牡畜链霉菌（Streptomycescattleya）thienamycin合成阻断变株的…

以ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ（ＴＮＭ）产生菌Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ）为出发菌体，利用终浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ强诱变剂亚硝基胍在ＰＨ９．０、３７℃条件下对其孢子悬液处理３０ｍｉｎ，得到稳定的ＴＮＭ生物合成阻断变株Ｙ３。     

龟裂链霉菌原生质体诱变与筛选研究

采用定向推理筛选方法对龟裂链霉菌原生质体进行诱变筛选得到３４６＃菌株，其复筛时比对照产量高７％，而在６０吨大罐上连续发酵９批，发酵指数比对照高了１３％。     

吸水链霉菌井冈变种原生质体的制备与再生

目的研究井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种的原生质体制备与再生的最佳条件。方法使用溶菌酶水解菌体细胞壁法,分别考察影响吸水链霉菌井冈变种原生质体的制备与再生的各种因素。结果在R2YE液体培养基中,一级菌丝体的最佳培养时间为24 h,二级菌丝体的最佳培养时间为16 h,最佳甘氨酸质量浓度为5 g.L-1,最佳溶菌酶质量浓度为2 g.L-1,最佳酶解时间为60 min,最佳再生培养基为R2YE,原生质体的再生率最高可达到15.79%。结论本实验确定了吸水链霉菌井冈变种的原生质体制备与再生的最佳条件,能够得到较高的再生率。     

生米卡链霉菌与北里链霉菌种间原生质体融合重组的研究

生米卡链霉菌和北里链霉菌用42％PEG4000做助融剂进行多配对原生质体种间融合,融合率为10~(-2)。同时,进行了UV灭活亲株的种间融合,融合率也为10~(-2)。采用液体培养基再生,表观融合率达10~(-1)。随机挑选形态各异的一定数量的融合子作产物分析,发现它们产生柱晶白霉素,总效价比直接亲本高5.9倍,比间接亲本高27％。高效液相色谱测定表明A_5组份从9.1％提高到43.4％。     

金色链霉菌原生质体电融合

为了提高去甲基金霉素的发酵效价,将金霉素链霉菌产生去甲基金霉素的变株的原生质体与金霉素高产变株热灭活的原生质体,用非交流电场法和交流电场法进行了电融合。在非交流电场法实验中。先用25％PEG将原生质体聚集,再以BAEKON 2000和SDⅡ型二种基因转移仪,采用几种不同的实验参数(脉冲强度、宽度和个数)进行融合,皆未能提高融合频率。交流电场法融合实验用SD3000细胞融合仪,当原生质体在交流电场(频率0.5MHz,强度800v/cm,作用时间60s)中形成串珠状后,施加直流脉冲(脉冲强度7kv/cm,宽度20μs,间隔0.5s,个数3),融合频率为2×10~(-4)左右,比50％PEG诱导的融合频率(2.5×10~(-5)高约一个数量级。对225株融合子进行了初筛发酵和效价测定。结果表明,其中效价高菌株所占百分数高于对照组(去甲基金霉素产生菌不同营养缺陷型的融合子),而且85％以上的融合子只产生去甲基组分。尽管融合子的发酵效价皆不稳定,但经过几次自然分离后仍获得了产量比出发菌株提高一倍左右并只产生去甲基组分较为稳定的融合子菌株。     

林可链霉菌与委内瑞拉链霉菌种间原生质体融合的研究

本文报道氯霉素产生菌委内瑞拉链霉菌A-186株与林可霉素产生菌林可链霉菌林可变种78-11株种间原生质体融合的结果。首先,研究了委内瑞拉链霉菌A-186的原生质体制备和再生条件,再生率可达86％。然后,采用氯霉素产生菌S.venezuelae A-186的原生质体用紫外线灭活后,与具有耐药标记的S.lincolnensis var.lincolnensis78-11原生质体融合的方法,种间融合频率达到3.2×10~(-5) 。并筛选到一株遗传稳定的重组子,经初步鉴定它能同时产生两亲株所产的两种抗生素。     

林肯链霉菌原生质体的形成、再生及其影响因素

林肯链霉菌林肯变种(Streptomyces lincolnensis var.lincolnensis)在含有0.5%甘氨酸的 S培养基上生长的菌丝体对溶菌酶敏感,酶解后产生10~8/ml 的原生质体。在适当的条件下可有20%的原生质体再生成细胞。原生质体在4℃贮存20h 后再生活力下降至原来的20%以下。原生质体在紫外光照射下比孢子更易发生突变。     

