人羊膜间充质干细胞分离培养及鉴定

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的多能干细胞,具有高度自我更新能力和多向分化潜能〔1-2〕。目前研究最多的是骨髓MSCs,但其必须通过有创伤性的途径获得,而且随着时间的延长,干细胞数量明显减少〔3〕。因此,寻找更易获得、含量丰富且易于培养的MSCs来源,对MSCs的实验研究具有重要意义。本研究从人羊膜组织中分离纯化MSCs,为人羊膜间充质干细胞(AMSCs)的进一步研究及临床应用提供基础。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件．比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞＋10％胎牛血清或Mesencuit^TM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用Mesencult^TM培养基＋10％胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

人脐带间充质干细胞移植后在ATN大鼠的分布

目的观察DAPI标记的人脐带间充质干细胞经外周静脉移植后在ATN大鼠体内的分布。方法 SD大鼠120只随机平均分为三组。移植组:将总量900mg/kg庆大霉素,首次300mg/kg,12h后200mg/kg,余400mg/kg分两次每隔24h皮下注射,共3天,建立ATN大鼠模型,采用经尾静脉注射法移植人脐带间充质干细胞。模型组:造模方法同移植组。空白组:正常大鼠。分别于造模成功后1d、4d、1w、2w及4w处死大鼠,留取血液做生化检测,取肾组织荧光显微镜下观察人脐带间充质干细胞植入实验动物体内后的分布情况。结果移植组大鼠,肾组织仅在肾小管中见到DAPI阳性细胞,而肾小球中为阴性,且肾小管上皮荧光从1d持续至4w仍可见,但强度有减弱的趋势。结论 HUCMSCs移植后仅在肾小管中分布,但不同时间点分布比较逐渐减低。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件,比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离单个核细胞+10%胎牛血清或MesencultTM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用MesencultTM培养基+10%胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

人脐带间充质干细胞治疗新生儿缺氧缺血性脑病的研究进展

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy, HIE)是导致新生儿脑损伤的一个重要原因,其主要的病理生理机制是缺氧和(或)缺血引起的葡萄糖和氧气供应不足,导致细胞能量代谢障碍,而随之而来的再灌注损伤会产生大量自由基进一步恶化脑代谢,最终导致神经元坏死或过度凋亡[1]。     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

人脐带间充质干细胞注射液治疗尘肺病的作用及机制研究

目的 观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)对二氧化硅所致大鼠肺损伤的治疗效果,探讨其治疗尘肺病的作用及机制。方法 将60只健康雄性SD大鼠随机分3组,分别为对照组、染矽尘组和HUCMSCs治疗组,染矽尘组和HUCMSCs治疗组大鼠建立尘肺模型,HUCMSCs治疗组于染尘后第1、14 d行尾静脉注射HUCMSCs1.0 mL(1×10⁶/mL)治疗,各组大鼠分别于染尘后第7、14、28、56 d随机选取5只大鼠行胸部CT检查、处死取材行肺组织HE染色以及检测抗核抗体(anti nuclear antibody,ANA)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、总免疫球蛋白(total immunoglobulin,TIG)、补体成分3(complement 3,C3)、补体成分4(complement 4,C4)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor Alpha,TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、白介素...     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在体外诱导培养分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性。方法采用成年人hMSCs传代培养2～3代,经条件培养液诱导培养后,进行形态学观察及MTT实验,RT-PCR分析,蛋白质印迹实验,茜素红染色方法分析细胞矿化作用,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,骨钙素(osteocalcin,OCN)、RUNX2和BMPR2的检测。结果 hMSCs细胞,在诱导培养条件下,细胞碱性磷酸酶ALP活性明显增高,并出现了矿化结节。经过体外成骨诱导的hMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征。在矿化期骨钙素mRNA OCN表达升高,RUNX2和BMPR2蛋白表达增高。结论 hMSCs易于体外分离培养及扩增,体外成骨定向诱导的hMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征,可以定向分化为成骨细胞。     

