水蛭素衍生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

制备水蛭素衍生物，首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序，设计了水蛭素的基因，基因中融合了ＲＧＤ三肽编码顺序，形成水蛭素衍生物编码基因，用ＤＮＡ合成仪，分１０个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中６个寡核苷酸组成Ｎ－端大片段，４个寡核苷酸组成Ｃ－端大片段。     

人NKp46基因克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的：对人NKp46进行基因克隆并探讨其在大肠杆菌中重组表达和纯化。方法：用RT PCR法自人外周血单个核细胞总RNA扩增hNKp46片段（约900?bp）,克隆至质粒载体pMD18 T,并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18 T hNKp46重组质粒,分离hNKp46片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载pET30a(+) hNKp46。转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组蛋白。采用His·Bind Purification Kit对重组蛋白进行纯化。结果：RT PCR扩增的DNA片段与hNKp46 cDNA大小一致。重组质粒pMD18 T hNKp46的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp46的cDNA序列一致。SDS PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为38.5?kD,其表达量达菌体总蛋白的40％左右。Western Blotting分析显示,重组蛋白能特异地与抗His·Tag抗体结合。纯化得到纯度为95.5％的重组蛋白,纯化回收率达40％。结论：成功构建了人NKp46表达载体,并获得了稳定表达的工程菌株,纯化了重组蛋白。     

人CTLA4胞外区突变体在毕赤酵母中的高效表达

目的 根据毕赤酵母密码子偏好，设计并改造人CTLA4胞外区cDNA，构建毕赤酵母分泌型表达载体，以实现人CTLA4胞外区蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法 利用PCR定点突变技术，将人CTLA4胞外区cDNA中的毕赤酵母低频使用密码子突变成高频使用密码子而不改变其氨基酸序列；经DNA序列测定证实后插入毕赤酵母高拷贝表达载体pPIC9Ka分泌信号下游，SacⅠ线性化后电转GS115；G418梯度筛选转化菌；PCR鉴定目的基因整合；甲醇诱导表达，SDS-PAGE、Westem blotting、肽质量指纹等鉴定表达蛋白。结果 成功地对人CTLA4胞外区cDNA进行了定点突变，该突变体在毕赤酵母中能成功表达CTLA4胞外区蛋白。结论 为高效表达人CTLA4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。     

CTLA4胞外区蛋白在GS115酵母中的表达和活性鉴定

目的 获取具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白。方法 构建CTLA4胞外区（CTLA4125）蛋白的酵母表达载体，在GS115酵母细胞中表达。通过硫酸铵粗分离和离子交换层析等，获取纯化的目的蛋白，并在CTLI2细胞中鉴定活性。结果 质粒在GS115酵母中可较高水平地表达CTLA4胞外区蛋白，经纯化后的蛋白可抑制IL－2刺激的CTLI2细胞的增殖。结论 GS115酵母可高效表达具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白。     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

制备水蛭素衍生物，首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序，设计了水蛭素的基因，基因中融合了ＲＧＤ三肽编码顺序，形成水蛭素衍生物编码基因，用ＤＮＡ合成仪，分１０个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中６个寡核苷酸组成外端大片段，４个寡核苷酸组成Ｃ－端大片段。各大片段与载体ｐＵＣ１９重组和无性繁殖后，通过ＫｐｎⅠ位点连接成编码水蛭素衍生物分子的完整基因。经核苷酸顺序分析证实后，水蛭素衍生物基因与表达载体重组，转化大肠杆菌，筛选含重组质粒的细菌，命名为ｐＳＧＨＲＥ。结果：ｐＳＧＨＲＥ菌破碎后，上清和沉淀部分都有水蛭素活性。上清活性约２０ＡＴＵ／ｍｌ菌液。结论：我们构建了水蛭素衍生物基因的克隆并在大肠杆菌中得到表达。     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