生米卡链霉菌原生质体电融合重组研究

采用电融合新技术可提高生米卡链霉菌原生质体融合频率,并且在原生质体稳定液中加入2.5mol/L的MgCl_2,比使用PEG助融方法的融合频率高10倍。经过UV灭活高产菌株和另一脯氨酸缺陷型菌株的原生质体的电融合,其融合子的抗生素产量变异幅度大,发酵产物的各组份比例改变,经过选择获得了一新的高产菌株,麦迪霉素产量提高77％,其有效组份A_1比例增加。     

一种改进卡特利链霉菌358原生质体再生的方法

以卡特利链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ）３５８为原始菌株,研究了影响原生质体形成和再生的各种因素,证实了再生培养基中含ＨＥＰＥＳ缓冲剂以及Ｐ缓冲液中加入１％的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）后能有效地促进再生,在ＳＲ再生培养基上原生质体再生率由０．１％提高到２９．５％。     

原生质体再生与诱变在硫霉素产生菌选育中的应用

以硫霉素产生菌卡特利链霉菌３５８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｔｌｅｙａ３５８）为原始菌株,用原生质体形成与再生结合物理、化学诱变的方法进行菌种选育。在最适条件下原生质体释放浓度和再生率分别为１．６×１０９／ｍｌ和２９．５％。原生质体再生处理后,硫霉素产量变异向正方向移动,筛选到１株ＰＲ－１１７,相对效价提高６０％。分别以菌株ＰＲ－１１７的孢子和原生质体进行紫外线及亚硫酸氢钠诱变,原生质体对诱变剂的敏感性强于孢子,致死率增加,效价分布更分散。原生质体与孢子紫外线诱变正变率分别为１６．５％和９％,亚硫酸氢钠诱变的正变率都为４％。从原生质体紫外线诱变株中筛选到１株ＰＲｕ－３３６,相对效价比原始菌株提高９０％。     

Thienamycin环化酶基因的结构及在大肠杆菌中表达的研究

对来自重组质粒ｐ６ＢＣ１２外源片段上的１．３ｋｂ片段进行核苷酸序列分析，结果表明整个片段的Ｇ＋Ｃ含量为６８．６％，基因结构符合链霉菌基因特点，其上存在一个完整的开放阅读框架（ＯＲＦ），由４０５个碱基组成，编码１３４个氨基酸，起始密码为ＡＴＧ，终止密码为ＴＧＡ，起始密码上游有保守的ＳＤ序列ＧＧＡＧＧ。推测的－１０区为ＣＡＧＣＣＴ，－３５区为ＴＴＧＣＡＧ。终止密码下游有一个长为１８ｂｐ的反转重复序列。根据基因定位的结果，认为是ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因。它与异青霉素Ｎ合成酶基因连锁。与Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ中异青霉素Ｎ合成酶及克拉维胺酸合成酶相比氨基酸序列的同源性极低，表明这可能是一个新的基因。利用ＰＣＲ技术将环化酶基因扩增并克隆至大肠杆菌高表达载体ｐＴ７－７，使其在大肠杆菌中得到表达，同位素参入实验结果表明蛋白分子量为１４．５ｋＤ，与理论值相符。表达产物在体外可分别将纯化的ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因阻断变株Ｙ３的中间产物和Ｙ３发酵液转化为具抗菌活性物质。     

硫霉素产生菌卡特利链霉菌A520基因文库的构建

以大肠杆菌／链霉菌穿梭柯斯质粒ｐＫＣ５０５为载体，构建了卡特利链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｔｌｅｙａ）Ａ５２０在大肠杆菌ＤＨ１的基因文库，重组质粒插入外源片段的概率在９５％以上，插入外源片段的大小为２０～３０ｋｂ。以链霉菌染色体分子量为１０４ｋｂ计算，由４０００个转化子构成的基因文库可以概括卡特利链霉菌Ａ５２０约９９％的基因组。用已经克隆的硫霉素环化酶基因上游的１．５ｋｂＤＮＡ片段作为探针杂交，从基因文库得到３２个阳性克隆。用利波曼链霉菌（Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉ）中的ＩＰＮＳ基因作为探针杂交，从基因文库得到１个阳性克隆ｐＫＷ２０１／ＤＨ１，并为Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交进一步证实杂交片段在ＢａｍＨⅠ２．７ｋｂ片段上。用来自带小棒链霉菌（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）的克拉维酸生物合成途径中的环化酶基因ｃｓ２作为探针杂交进行筛选，得到１个阳性克隆ｐＫＷ３０１／ＤＨ１，说明所构建的基因文库比较完整，并为进一步研究硫霉素产生菌卡特利链霉菌Ａ５２０中抗生素生物合成基因打下了良好基础     

Biosynthesis of fluorothreonine and fluoroacetic acid by the thienamycin producer, Streptomyces cattleya

An antimetabolite, THX, was isolated from fermentation broths of the thienamycin producer, Streptomyces cattleya, when the organism was grown in the presence of a fluorine-containing substrate. THX was subsequently identified as one of the four possible stereoisomers of 4-fluorothreonine. Inorganic fluoride or any one of a number of organofluorine compounds can be used as precursors of 4-fluorothreonine. In addition, 19F NMR has provided evidence that the organism synthesizes fluoroacetate under the same fermentation conditions. The in vitro antibacterial spectrum of 4-fluorothreonine is also presented.     