两种示踪技术在人脐带间充质干细胞治疗子痫前期大鼠模型中的应用

目的探讨含绿色荧光蛋白慢病毒(LV-GFP)和荧光染料四甲基-吲哚羧花青-高氯酸盐(CM-Di I)两种标记干细胞的示踪技术在人脐带间充质干细胞(HU-MSCs)治疗子痫前期(PE)大鼠研究中的应用。方法采用酶消化法分离培养HU-MSCs,分别以LV-GFP和CM-Di I标记HU-MSCs。建立脂多糖(LPS)诱导的PE大鼠模型,移植HU-MSCs后分别通过荧光显微镜和活体成像技术示踪HU-MSCs的分布。结果荧光显微镜下见LV-GFP标记的HU-MSCs分布于大鼠胎盘组织和肾脏组织中;胎鼠肾脏、肝脏、心脏和肺脏组织中未见分布。活体成像技术显示CM-Di I标记的HU-MSCs分布于大鼠胸腹部脏器及胎盘,而脐带及胎鼠内未见分布。结论 LV-GFP标记后荧光显微镜可显示最终HU-MSCs归巢并定位准确,CM-Di I标记后活体成像技术则可以观察活体内HU-MSCs分布变化。     

人脐血间充质干细胞预防博来霉素致大鼠肺纤维化效果

目的 探讨人脐血间充质干细胞(HUCBMSC)对博来霉素所致大鼠肺纤维化的预防性干预效果及可能机制.方法 取第2代HUCBMSC培养至第4代;取无特定病原体级5周龄雄性SD大鼠120只随机分为博来霉素组、干细胞干预组、地塞米松干预组和阴性对照组,每组30只.前3组分别经气管注入博来霉素建立肺纤维化模型,干细胞干预组造模后经鼠尾静脉注入5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记的HUCBMSC,地塞米松干预组造模后第1天开始连续腹腔注射地塞米松7d,阴性对照组经气管注入等体积生理氯化钠溶液,在第7、14、28天分别处死各组中的10只动物,肺组织行苏木精-伊红、马松三色染色,碱水解法测定肺羟脯氨酸的水平.结果 干细胞干预组第7、14、28天肺组织均可见Brdu标记的干细胞.3个时间点的博来霉素组肺羟脯氨酸水平呈逐渐升高的趋势,第28天达最高水平(P＜0.01).3个时间点干细胞干预组和地塞米松干预组的肺泡炎症及肺纤维化程度均分别较博来霉素组轻,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HUCBMSC可以定植于受损的肺组织中,并可能在肺纤维化早期有效减轻肺泡炎及肺纤维化.     

移植人脐带间充质干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤的两种方法比较

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)经颈静脉及经腹腔两种途径移植后在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠脑内的分布、分化情况,寻找简单易行且有效的移植途径。方法 RICE法制备7日龄新生大鼠HIBD模型,随机分组:HIBD组(n=10)、腹腔移植组(n=15)、颈静脉移植组(n=15),另随机取未造模的10只为正常对照组。造模后72h后分别对颈静脉移植组和腹腔移植组移植等量的hUCMSCs(1×106个/只),而HIBD组及正常对照组不移植。于移植后36d免疫荧光染色比较Dil标记的hUCMSCs移植后在各组大鼠脑中的分布情况;神经元前体细胞标记DCX特异性染色观察hUCMSCs移植后分化成神经元前体细胞的情况。结果移植后hUCMSCs能迁徙到脑组织中,能分化成神经元前体细胞。经颈静脉移植途径优于经腹腔移植(P0.01)。结论 hUCMSCs移植后可以在HIBD新生大鼠脑内存活,并向神经元前体细胞分化,对HIBD新生大鼠脑功能有修复作用,尤以经颈静脉移植明显。     

