家族性糖尿病人群中线粒体基因点突变的分析研究

目的 研究线粒体基因11个已知突变或变异在中国家族性糖尿病人群中的确切发生率及其与糖尿病的相关性.方法 应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态结合直接测序方法 对随机抽取的无亲缘关系的770个糖尿病家系的先证者及309名非糖尿病对照者进行线粒体基因tRNALeu(3243,3256),tRNASer(12258),tRNAGlu(14709),tRNALys(8296,8344.8363),NDI(3316,3394,3426),ND4(12026)区11个已知位点突变或变异的筛查.结果 糖尿病先证者组中发现13例tRNALeu3243 A→G突变(1.69%),9例tRNAGlu14709 T→C变异(1.17%),17例ND1 3316 G→A变异(2.21%),18例ND13394 T→C变异(2.34%),28例ND412026 A→G变异(3.63%);在正常对照组中发现5例14709 T→C变异(1.62%),5例3316 G→A变异(1.62%)和6例3394 T→C变异(1.94%),9例12026 A→G变异(2.91%),未见到3243 A→G突变携带者.在两组中均未见到tRNALeu3256C→T,tRNALys 8296A→G,tRNALys8344A→G,tRNALys 8363G→A,tRNASer 12258C→A和ND1 3426 A→G突变.分别比较14709,3316,3394,12026位点变异在糖尿病先证者组和对照组的发生率以及临床资料,差异无统计学意义.在糖尿病先证者组中尚见到同时伴有两个位点改变的情况,其中3243 A→G突变和3394 T→C变异者2例,3243 A→G突变和12026 A→G变异2例.结论 线粒体基因tRNALeu(UUR) 3243 A→G突变是中国人线粒体糖尿病的主要致病基因,14709,3316,3394,12026位点变异可能是中国人线粒体基因多态,中国人群中未见到tRNALeu 3256C→T,tRNALys 8296A→G,tRNALys 8344A→G,tRNALys 8363G→A,tRNASer 12258C→A和ND1 3426 A→G突变,它们可能不是中国人线粒体糖尿病的致病基因.     

早发糖尿病线粒体基因突变的研究

目的研究天津地区早发糖尿病(发病年龄≤45岁)中线粒体基因突变的发生率及其相关性。方法随机选取无血缘关系、发病年龄≤45岁的糖尿病患者348例;对照组207名,收集相应临床资料,提取外周血基因组DNA,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性及克隆技术检测线粒体基因点突变。结果糖尿病组线粒体基因点突变总的发生率为8.3%,明显高于对照组(3.3%)(P<0.05),其中17例ND412026A→G突变(4.9%);10例ND1点突变(2.9%),其中包括4例3316G→A突变(1.2%),5例3394T→C突变(1.4%),1例3426A→G突变(0.3%);2例3243A→G突变,检出率为0.6%。在对照组中发现4例12026A→G(1.9%);2例3394T→C突变(0.9%);1例G3316G→A突变(0.5%);未发现3243A→G突变和3426A→G突变。结论天津地区早发糖尿病患者存在多种线粒体基因点突变。     

中国人早发及多发糖尿病家系中HNF4A基因突变的筛查

目的探讨中国上海及周边地区早发及（或）多发糖尿病家系肝细胞核因子如基因（hepatocyte nuclear faetor-4α，HNF4A）的突变及变异发生情况。方法用PER-单链构象多态及序列分析的方法对154例早发及（或）多发糖尿病家系先证者进行HNF4A基因扫查。对发现的突变或变异采用PCR-限制性片段长度多态性方法在家系其他成员及93名正常对照者中进一步检测。结果在2例糖尿病家系先证者中发现2个同义突变，即N153N和A158A。其中N153N在1个早发性糖尿病家系中见到，且与糖尿病共分离。上述同义突变在正常者中未查到。此外，还发现3个变异位点：即IVS1＋308（A→G）（rs2071197），IVS1＋357（A→T）（rs2071198），IVS1-5（C→T）（rs745975）。3个位点基因型和等位基因频率在糖尿病先证者和正常对照者中无品著差别．结论HNF4A基因突变在中国人早发及（或）多发糖尿病家系中可能罕见。     

