人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

无机砷暴露对人脐带间充质干细胞的增殖及分化的影响

目的 探究无机砷(iAs)暴露对人脐带间充质干细胞的增殖及分化的影响,为iAs的发育毒性研究提供实验依据。方法 以具有多向分化潜能的人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)为细胞模型,用不同浓度的亚砷酸盐(NaAsO₂)染毒hUCMSCs 24 h,检测细胞活力;用5μmol/L的NaAsO₂染毒hUCMSCs 24 h,做细胞生长情况检测、多能性标志蛋白CD45、CD105及多能性标志基因Oct4、Nanog的检测,彗星实验检测DNA损伤情况、细胞分化实验检测;染毒后hUCMSCs的向成脂、成骨和成软骨分化及其特异性基因PPARγ、ALP、COMP表达量的检测。采用独立样本t检验进行两组间均数差异的比较,采用单因素方差分析进行多组间均数的比较。结果 随着NaAsO₂浓度的升高,hUCMSCs存活率逐渐降低(F=13.650,P<0.001);5μmol/L的NaAsO₂染毒hUCMSCs,对其细胞增殖的没有显著影响(t=0.507,P=0.615);多能性标志蛋白CD45、CD105仍有表达,多...     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件,比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离单个核细胞+10%胎牛血清或MesencultTM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用MesencultTM培养基+10%胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件．比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞＋10％胎牛血清或Mesencuit^TM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用Mesencult^TM培养基＋10％胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

不同培养方法对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的探讨酶消化法和组织块法是否影响牙周膜细胞的特性。方法培养牙周膜细胞,检测克隆形成能力及细胞周期分析,Stro-1的表达,实时定量RT-PCR检测。结果酶消化法培养的PDLCs+G2M明显高于组织块法的PDLC;酶消化法培养的PDLC克隆形式能力明显高于组织块法培养的PDLC;酶消化法培养的PDLC Stro-1的表达明显高于组织块法培养的PDLC;酶消化法培养的PDLC成骨标志物的表达明显高于组织块法培养的PDLC。酶消化法培养的牙周膜细胞具有更强的增殖能力和间充质干细胞含量更多,成骨标志物表达更强。结论酶消化法和组织块法影响牙周膜细胞的某些特性。     

人羊膜间充质干细胞体外传代培养对染色体核型的影响

目的:分离培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)并进行体外长期传代培养,通过对连续传代的细胞形态、膜表面标志、增殖、分化特性以及染色体核型进行研究,以观察体外培养对该细胞的影响,为其储备和临床应用提供实验依据。方法:无菌条件下从新鲜人胎盘组织分离羊膜,采用组织贴壁法分离培养hAMSCs,并对原代细胞～P11代细胞利用流式细胞技术检测其膜表面标志物;取P3～P4代细胞向神经细胞和成骨细胞诱导,免疫组化染色、PCR检测基因表达情况;采用染色体G显带法制备染色体核型。结果:hAMSCs形态似长梭型,呈流水状生长,细胞活性高,冻存复苏后仍能保持正常形态,并可在体外稳定扩增,细胞生长曲线呈"S"型;细胞高表达CD90、CD73、CD44、CD105;细胞经诱导后可以向神经细胞和成骨细胞分化,神经元特异性烯醇化酶和成骨细胞矿化结节检测为阳性,PCR检测巢蛋白和骨桥蛋白基因表达为阳性;P3～P10代的hAMSCs染色体核型均为正常二倍体核型。结论:hAMSCs在体外经数代培养后能保持间充质干细胞的外显和遗传特性,并且未见染色体核型异常改变。     

大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞成骨分化比较的体外研究

目的对骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞（AMscs）成骨能力进行比较。方法采用钙钴法染色、四环素荧光标记、Ⅰ型胶原染色、茜素红染色、碱性磷酸酶测定，比较脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞成骨能力。结果两种细胞诱导3周后，茜素红染色出现淡红色钙结节；四环素荧光染色出现明亮黄色荧光钙结节。改良钙钴法染色，细胞胞浆中出现黑色颗粒。结论（1）AMSCs向成骨诱导后，可表达Ⅰ型胶原、ALP，并出现钙结节。（2）AMSCs经过诱导后，可向成骨细胞方向分化。     