人脐带间充质干细胞联用神经节苷酯GM1治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤

目的 观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)移植及联用神经节苷酯GM1治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)的效果。方法 RICE法制备七日龄新生大鼠HIBD模型, 随机分为hUCMSCs移植组(n=15)、hUCMSCs+GM1组(n=15), 72 h后经颈静脉移植等量的hUCMSCs, hUCMSCs+GM1组再腹腔注射GM1, 两组均在移植后第31、32、33、34、35天用Morris水迷宫对两组大鼠行为学测试, 比较两组大鼠脑功能恢复情况。免疫荧光染色观察DiI标记的hUCMSCs移植后在两组大鼠脑中的分布情况;神经元前体细胞标记DCX特异性染色观察hUCMSCs移植后分化成神经元前体细胞的情况。结果 Morris水迷宫测试:hUCMSCs+GM1组逃避潜伏期明显短于hUCMSCs移植组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。移植后hUCMSCs能迁徙到脑组织中, 并分布于缺血区的小血管旁, 能分化成神经元前体细胞。hUCMSCs+GM1组大鼠脑片干细胞分布明显多于hUCMSCs移植组(P＜0.05)。结论 hUCMSCs移植对HIBD新生大鼠脑功能有修复作用, 联用GM1, 有协同作用。     

脐带多能干细胞与女性卵巢功能维护

卵巢作为女性的性腺,在女性体内负责生殖和内分泌的功能,卵巢功能障碍会严重影响女性生理和身心健康。干细胞能可分化成多种组织细胞,其在早衰卵巢的微环境下能“因地制宜”的分化为卵巢细胞,发挥卵巢细胞正常功能,维持卵巢的正常形态,防止卵巢萎缩变形。此外,干细胞再生的卵巢细胞可以对脑垂体分泌的促性腺激素做出及时、正确的反应,维护内激素水平处于平衡状态。     

脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的观察脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法抽取骨髓穿刺液10ml,采用含10％脐带血清的DMEM／F12培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系诱导BM—MSCs定向分化。结果BM—MSC—Ss高表达CD29、CD73、CD105,不表达CD34、CIM5、CD31,BM—MSCs体外能诱导为成骨细胞和脂肪细胞。结论脐带血清培养的BM—MSCs的具有较高的纯度和体外分化能力,脐带血清培养BM—MSCs适合临床应用。     

羟丙基甲基纤维素在脐血干细胞分离中应用

目的 探讨羟丙基甲基纤维素在人脐血间充质干细胞(MSCs)分离中应用的可行性及分离效果。方法 对脐血样本先用生理盐水稀释,然后分别加入3种不同沉降因子(羟丙基甲基纤维素,明胶和羟乙基淀粉),血液、生理盐水、沉降因子比例为2:1:3,混匀后静置至界面分层清晰时记录时间;用Percoll液对上清液进一步分离,计数回收MSCs量与存活数;将MSCs进行培养、传代,传到第3、20代及液氮冻存6个月后复苏再传至35代时用流式细胞仪检测CD44、CD90、CD105,CD34、CD45表达。结果 羟丙基甲基纤维素沉降红细胞速度最快,仅需15 min,明胶和羟乙基淀粉均需要30 min左右,差异具有统计学意义(P<0.05);0.1%~0.3%羟丙基甲基纤维素对脐血MSCs回收量在(6.24~6.72)×10⁶个/mL,高于4%~8%羟乙基淀粉对脐血MSCs回收量[(5.12~6.88)×10⁶个/mL)],明显高于0.3%~0.6%明胶对脐血MSCs回收量[(2.08~2.56)×10⁶/mL)],差异均具有统计学意义(P<0.05);羟丙基甲基纤维素回收MSCs的存活率最高,高于明胶和羟乙基淀粉,差异具有统计学意义(P<0.05);用羟丙基甲基纤维素分离、培养的MSCs传到第3、20代及液氮冻存6个月复苏后传到第35代,CD44、CD90、CD105表达均呈阳性,CD34、CD45表达呈阴性,符合干细胞表面标志特征。结论 羟丙基甲基纤维素可以用于脐带血MSCs分离(最适宜浓度为0.2%),效果优于常用的分离试剂明胶和羟乙基淀粉。     

骨髓间充质干细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的研究

目的体外分离培养人新鲜脐血（UCB）造血干细胞（HSC），利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合以扩增脐血造血干／祖细胞。方法采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子，检测脐血造血干／祖细胞总有核细胞（NC）总数和CD34^＋细胞数。结果有核细胞总数扩增（75．2±15．0）倍，CD34^＋细胞数扩增（18．7±12．3）倍。结论体外HSC培养，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子对造血干／祖细胞增殖有明显的作用。     