线粒体DNA变异与2型糖尿病易感性的关联研究

目的研究湖北地区2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）中线粒体基因突变的发生率及其相关性。方法采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性及DNA测序技术，对184例2型糖尿病患者和210名糖耐量正常的健康对照进行检测，并用mfold和tRNAscan-SE软件对检出的突变位点进行二级结构分析。结果MIND1 3316（G→A）、MIND1 3394（T→C）、D环区16189（T→C）变异率分别为3．26％、2．72％、36．9％，并首次在T2DM中发现4例MTTE14693（A→G）突变（2．17％）；对照组检出3316（G→A）突变2例（0．99％）、16189（T→C）变异56例（26．6％），朱检出3394、14693的点突变；两组间3394（T→C）、14693（A→G）、16189（T→C）变异率差别均有统计学意义（P〈0．05）；且T2DM组中16189（T→C）变异阳性者的胰岛素抵抗指数（HOMA→IR）值较16189（T→C）变异阴性组升高，差异有统计学意义（P=0．028）：多元回归分析显示该变异为参与HOMA→IR的独立变量（R2=0．043，P=0．037）。RNA二级结构预测发现，3394（T→C）和14693（A→G）突变使其相应的二级结构发生变化。结论3394（T→C）、14693（A→G）突变与T2DM的易感性有一定关联，16189（T→C）变异与湖北地区汉族人T2DM胰岛素抵抗相关。     

线粒体DNA 3243、3316点突变与2型糖尿病

目的研究2型糖尿病患者中线粒体tRNA^Leu(UUR)基因3243A／G突变和NADH脱氢酶亚单位1基因(ND1)基因3316G／A突变的发生频率及其与2型糖尿病的相关性。方法应用聚合酶链反应及限制性片段长度多态性技术检测225例中国云南2型糖尿病患者和195名无糖尿病家族史的健康对照者有无3243A／G突变和3316G／A突变，并经DNA直接测序确证。结果2型糖尿病患者中3316G／A突变者5例(2．22％)，195例对照者中突变者2例(1．03％)，突变发生率在两组间差异无统计学意义(P=0．4576)；两组中无线粒体3243A／G突变。结论线粒体tRNA^Leu(UUR)基因3243A／G突变在中国云南2型糖尿病人群中发生频率低，可能不是云南人群中2型糖尿病的常见病因。线粒体ND1基因3316G／A突变可能仅为人群中线粒体基因组的正常多态。其他的遗传、环境及子宫内因素需要进一步研究。     

中国人早发性糖尿病GCK基因突变的筛查

目的了解葡萄糖激酶（glucokinase）基因GCK突变和序列变异在中国人早发性糖尿病人群中的发生情况。方法应用直接测序方法对174名无亲缘关系中国人（其中80名为非糖尿病对照组，94例为早发性糖尿病家系先证者）进行GCK基因启动子区、10个外显子及其侧翼内含子区筛查。结果未在编码区发现突变，但发现几种先前已经报道的序列变异：外显子1a的5’非翻译区，位于翻译起始点上游84bp处GGCGG→GGGGG（糖尿病组G等位基因频率0．106比对照组0．075，P=0．355）；IVS1b＋12（A→T）（糖尿病组T等位基因频率0．005而在对照组未发现该变异）；IVS5＋29（G→T）（糖尿病组T等位基因频率0．027比对照组0．019，P=0．731）；IVS9＋8（T→C）（糖尿病组C等位基因频率0．585比对照组0．694，P=0．044）。此外，还发现1个未被报道的新的序列变异IVS9＋49（G→A）（糖尿病组A等位基因频率0．011比对照组0．006，P=1．000）。未发现外显子1a的5’非翻译区，-84bp处（C→G）、IVS 5＋29（G→T）、IVS9＋8（T→C）和IVS9＋49（G→A）变异与血糖、胰岛素、C-肽及空腹血脂谱等临床变量相关。结论GCK基因突变不是中国人早发性糖尿病发病的主要原因。     

线粒体糖尿病家系基因突变的遗传学筛查

目的 探索与糖尿病发病相关的线粒体基因突变位点。方法 采用PCR、DNA直接测序技术对28个临床疑似线粒体基因突变糖尿病家系(mitochondrial diabetes mellitus，MDM)进行线粒体基因突变高发区域(tRNA^Leu(UUR)基因及NADH脱氢酶1基因)的筛查。结果 两个家系发现与糖尿病发病有关的突变位点。其中1个家系(16号)同时携带nt3243A→G突变和16S rRNA3205C→T突变。该家系两例患者均有消瘦、耳聋、β细胞功能低下、发病年龄低的特点，先证者血乳酸水平在正常高限。在另1先证者患耳聋的家系(28号)发现NDl基因3434A→G突变，导致氨基酸改变，与家系中糖尿病呈共同分离。上述突变均未在正常人中检测到。结论 3243位点突变在本组家系中的发现率为3．08％。16S rRNA3205C→T突变可能与糖尿病发病有关或与nt3243A→G突变协同作用。NDl基因3434A→G突变与28号家系糖尿病的发生有关。     