CD28与CTLA—4介导的信号传导及其在肿瘤免疫治疗中的作用

在Ｔ细胞的充分激活过程中需要两个刺激信号,一是抗原特异的、由抗原提呈细胞(ＡＰＣ)提呈的ＭＨＣ-Ⅱ-抗原肽与ＣＤ4Ｔ细胞表面的ＴＣＲ-ＣＤ3复合体交联所提供的第一信号;二是共刺激信号(ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｓｉｇｎａｌ),也称第二刺激信号,由ＡＰＣ表面的粘附分子与ＣＤ4Ｔ细胞表面相应受体结合及细胞因子与其相应受体结合所提供,共刺激信号是非抗原特异性的,但为Ｔ细胞抗原特异性激活所必需。在共刺激信号中,ＣＤ28/ＣＴＬＡ-4:Ｂ7这对粘附分子最为引人注目,其所介导的信号传递作用在Ｔ细胞激活和效应过程中均起重要作用。本文…     

CTLA4—Ig对过敏性哮喘作用的研究

目的：通过CTLA4－Ig阻断B7／CD28的结合防止CD＋4T激活,探讨其治疗哮喘的可行性。方法：分别用6只BALB／C小鼠作为正常,哮喘,治疗组,于气道激发后24h进行外周血,支气管肺泡灌洗液89BALF）细胞计数及分类,细胞因子测定和病理切片。结果 ：哮喘组BALF细胞数增加,炎性细胞比例上升,全身及局部IL－4水平增高,病理示气道民性炎症性改变,治疗组可减轻上述改变,两组比较差别有显著性。结论：CTLA4－Ig可引起抗原特异性免疫耐受,抑制哮喘反应。     

人神经营养素-4基因的克隆及表达

目的 通过基因工程的方法扩增人神经营养素-4(hNT-4)cDNA,在大肠杆菌中表达hNT-4,为研究hNT-4的生物学作用提供材料.方法 以人胎脑RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hNT-4 cDNA,将其插入的质粒pGEM-T中.将经过序列分析确定的hNT-4 cDNA插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达载体pGEX-6p-1-NT-4,用SDS-PAGE法测定融合蛋白在大肠杆菌中的表达.结果 经序列测定分析,克隆的hNT-4 cDNA核苷酸序列与已发表序列(GenBank,M86528)完全一致,并获得了高效表达hNT-4的重组菌株.结论 体外成功扩增hNT-4 cDNA,并在原核细胞中高效表达了hNT-4.     

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35（IL-35）基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过（Gly4Ser）3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b（＋）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b（＋）-IL-35在BL21（DE3）中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。     

TIMP-4基因的克隆、原核表达及活性测定

目的：采用RT-PCR法获取TIMP-4基因,并通过原核表达获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法：从SD大鼠心肌组织中提取总RNA,利用RT-PCR法扩增出TIMP-4基因,经基因序列分析后构建表达载体PET-28a（＋）-TIMP-4,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TIMP-4的表达。利用N2＋-NTA纯化和复性后,根据其骨肉瘤细胞迁移能力的影响检测其活性。结果：克隆到编码序列完全正确的大鼠TIMP-4基因,能在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物占全菌总蛋白的23.5%,N2＋-NTA纯化和复性后,纯度达90%以上。纯化后的融合蛋白使骨肉瘤细胞株的迁移能力得到显著抑制。结论：通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。     

膜联蛋白A5 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人膜联蛋白A5 cDNA并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎盘组织的总RNA扩增膜联蛋白A5的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T,在tac 启动子控制下,IPTG诱导表达GST融合蛋白.以亲合层析法纯化表达的融合蛋白,用KPTT法验证抗凝血活性.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为978 bp,重组质粒测序结果表明,插入片段与人膜联蛋白A5的序列完全一致.在IPTG诱导下,K802重组菌高效表达出相对分子质量为58 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26%.纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:成功克隆人膜联蛋白A5基因并在大肠杆菌中高效表达.     