人脐血间充质干细胞移植联合mNGF治疗脑瘫大鼠的实验研究

目的研究经侧脑室内注入人脐血间充质干细胞(hUCB-MSCs)联合鼠神经生长因子(mNGF)对脑瘫大鼠治疗效果。方法采集足月新生儿脐带血100ml,分离、培养、纯化人脐血间充质干细胞并进行检测和鉴定。将七日龄SD大鼠100只随机分为正常组10只、实验组(缺血缺氧性脑瘫模型)90只,实验组随机分为5组:脑瘫模型组(CP组)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)移植组、mNGF移植组、hUCB-MSCs移植组及hUCB-MSCs联合mNGF移植组。造模成功后1周,将hUCB-MSCs、mNGF分别注入左侧侧脑室,假移植组注射PBS液,移植后第1周、2周、3周,观察5溴-2脱氧尿核苷(BrdU)标记的脐血MSCs的存活、迁移,移植后第4周,对每组大鼠的神经行为学能力进行评估并检测大鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达及观察脑组织的形态学变化。结果 1)人脐血MSCs主要分布在左侧侧脑室、额叶、顶叶皮质及白质,随时间进展,向四周脑组织转移,Brdu、NSE、GFAP阳性细胞逐渐减少,差异有统计学意义(P0.05);2)行为学评价:与模型组及假移植组比较,单移植组、联合移植组的足印潜伏期、迷宫逃避潜伏期缩短,足印重复间距及后足滑脱次数减小,联合移植组优于单移植组,差异有统计学意义(P0.05);3)HE染色:MSCs和mNGF单移植组大鼠细胞形态及脑组织结构破坏较脑瘫组有所改善;联合移植组恢复情况更好,细胞形态恢复较单移植组好。结论外源性脐血MSCs联合mNGF经侧脑室移植,可改善脑瘫大鼠的远期行为及脑损害。     

人羊膜间充质干细胞体外传代培养对染色体核型的影响

目的:分离培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)并进行体外长期传代培养,通过对连续传代的细胞形态、膜表面标志、增殖、分化特性以及染色体核型进行研究,以观察体外培养对该细胞的影响,为其储备和临床应用提供实验依据。方法:无菌条件下从新鲜人胎盘组织分离羊膜,采用组织贴壁法分离培养hAMSCs,并对原代细胞～P11代细胞利用流式细胞技术检测其膜表面标志物;取P3～P4代细胞向神经细胞和成骨细胞诱导,免疫组化染色、PCR检测基因表达情况;采用染色体G显带法制备染色体核型。结果:hAMSCs形态似长梭型,呈流水状生长,细胞活性高,冻存复苏后仍能保持正常形态,并可在体外稳定扩增,细胞生长曲线呈"S"型;细胞高表达CD90、CD73、CD44、CD105;细胞经诱导后可以向神经细胞和成骨细胞分化,神经元特异性烯醇化酶和成骨细胞矿化结节检测为阳性,PCR检测巢蛋白和骨桥蛋白基因表达为阳性;P3～P10代的hAMSCs染色体核型均为正常二倍体核型。结论:hAMSCs在体外经数代培养后能保持间充质干细胞的外显和遗传特性,并且未见染色体核型异常改变。     

脐带间充质细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定脐带间充质细胞（UMC）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法以逆转录病毒作为Sox2、KIf4、Oct4、c—Myc基因转移载体,将UMC细胞编程为iPS细胞。应用RT-PCR检测细胞基因表达量,鉴定外源编程基因是否整合到iPS细胞核内,分析细胞核型,对细胞进行碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色,体内分化畸胎瘤和体外分化拟胚体实验,对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态学上类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS与ES细胞内源多能基因（Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2）表达谱相类似,外源编程基因（Sox-2、KIf4、Oct-4、c—Myc）表达发生沉默。（3）外源编程基因已被插入到iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常,碱性磷酸酶活性增高,表达Es细胞特异性膜蛋白（SSEA3、SSEA4）,质蛋白（TRA-1-60、TRA-1—81）,核蛋白（Nanog）。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤,在体外能分化为拟胚体。结论iPS细胞类似于Es细胞具有多向分化潜能。