨髓间充质干细胞能够诱导分化为肝样细胞,但其具体生物学特性及分化机制尚不清楚,且诱导分化培养体系尚不成熟。 目的：探讨肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性。 方法：取食管癌手术患者肋骨,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法获取人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子的表达。取第3代人骨髓间充质干细胞,分为4组,肝细胞生长因子组加入20 μg/L肝细胞生长因子,表皮细胞生长因子组加入20 μg/L表皮细胞生长因子,联合组同时加入上述两种生长因子,空白对照组不加任何生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态的变化,诱导7,14 d RT-PCR检测甲胎蛋白与白蛋白mRNA的表达。 结果与结论：人骨髓间质干细胞不表达造血细胞标志CD34,CD45,强表达β1-整合素CD29和基质受体CD44。肝细胞生长因子组、表皮细胞生长因子组、联合组诱导后,细胞形态由长梭形变为类圆形或多角形,诱导第7,14天甲胎蛋白、白蛋白 mRNA均呈阳性表达;空白对照组未见多角形细胞,甲胎蛋白、白蛋白 mRNA均呈阴性表达。证明肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子以及二者联合均具有诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力,至于二者联合是否能增强其分化能力尚待进一步免疫细胞化学染色定量分析予以验证。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞***

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。 目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。 结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：提供肝细胞生长因子的微环境可体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞。 目的：实验拟验证并简化成年大鼠骨髓间充质干细胞体外向肝细胞的诱导分化。 设计、时间及地点：观察实验，于2006-10/2008-05在北华大学完成。 材料：实验动物为成年SD大鼠，雌雄不限，体质量180~230 g。 方法：采用Percoll梯度离心方法获取骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为1×108 L-1,加入含有20 μg/L肝细胞生长因子培养液培养，定期更换培养液。 主要观察指标：流式细胞仪检测细胞表面标志和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型。倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。培养的1，3，7， 14， 21， 28 d以细胞免疫组织化学检测细胞甲胎蛋白、细胞角蛋白18和清蛋白的表达。 结果：接种后，细胞体积增大，形态多样贴壁细胞分化为体积较大的多角形和部分梭形，胞浆丰富，可见多核，接种早期细胞生长比接种晚期生长较快。分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞的表面标志为CD29+，CD44+，CD34-，CD45-和CD90+，细胞的碱性磷酸酶染色阴性，细胞纯度达98%以上。骨髓间充质干细胞的甲胎蛋白细胞免疫组织化学染色培养第7天即出现阳性，第14天清蛋白和细胞角蛋白18免疫组织化学染色阳性。 结论：成年大鼠骨髓间充质干细胞在20 μg/L肝细胞生长因子的诱导下，可分化为肝细胞。     

心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

背景：骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存在怎样的影响？ 目的：观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用。 设计、时间及地点：对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。 材料：体质量50~80 g 三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200~300 g 6~8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型。 方法: 采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用。取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组。 主要观察指标：大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平。 结果：大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后,部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞呈节律性跳动,呈心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性。对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变,其心肌肌钙蛋白为阴性, GATA-4、结蛋白呈弱阳性。 结论：单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟。     

肝纤维化大鼠血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：近年来临床运用骨髓间充质干细胞移植治疗晚期肝纤维化取得了较好疗效,但由于肝源稀少,骨髓干细胞体外分化为成熟肝细胞的技术仍然不成熟。 目的：探讨骨髓间充质干细胞体外诱导其分化为肝细胞的可行性。 方法：构建大鼠肝纤维化模型,分离、纯化并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,制备正常及肝纤维化大鼠血清,取第3代骨髓间充质干细胞分组培养,分别加入以下培养基：DMEM+体积分数10%胎牛血清;肝细胞生长培养基(HGM)+体积分数5%胎牛血清;HGM+5%正常大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清+25 μg肝细胞生长因子。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用Realtime-PCR检测甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白水平,ELISA法检测培养上清液中转化生长因子β1表达。 结果与结论：正常大鼠血清能促进骨髓间充质干细胞的增殖;肝纤维化大鼠血清对骨髓间充质干细胞促增殖作用最好,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用肝细胞生长培养基能提高分化率。     

甲状腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞分化为少突胶质细胞的影响

背景：如何为脱髓鞘疾病的细胞替代治疗提供丰富的少突胶质细胞来源是急需解决的问题。 目的：实验拟采用表皮生长因子及碱性成纤维细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞方向分化,撤退细胞因子后,用甲状腺激素诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2007-08/12在泸州医学院神经生物学研究室完成。 材料：普通级SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的培养。 方法：采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,传至第4代,用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、N2辅助因子、甲状腺激素T3的DMEM/F12诱导液诱导向神经干细胞分化。诱导后4 d,更换成含胎牛血清、甲状腺激素T3的DMEM/F12分化液,诱导向少突胶质细胞分化。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：原代细胞接种3 d后多数贴壁,传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强。诱导液处理第4天,圆形细胞聚集成簇。换成分化液后,细胞伸出树枝状细长突起,交织成网,形成少突胶质细胞样细胞。骨髓源性细胞簇表达巢蛋白阳性,示神经干细胞;从细胞簇分化的细胞,多数细胞表达半乳糖脑苷脂,部分细胞表达髓鞘碱性蛋白,示少突胶质细胞,少数细胞表达微管相关蛋白2阳性,示神经元。 结论：甲状腺激素在体外可诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。     