大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达

目的构建pGEX4T-1-RGS4载体,并检测融合蛋白GST-RSG4在原核中的表达水平。方法采用RT-PCR方法,将克隆SD大鼠G蛋白信号转导调节因子(regulator of G protein signaling4,RGS4)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pGEX4T-1中,IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白GST-RSG4的表达水平。结果成功构建了pGEX4T-1-RGS4载体;经IPTG的诱导,RGS4可与GST以融合蛋白的形式高效表达。pGEX4T-1-RGS4在原核内表达产物相对分子质量约为50×103,与预期融合蛋白大小一致。结论构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

大鼠血红素氧化酶 1的基因克隆和原核表达

目的：从大鼠脾中克隆出血红素氧化酶1（RHO-1）基因，构建其原核表达载体，并在大肠杆菌中表达其蛋白。方法：用RT-PCR从大鼠脾总RNA中扩增出RHO-1 cDNA，并将其克隆入pMD18-T载体， 经TA克隆测序分析后,将阳性TA克隆RHO-1片段亚克隆入pET28a(+)原核表达载体，转化大肠杆菌BL-21，经限制性内切酶图谱鉴定后，阳性菌株经IPTG诱导，SDS-PAGE分析。结果：TA克隆测序分析证实该基因全长870 bp,编码289个氨基酸,所克隆的基因序列与GenBank中登录的RHO-1基因序列完全一致；限制性内切酶图谱结果表明成功构建了RHO-1的原核表达载体；SDS-PAGE结果显示RHO-1基因在大肠杆菌中获得表达。结论：用RT-PCR正确克隆RHO-1基因，构建pET28a(+)/RHO-1表达载体，并成功表达RHO-1融合蛋白。     

人白细胞介素10的克隆及分泌表达

目的：研究人白细胞介素10（hIL-10)的高效分泌表达。方法：根据Genbank报道的hIL-10基因序列，人工合成hIL-10基因，并将某些稀有密码子替换成E.Coli偏爱密码子，克隆至pUC18质粒中，测序结果与预期一致，将hIL-10基因克隆至PET22b，构建分泌表达克隆PET22b-hIL-10，经IPTG诱导在大肠杆菌BL21（DE3）中表达hIL-10天然蛋白。结果：SDS－PGAE电泳及凝胶密度扫描分析显示，重组蛋白分子量约为18KD和21KD(含信号肽），不同温度条件下重组蛋白的表达状态和表达量不同，结论：18摄氏度重组蛋白hIL-10的表达量为7．6％。     

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coliBl21(Gold)中,诱导表达survivin蛋白。通过DEAESepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Westernblotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coliBl21(Gold)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上。Westernblotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。     

人TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人TRAIL基因，构建其原核表达载体。方法 采用RT-PCR（方法从人宫颈癌细胞系HeLa的总RNA中扩增TRAIL基因114～281片段的cDNA，并将目的片段克隆至原核表达载体pET32a（＋）。结果 克隆到人TRAIL基因114～281片段的cDNA，DNA测序结果与GenBank基因库报导的完全一致，经SDS～PAGE电泳。可见29kD大小的融合蛋白质表达。结论 人TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达。为进行研究sTRAIL的作用机制提供了实验依据。     

乙肝病毒e抗原基因在大肠杆茵中高表达

取pZD 8703质粒DNA(本室构建的高表达乙肝核心抗原基因质粒)用Ava Ⅰ酶切开,Bal 31酶消化,加四种核甘酸dNTP、DNA聚合酶大片段酶补平后,用T_4 DNA连接酶连接,再用EcoRI酶消化,回收EcoRI小片段连接到pJLA 503的EcoRI位点,转化受体菌JM103,获得在P_RP_L启动子控制下,由温度调节CIts 857开启和关闭的高表达乙肝e抗原(HBeAg)的重组体。用抗HBe-β)单克隆酶标抗体配套的ELISA双抗体夹心法测定经超声波处理的细菌原液,HBeAg的终效价在1:10240以上,只含少量HBeAg。可以代替血清HBeAg用作配套检测试剂。