环介导等温扩增技术及其在基因突变筛查中的应用研究

基因突变筛查是疾病临床诊断和确定治疗方案的有效方法之一。环介导等温扩增(LAMP)是一种新颖的恒温核酸扩增技术,由于其在灵敏度,特异性和快速性等方面具有显著优势,现已被广泛应用于各种研究领域,如食品检测和疾病诊断等。但是,LAMP技术在基因突变筛查中的应用研究报道相对较少。因此,本文就LAMP技术及以LAMP为基础衍生的新方法在基因突变筛查的应用进行重点阐述,旨在为以此技术平台为基础的推广及应用提供新的思路。     

环介导恒温扩增(LAMP)技术及其在寄生虫检测中的应用

近年来开发出一种新的恒温核酸扩增方法,即环介导恒温扩增(loop-mediated isithermal amplification,LAMP)法.LAMP技术具有简便、快速、高效、特异性强等优点,尤其适用于人类和动物疾病的检测.该文简要介绍了LAMP技术的原理,并对其在检测寄生虫如锥虫、疟原虫、巴贝虫、隐孢子虫和水生动物孢子虫等方面的应用进行综述.     

LAMP法应用于寄生虫感染检测的研究进展

环介导等温扩增(LAMP)技术是近年来发展迅速的一种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传统PCR方法相比,LAMP技术属于等温扩增,无需昂贵的热循环仪,并且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀,扩增产物可不经过电泳,无需开盖直接通过肉眼观察即可判定结果,在反应前、后加入染色剂效果更佳。LAMP技术敏感性高、特异性强、操作简便,能够满足现场和条件较差的基层实验室进行快速检测的需求。近年来LAMP技术在寄生虫感染检测中应用广泛,本文对其研究进展进行了综述。     

环介导等温扩增技术及其应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新型的体外核酸扩增技术,在等温条件下,利用一种具有自动链置换活性的Bst DNA聚合酶和一组特异性引物,对靶DNA序列进行快速扩增,1 h左右可合成109～1010拷贝的靶DNA序列.LAMP技术具有简便、快速、扩增效率和特异性高等特点,近年来该技术广泛应用于病原菌、病毒等病原体的快速分子检测.该文详细介绍LAMP的原理、引物设计及其在微生物分子检测方面的应用.     

环介导等温扩增技术在致病菌检测中的应用

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术是近10年来发展起来的具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点的新的恒温核酸扩增技术,已被应用于致病菌检测的研究。LAMP技术需针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物,并采用链置换型DNA聚合酶,操作步骤少,不需要聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术复杂的设备。本文就LAMP技术在致病菌检测中的应用作一综述。     

环介导恒温扩增技术及其在病原检测中的应用

环介导等温扩增(LAMP)技术是一种崭新的核酸扩增方法。它使用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,针对靶基因上6个不同区域设计4种引物,在恒温条件下进行核酸扩增,不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程。具有简便、快速、特异、敏感的特点,可用于真核生物、原核生物等多种生物的DNA/RNA扩增。本文对LAMP技术基本原理、特点、在病原检测中的应用以及在单核苷酸多态性基因型检测中的应用等进行了综述。     

环介导等温扩增技术在寄生虫检测中的应用进展

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是近年来发展起来的一种分子生物学检测方法,具有简便快捷、敏感特异、实用等优点,并已在人体和动物寄生虫检测领域中得到广泛应用,本文主要就 LAMP 技术在原虫、吸虫、线虫、绦虫等寄生虫检测中的应用进行介绍。     

LAMP法检测儿童粪便中肠道腺病毒的建立

目的通过应用环介导等温扩增(LAMP)建立一种快速、简便的可视化检测儿童肠道腺病毒核酸的方法。方法登录GenBank网站下载腺病毒40和41基因型的六邻体序列,根据该区段的保守序列设计4条LAMP引物。将反应体系加入EP管,在恒温条件(65℃)扩增60min后,再以凝胶电泳和钙黄绿素染色评价LAMP法的特异性和灵敏度,并和PCR法的结果相比较。最后,同时用LAMP和PCR法对40份可疑临床样本进行检测,应用卡方检验进行统计学分析。结果 LAMP法能准确地使腺病毒40和41型得到扩增,酶切结果也正确,显示了LAMP法较好的特异性。LAMP的灵敏度比PCR高约10倍。经过对40份临床样本的检测,LAMP与PCR均没有发生非特异扩增,LAMP法和PCR法的一致性为92.5%(P0.05)且LAMP法没有漏检阳性样本。另外,使用钙黄绿素染色的方法更好地显示了产物检测的可视性和简便性。结论该研究初步建立了快速、简便、可视化检测肠道腺病毒的LAMP技术,在基层医疗机构有一定的实用价值。     