母系遗传糖尿病中线粒体tRNA^leu（UUR）基因突变的研究

为了解线粒体ｔＲＮＡｌｅｕ（ＵＵＲ）基因ｎｔ３２４３Ａ→Ｇ突变在中国人家族性糖尿病中的发生率及该类糖尿病的临床特征，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合限制性内切酶酶切分析，对５８例有母亲患病史（第１组）、３２例有父亲患病（第２组）、４８例有兄弟姐妹患病史（第３组）和５０例无家族史（第４组）的糖尿病患者进行该基因的筛查。在第１组和第３组患者中发现５例突变基因阳性者，并对其中２例先证者的家系成员进行临床和基因分析。结果显示该突变在家族中与糖尿病和耳聋共分离。提示这是一种独特的糖尿病亚型，存在于中国人ＩＤＤＭ和ＮＩＤＤＭ群体中，在母系遗传糖尿病中有较高的发生率。     

线粒体tRNALeu(UUR)基因nt3243A→G突变糖尿病临床特点分析

目的 了解线粒体tRNALeu(UUR)基因nt3243A→G突变在上海及江浙地区家族性糖尿病人群中的发生率及其临床特点.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态结合直接测序方法对随机抽取的无亲缘关系的770个糖尿病家系的先证者进行线粒体tRNA<'Leu(UUR)>基因nt3243A→G突变的筛查,并进一步对阳性先证者家系进行家系遗传学及临床特点分析.结果 在770个糖尿病先证者中发现13例(1.69%)nt3243A→G突变.13个先证者家系的一级亲属中共检出32例3243突变携带者,其中24例为糖尿病,8例糖耐量正常,17例伴不同程度听力减退.24例糖尿病患者多呈消瘦体型,有18例呈典型母系遗传,13例伴胰岛素抵抗,15例伴听力障碍,14例应用胰岛素治疗.结论 上海及江浙地区家族性糖尿病人群线粒体3243点突变检出率是1.69%,线粒体糖尿病患者的临床特点是:(1)多数呈母系遗传,少数可为散发;(2)多于45岁以前发病;(3)体型多偏瘦;(4)胰岛β细胞分泌功能明显降低,部分患者同时伴有胰岛素抵抗;(5)多数患者伴神经性听力障碍或神经性耳聋.     

线粒体12S rRNA基因突变与2型糖尿病

目的 观察线粒体12S rRNA 1310、1438及1442位点在中国汉族2型糖尿病患者群体中的突变情况,同时筛查该区域与2型糖尿病发生有关的突变。方法 采用PDR－SSCP及PCR产物直接测序等技术对86例2型糖尿病患者及70名正常对照个体的血细胞线粒体DNA进行突变分析。结果 发现1例患者线粒体DNA 12S rRNA基因1438位点存在G→A的点突变,另1例存在1442位点G→A的点突变,所有对照个体均未发现该两位点的突变。未发现线粒体基因12S rRNA 1310位点C→T点突变。结论 1438位点G→A、1442位点G→A的突变可能与2型糖尿病的发生相关,该两位点突变的具体意义如何尚需进一步研究。1310位点C→T在血细胞中的突变率可能较低,进一步说明2型糖尿病的发生在线粒体遗传上具有一定的异质性。     

Prevalence of A-to-G mutation at nucleotide 3243 of the mitochondrial tRNALeu(UUR) gene in Japanese patients with diabetes mellitus and end stage renal disease

The A-to-G mutation at nucleotide 3243 of the mitochondrial tRNA ^Leu(UUR) gene (mt.3243A>G) is associated with both diabetes mellitus and myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes (MELAS). Recently, this mutation was found in three diabetic subjects with progressive kidney disease, suggesting that it may be a contributing factor in the development of kidney disease in patients with diabetes. The aim of this study was to evaluate the contribution of this mutation to the development of end stage renal disease (ESRD) in patients with diabetes. The study group consisted of 135 patients with diabetes and ESRD. The control group consisted of 92 non-diabetic subjects with ESRD who were receiving hemodialysis. The mt.3243A>G mutation was detected by polymerase chain reaction-restriction frag-ment length polymorphism (PCR-RFLP). We found the mt.3243A>G mutation in eight patients (8/135; 5.9%), all of whom were initially diagnosed with type II diabetes. Five of the eight patients were subsequently also diagnosed with MELAS. We did not find the mutation in any of the 92 non-diabetic subjects with ESRD. The prevalence of this mutation was 6.5-fold higher in patients with diabetes and ESRD than in those with diabetes alone (8/135 vs 5/550, respectively; χ² = 13.704; P = 0.0002). The mt.3243A>G mutation may be a contributing genetic factor in the development of ESRD in Japanese patients with diabetes. Received: November 29, 2000 / Accepted: February 27, 2001     