黄芪诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景：课题组以往的研究证实黄芪对体外培养的人表皮体外扩展生长和表皮干细胞增殖均具有促进作用，但它对人骨髓间充质干细胞的体外作用如何特别是是否具有诱导骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的效应，仍不清楚。 目的：观察黄芪体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察，于2006-09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成。 材料：骨髓来源于临床骨髓穿刺检查正常患者，无血液系统疾病和家族遗传病史。 方法：用密度梯度离心结合贴壁法分离纯化培养人骨髓间充质干细胞，以含黄芪、胎牛血清、角质细胞无血清培养基组成的诱导培养液进行体外培养，以不含黄芪的上述培养液作为对照。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态学变化，免疫细胞化学染色法检测p63和广谱细胞角蛋白的表达。 结果：经黄芪诱导后部分细胞由长梭形转变为扁园形，呈表皮样细胞形态特征；免疫细胞化学染色显示部分诱导细胞p63、广谱细胞角蛋白表达均呈阳性。 结论：黄芪可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞诱导分化潜力的比较研究

目的 比较骨髓源基质干细胞(BMSCs)和脂肪源间充质干细胞(ADSCs)向神经元样细胞诱导分化的潜力. 方法 体外分离培养来自成年SD大鼠的BMSCs和ADSCs,传至第5代时加入表皮生长因子(EGF,10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20ng/mL),诱导6 h、12 h、24h、72 h、1周、2周后,用免疫荧光染色和Westernblot检测两种细胞的神经细胞特异性标志(巢蛋白和β.微管蛋白Ⅲ)的表达,并做统计学分析. 结果 BMSCs和ADSCs经诱导后,细胞形态发生变化,均表达神经细胞特异性标志.免疫荧光染色结果显示诱导后各时间点BMSCs和ADSCsnstin阳性率或β.tubulin Ⅲ阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05),且诱导后ADSCs表达nestin阳性细胞或β.tubulinⅢ的能力在各个时间点都比诱导后BMSCs强.说明诱导后的ADSCs向神经元样细胞方向分化的能力更强.Western blot结果也与免疫荧光染色结果类似. 结论 两种不同来源的干细胞在分化成神经元样细胞方面的能力不同.ADSCs比BMSCs具有相对更强的神经元样细胞分化能力.     

骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后BMP4基因差异表达的初步研究

目的初步探讨骨髓基质干细胞（BMSC）向神经元样细胞分化前后骨形态发生蛋白4（BMP4）基因的表达变化情况。方法体外培养大鼠BMSC,用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对其进行诱导,分别于诱导前和诱导后第7天行基因芯片检测BMP4基因表达水平,并采用实时定量PCR进行验证。结果在BMSC向神经元样细胞诱导分化后的芯片表达谱中,BMP4基因的表达明显上调,且实时定量PCR亦证实此结果。结论在BMSC向神经元样细胞的分化过程中,BMP4基因可能发挥着重要的作用。     

体外诱导获得雪旺细胞的可靠性研究

目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)在体外条件下向周围神经雪旰细胞(SCs)分化的可靠性. 方法 分离提取SD大鼠股骨和胫骨部位BMSCs.利用其贴壁生长的特性.培养纯化,传代扩增.用复合诱导因子(β.巯基乙醇+全反式维甲酸+血小板凝集抑制剂+m小板源性生长因子+碱性成纤维细胞生长因子)在体外诱导BMSCs分化.免疫细胞化学方法 检测P75、S-100及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,荧光实时定量PCR检测P75、S100及CD104的表达. 结果诱导后的BMSCs形态类似SCs,免疫荧光染色鉴定其具有SCs性质,表达SCs的表面标志物(GFAP、S100和P75).荧光实时定量PCR结果显示诱导后BMSCs S-100、CD104的表达量达到了SCs的表达量水平,但P75的表达量与SCs的表达量水平还有较大差距. 结论 体外诱导BMSCs可部分获得SCs的特征,传代后恢复至未诱导状态,这种预诱导加复合因子诱导的方法 尚待完善.     

成鼠骨髓基质细胞分化为神经元的体外研究

目的 :通过一定的培养条件 ,使骨髓基质细胞 (BMSC)分化为神经元和胶质细胞。方法 :以含有 EGF、b FGF的培养液培养 BMSC,经传代、换液去除杂质细胞 ,撤掉 EGF、 b FGF并加胶质细胞条件培养液及 BDNF,待细胞分化后进行形态学观察及 NSE、 GFAP染色。结果 :撤掉 EGF、 b FGF并加 BDNF,胶质细胞条件培养液后 2天可见分化细胞 ,NSE阳性细胞占细胞总数的 38.47± 3.2 7% ,GFAP阳性细胞占细胞总数的 5 0 .73± 3.2 6 % ,GFAP阳性细胞占细胞总数的 5 0 .73± 4.6 5 %。结论 :本实验通过 EGF、 b FGF及适宜的培养液成功对骨髓基质细胞进行定向 ,使其转化为神经干细胞并最终诱导其分化为神经元和胶质细胞