应用环介导等温扩增技术检测弓形虫

目的 用环介导等温扩增（LAMP）技术检测弓形虫。 方法　 用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组 DNA,设计两对扩增弓形虫 B1基因的 LAMP 引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞作对照,进行LAMP反应,产物经 SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性。将弓形虫速殖子经倍比稀释为（2～3）×106个/ml至（2～3）×10-1个/ml 等8个浓度,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性。 结果 LAMP反应结果显示,弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色。弓形虫的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。 结论 LAMP技术在弓形虫检测中显示出较好的特异性与敏感性。     

环介导等温扩增技术检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的应用

目的建立一种用于检测单纯疱疹病毒-Ⅰ型（HSV-1）的环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法。方法用病毒DNA提取试剂盒提取HSV-1基因组DNA。设计4条扩增HSV-1糖蛋白gG基因的LAMP引物,对HSV-DNA进行LAMP,扩增产物进行琼脂糖电泳和酶切鉴定（试验设HSV-2、HPV-6、HPV-11、沙眼衣原体对照和阴性对照）;并对3例临床标本进行LAMP检测。结果 HSV-1 LAMP产物电泳后呈LAMP特征性条带,对照组无扩增条带;扩增产物AvaⅠ酶切片段大小分别为182、140和62 bp,与理论值相符。用HSV-1 LAMP引物扩增3例口唇疱疹标本,2例标本出现LAMP条带,1例标本未扩增出条带。结论建立的LAMP方法简便、高效、快速,可用于HSV-1感染检测。     

Field Verification of an African Swine Fever Virus Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay during an Outbreak in Timor-Leste

Recent outbreaks of African swine fever virus (ASFV) have seen the movement of this virus into multiple new regions with devastating impact. Many of these outbreaks are occurring in remote, or resource-limited areas, that do not have access to molecular laboratories. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a rapid point of care test that can overcome a range of inhibitors. We outline further development of a real-time ASFV LAMP, including field verification during an outbreak in Timor-Leste. To increase field applicability, the extraction step was removed and an internal amplification control (IAC) was implemented. Assay performance was assessed in six different sample matrices and verified for a range of clinical samples. A LAMP detection limit of 400 copies/rxn was determined based on synthetic positive control spikes. A colourmetric LAMP assay was also assessed on serum samples. Comparison of the LAMP assay to a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was performed on clinical ASFV samples, using both serum and oral/rectal swabs, with a substantial level of agreement observed. The further verification of the ASFV LAMP assay, removal of extraction step, implementation of an IAC and the assessment of a range of sample matrix, further support the use of this assay for rapid in-field detection of ASFV.     

Pathogen diagnosis of children sepsis by LAMP technology

ObjectiveTo explore a rapid diagnostic method in neonatal sepsis and bacterial meningitis.MethodsThe primers were designed and synthesized based on 16S rRNA gene of Staphylococcus aureus. Four specimens of Staphylococcus aureus, 16 specimens of coagulase-negative Staphylococci, 2 specimens of Enterococci, 3 specimens of Streptococcus, 1 specimen of Micrococcus, 3 specimens of Escherichia coli, 4 specimens of Klebsiella pneumoniae, 3 specimens of Pseudomonas aeruginosa, 2 specimens of Enterobacter cloacae, and 5 specimens of Acinetobacter were tested by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay. A total of 118 clinical specimens of sepsis and non-sepsis were collected and detected with both LAMP assay and blood culture.ResultsBy designing primers specific for Staphylococcus aureus, specimens containing different kinds of pathogens were carried out by LAMP assay, and our data showed LAMP technology for the specific detection of Staphylococcus aureus in samples was successfully established. All clinical specimens of sepsis and non-sepsis were tested by both blood cultures and LAMP, and our data showed that compared wit blood culture method, the LAMP technology showed significantly high detection rate (P <0.01).ConclusionsAs a quick and easy detection of Staphylococcus aureus, the LAMP technology was successfully established, laid the foundation for the diagnosis and treatment of children Staphylococcus aureus sepsis, and showed great promotion and application value.     

实时荧光环介导等温扩增技术检测土壤中的类鼻疽伯克霍尔德菌

目的 结合荧光染料EvaGreen与环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)探索快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的可行性。方法 根据类鼻疽伯克霍尔德菌filc基因片段设计了LAMP引物,利用荧光染料EvaGreen建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp),优化反应条件,扩增产物经电泳鉴定。通过类鼻疽伯克霍尔德菌和其他致病菌验证特异性,比较RealAmp与普通LAMP技术的敏感度,并测定人工污染土壤模拟样本的检出限。结果 恒温63 ℃条件下,20~60 min即可完成RealAmp检测;利用该方法检测类鼻疽伯克霍尔德菌为阳性,其余致病菌如鼠疫杆菌、布鲁氏杆菌、大肠杆菌等13株参考菌株及蜱虫的DNA(含大量假单胞菌属细菌)呈扩增阴性;RealAmp技术检测类鼻疽伯克霍尔德菌核酸的灵敏度为10² CFU/mL,检测克隆株质粒的灵敏度可达10¹ copies/μL,比普通LAMP技术的灵敏度高10倍;人工污染土壤模拟样本RealAmp的检出限为4.4×10¹ CFU/g,且20 min左右即可判定结果;直接检测24份浓度为4.4×10¹ CFU/g~4.4×10⁸ CFU/g的类鼻疽伯克霍尔德菌人工污染土壤样本,在检出限以上,检出率同荧光定量PCR一致。结论 该方法特异性强、灵敏度高,且可实时监测类鼻疽伯克霍尔德菌,有望成为快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的有效方法,增强抵御生物恐怖战争的能力。     

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for malarial parasites of humans: Would it come to clinical reality as a point-of-care test?