黑暗链霉菌原生质体制备、再生及其DNA转化条件的研究

利用CP培养基培养黑暗链霉菌 (Streptomycestenebrarius) 990 4,采用二级培养即首先在37℃培养 48h ,然后按 10 %的转种量转种于新鲜的培养基中 ,同时补加 2 %甘氨酸 ,2 8℃培养 2 0h ,收获的菌丝体对溶菌酶敏感。在适宜的酶解条件下可形成 4 6 2× 10 9/mL原生质体 ,再生率为18%。利用经修饰的质粒DNA转化冻存的原生质体获得成功 ,转化率为 10 3～ 10 4 / μgDNA。     

赤霉素产生菌原生质体制备、纯化与再生工艺的研究

目的对赤霉素产生菌原生质体进行制备、纯化、再生工艺改进与完善。方法本文通过微孔滤膜作载体,在含甘氨酸的菌丝生长培养基固体平板上,培养取得幼嫩菌丝体,并对原生质体制备时的复合破壁酶液组分配比、酶解时间,原生质体纯化再生工艺进行了改进和完善。结果实验证明:①在幼嫩菌丝体的制备过程中,采用微孔滤膜平板法培养幼嫩菌丝体,易于控制菌龄,生长在微孔滤膜上的菌丝体不混杂有多余的培养基成份,不必经洗涤,可直接酶解,简化了实验步骤;②在原生质体制备过程中,采用以纤维素酶2%+蜗牛酶1%+果胶酶0.4%作为复合破壁酶液的组成,可使原生质体的释放量从105升至106;③在原生质体纯化过程中,采用先慢速离心沉淀,后洗涤滤除菌丝断片的操作方法,可使无壁娇嫩易碎的原生质体可依附菌丝断片作缓冲载体一起沉淀,有利于纯化收集到完整的原生质体,提高原生质体的活性再生;④在原生质体再生过程中,选用含有聚胨、酵母膏成份的RM再生培养基,可使原生质体的再生率达到16%以上。结论原生质体制备、纯化、再生工艺的改进与完善,确保了诱变育种基因突变后的遗传个体绝大部分都是纯合体,避免了高产性状经传代后水平回复的现象,为赤霉素理化诱变育种工作的顺利开展创造了良好条件。     

生米卡链霉菌的耐前体变株选育及发酵工艺优化

目的提高生米卡链霉菌的发酵水平和有效组分A1含量。方法出发菌株109S通过紫外线、亚硝基胍的组合诱变处理后筛选高产前体抗性突变株,并考察高产变株的发酵周期、最适补加前体的时间和剂量。结果和结论共筛选了368个抗性突变株,得到一株生产能力比出发菌株提高33%、A1组分提高16%的高产变株B64-5,连续传4代生产能力基本不变,较稳定;确定了变株发酵周期为52 h,发酵最佳补加前体时间为0 h,最佳补加剂量为0.3 g.L-1。     

小诺霉素产生菌棘孢小单孢菌突变菌株原生质体形成、再生及融合的研究

甘氨酸（Ｇｌｙ）的加入将会影响棘孢小单孢突变型菌株孢子发芽和菌丝生长，其影响程度与甘氨酸浓度及菌丝培养基成份有关，在Ⅱ号培养基中，０．３％Ｇｌｙ对菌丝形态的改变十分明显，而０．５％Ｇｌｙ能抑制孢子发芽。消色肽酶（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｉｔｉｄａｓｅ）与溶菌酶（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）联合作用比单一溶菌酶制备的原生质体形成率和再生率有明显提高。再生培养基以原分离培养基补充０．２ｍｏｌ／Ｌ蔗糖为宜，其再生频率可达到１５％。采用ＰＥＧ４０００，４２％（ｗ／ｖ）为助融剂，直接法检出融合重组体，其重组频率可达０．５％～１．０％，重组体中大部分苗株的次级代谢特性与亲株有较大差异，在再生菌落筛选中获得一些优良菌株，其小诺霉素产率较原亲株有显著提高。