中国人PGC-1α基因全外显子cSNPs分析及其MEF2C结构域生物学信息预测

目的了解中国人PGC-1α基因全外显子编码区单核苷酸多态性（cochng single nucleotide polymowhis,cSNPs）分布特征，探讨相关cSNPs与2型糖尿病的关系，并对PGC-1α蛋白肌肉增强因子2C（muscle enhance factor2C，MEF2C）结构域的生物学信息进行预测。方法应用聚合酶链反应．单链构象多态性、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性和DNA直接测序技术检测263例2型糖尿病患者和282名正常糖耐量者PGC-1α基因全外显子cSNPs，应用病例一对照方法探讨相关cSNPs及其单倍型与2型糖尿病发病风险的相关性，并经软件预测PGC-1α基因包含有482位点的MEF2C结构域的3级X-ray衍射晶体结构，分析其可能的生物学信息。结果中国汉族2型糖尿病人群PGC-1α基因全外显子区至少存在4个单核苷酸多态性位点，分别是394G／A、482G／A、528A／G和612C／T。482G／A变异与2型糖尿病显著相关（X^2=14．2025，P=0．0002）。单倍型分析提示394A-482A-528A单倍型在2型糖尿病组与正常糖耐量组分布差异有统计学意义（X^2=59．9，P〈0．01），且与2型糖尿病呈连锁不平衡（t=2．361，P〈0．05）。分子模拟了人PGC-1α蛋白MEF2C结构域的3级X-ray衍射晶体结构，当482位变异成丝氨酸时，该结构域疏水性下降，并伴有氢键断裂，空间结构趋向松散。结论482G／A变异可能减弱了PGC-1α与MEF2C结合力，进而减弱了PGC-1α对下游基因GLUT-4表达的调控，从而经PGC—1α-MEF2C—GLUT-4通路增加了中国汉族人患2型糖尿病的风险。     

一个2型糖尿病家系的线粒体基因nt3426 A→G突变分析

目的 了解线粒体DNA NDI nt3426A→G点突变在一个2型糖尿病家系中的发生情况及临床特点。方法 提取家系成员外周血DNA，用聚合酶链反应扩增、限制性内切酶Apa I消化进行点突变筛选，并收集家系的临床资料。结果 21名家系成员中12名母系亲属均存在nt3426A→G突变，而在配偶及父系亲属中未发现该突变。12名突变者中包括2型糖尿病患者7人、糖耐量减低者1人、空腹血糖受损者1人及糖耐量正常者3人。结论 线粒体DNA NDl基因nt3426A→G突变是该家系中糖尿病的易感因素，可协同其他因素(如肥胖、增龄、不良生活习惯等)共同参与糖尿病的发生。     

Presence of mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) A to G 3243 mutation in DNA extracted from serum and plasma of patients with type 2 diabetes mellitus

AIMS/BACKGROUND: An A to G substitution at base pair 3243 in the mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) gene (mt3243) is commonly associated with maternally inherited diabetes and deafness, and other diseases. It is possible that cell free mitochondrial DNA exists in serum and plasma from these patients, and these samples might be a source of material for the detection of such mutations. METHODS: Sixteen patients with type 2 diabetes mellitus and 25 healthy subjects were tested for the 3243 mutation by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis. Plasma and serum from the 41 subjects were tested blind, without knowledge of the final diagnosis. RESULTS: PCR amplification of the mtRNA(Leu(UUR)) region in mitochondrial DNA (mtDNA) in serum samples revealed the presence of mtDNA in all samples. After ApaI digestion of the amplified DNA fragments, mt3243 was detected in the serum and plasma samples of the seven patients with diabetes who had previously been found to have this mutation in their leucocyte DNA. None of the serum/plasma samples from the healthy subjects or those patients negative for mt3243 in their leucocytes had this mutation (p < 0.001). In addition, the degree of heteroplasmy of mt3243 appeared to be higher in serum and plasma samples than in leucocytes among mt3243 carriers (p < 0.05). CONCLUSIONS: Therefore, mtDNA and associated mutations are present and detectable in serum and plasma. Plasma and serum might be alternative sources for the molecular diagnosis of mt3243 associated diabetes mellitus, as well as other mitochondrial mediated diseases.