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel molecular method that accelerates and facilitates DNA amplification and detection under isothermal conditions. It represents a revolution in molecular biology by reducing the high cost, turnaround time and technicality of polymerase chain reaction and other amplification methods. It has been applied for the diagnosis of a variety of viral, bacterial, parasitic and other diseases in the biomedical field. LAMP has been involved in studies concerning the diagnosis of malaria which is still a major cause of morbidity and mortality in different parts of the world. For the success attained with this technology to diagnose human malaria, is it time to think that LAMP-based point-of-care diagnostics come to application to support the diagnosis of clinical malaria cases? The present review deals with the use of LAMP in the diagnosis of malaria and related investigations to make a view on what has been investigated and highlights the future perspectives regarding the possible applications of LAMP in diagnosis of the disease.     

环介导等温扩增技术检测细粒棘球绦虫DNA的初步研究

目的评价环介导等温扩增技术（LAMP）检测细粒棘球绦虫的敏感性。方法提取细粒棘球绦虫虫卵及成虫DNA,根据棘球绦虫线粒体12SrRNA基因序列及LAMP法原理,设计4条细粒棘球绦虫特异性引物,进行LAMP反应,反应产物经SYBRGreenⅠ显色及1.5%琼脂糖电泳鉴定,同时设置泡状带绦虫及空白对照。用1000、100、10、1个虫卵/200μl细粒棘球绦虫虫卵DNA进行LAMP反应,评价其敏感性。结果细粒棘球绦虫检测管反应液呈混浊沉淀,显色后为绿色;对照组澄清,显色后为棕色。虫卵产物电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组无扩增产物。LAMP可检测到的虫卵最低数量为1个。结论 LAMP法敏感、特异、简便,可用于棘球蚴病病原检测和疾病监测。     

环介导等温扩增法检测人粪样中美洲钩虫的方法建立

目的 建立一种快速、高效的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测粪样中美洲钩虫虫卵。方法 根据美洲钩虫ITS基因序列,设计4条LAMP引物,建立LAMP检测法。利用LAMP法检测日本血吸虫、肝吸虫、鞭虫、猪蛔虫、蛲虫的DNA样本以验证LAMP方法的特异度。以美洲钩虫成虫DNA样本,倍比稀释以评价LAMP法的DNA最低检出量。现场采集55份人粪DNA样本,采用改良加藤法、LAMP法和普通PCR方法同时检测,评价LAMP法的敏感性和特异性。结果 LAMP法可特异性扩增美洲钩虫DNA样本。LAMP法可检测最低DNA浓度为1.2 fg/mL。通过现场样本对LAMP进行评价,LAMP法敏感性相对于改良加藤法和PCR法分别是95.24%和100%。特异性分别是97.06%和100%。结论 建立起以虫卵为检测材料的检测美洲钩虫病的LAMP法,为美洲钩虫病提供特异、敏感、高效的检测方法。     

环介导等温扩增法快速检测结核分枝杆菌的初步观察

目的建立1种用于结核分枝杆菌快速检测的LAMP技术平台,用于结核分枝杆菌的鉴定。方法使用了11株标准菌株,建立了一套用于结核分枝杆菌快速检测的平台,对灵敏度和特异性进行优化,随后使用47株临床分离株,和13株食源性致病菌对建立的方法进行了验证。结果经过标准菌株建立并优化检测平台,经过优化的LAMP反应体系检出限为1pg的模板DNA,在使用47株临床分离株,和13株食源性致病菌对方法进行验证,发现LAMP特异性为97.4%。结论通过这项研究发现LAMP应用于结核分枝杆菌的快速检测,具有检出浓度低、特异性强和检测周期短的优点。     

环介导等温扩增技术检测日本血吸虫尾蚴的实验研究

目的建立一种检测日本血吸虫尾蚴的方法。方法采用环介导等温扩增技术（LAMP）：使用基因释放剂快速提取尾蚴基因组DNA,设计4条扩增尾蚴钙结合蛋白基因的LAMP引物,进行LAMP反应,以华支睾吸虫为阴性对照,LAMP产物经显色、电泳鉴定。用细吸管在解剖镜下分别吸取20、10、5、1条尾蚴进行LAMP反应,检测其敏感性。结果尾蚴检测管经显色后呈绿色（阳性）,对照组呈棕色（阴性）。尾蚴LAMP产物电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组无扩增产物。LAMP可检测到尾蚴的最低数量为1条。结论LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测日本血吸虫尾蚴。