两种方法分离新生大鼠颅骨成骨细胞纯度和活性的比较

目的比较预消化组织块培养法与传统组织块培养法分离的新生大鼠颅骨成骨细胞纯度和活性的差异。方法无菌条件下取新生大鼠颅骨骨片,分传统法和预消化法进行培养。预消化法先以0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA预先消化,再按传统组织块培养法培养,观察细胞移出时间,采用Gomori钙钴法对原代细胞及纯化后细胞进行鉴定,对比两种方法获得的成骨细胞纯度。并测定第1、2代成骨细胞培养第10d胞浆内碱性磷酸酶活性。结果预消化法约第3d开始细胞自骨片移出,传统法约第5d开始细胞移出。两种方法分离的原代细胞碱性磷酸酶染色阳性率分别为(87.83±2.34)%以及(82.88±3.14)%,差异有统计学意义(P<0.05)。纯化后成骨细胞染色阳性率分别为(90.71±3.15)%以及(90.17±2.97)%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法获得的第1、2代成骨细胞培养第10d碱性磷酸酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论预消化组织块培养法细胞移出时间早,且所分离的原代细胞中成骨细胞纯度高。经纯化后成骨细胞纯度和活性与传统组织块培养法相似。     

4种不同方法培养小鼠阴道粘膜干细胞的比较

目的探讨4种不同方法体外分离、培养小鼠阴道粘膜干细胞(VMSCs)所得结果的差异,确定最适合体外培养VMSCs的方法。方法选择组织块培养法、胰酶消化培养法、胶原酶消化培养法、胰酶和胶原酶混合培养法对小鼠VMSCs进行原代培养,并通过HE染色、SP免疫组化法鉴定VMSCs,分析4种方法的优劣。结果 4种培养法中,胶原酶消化培养法细胞生长很差,无法得到VMSCs;组织块培养法培养时间较长,培养出的细胞包含成纤维细胞较多;单纯胰酶消化培养法,可获取较单一的VMSCs,但细胞活性相对较差;只有胰酶、胶原酶混合培养法,在适当的比例和浓度时,可发挥最佳作用,获取数量多、较纯的VMSCs。且经HE染色、免疫组化法鉴定结果均显示培养出的细胞即是VMSCs。结论 4种方法中有3种体外分离培养VMSCs的方法,均可得到VMSCs,其中以胰酶、胶原酶混合培养法效果最佳。     

移植人脐带间充质干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤的两种方法比较

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)经颈静脉及经腹腔两种途径移植后在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠脑内的分布、分化情况,寻找简单易行且有效的移植途径。方法 RICE法制备7日龄新生大鼠HIBD模型,随机分组:HIBD组(n=10)、腹腔移植组(n=15)、颈静脉移植组(n=15),另随机取未造模的10只为正常对照组。造模后72h后分别对颈静脉移植组和腹腔移植组移植等量的hUCMSCs(1×106个/只),而HIBD组及正常对照组不移植。于移植后36d免疫荧光染色比较Dil标记的hUCMSCs移植后在各组大鼠脑中的分布情况;神经元前体细胞标记DCX特异性染色观察hUCMSCs移植后分化成神经元前体细胞的情况。结果移植后hUCMSCs能迁徙到脑组织中,能分化成神经元前体细胞。经颈静脉移植途径优于经腹腔移植(P0.01)。结论 hUCMSCs移植后可以在HIBD新生大鼠脑内存活,并向神经元前体细胞分化,对HIBD新生大鼠脑功能有修复作用,尤以经颈静脉移植明显。     

人脐带间充质干细胞联用神经节苷酯GM1治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤

目的 观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)移植及联用神经节苷酯GM1治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)的效果。方法 RICE法制备七日龄新生大鼠HIBD模型, 随机分为hUCMSCs移植组(n=15)、hUCMSCs+GM1组(n=15), 72 h后经颈静脉移植等量的hUCMSCs, hUCMSCs+GM1组再腹腔注射GM1, 两组均在移植后第31、32、33、34、35天用Morris水迷宫对两组大鼠行为学测试, 比较两组大鼠脑功能恢复情况。免疫荧光染色观察DiI标记的hUCMSCs移植后在两组大鼠脑中的分布情况;神经元前体细胞标记DCX特异性染色观察hUCMSCs移植后分化成神经元前体细胞的情况。结果 Morris水迷宫测试:hUCMSCs+GM1组逃避潜伏期明显短于hUCMSCs移植组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。移植后hUCMSCs能迁徙到脑组织中, 并分布于缺血区的小血管旁, 能分化成神经元前体细胞。hUCMSCs+GM1组大鼠脑片干细胞分布明显多于hUCMSCs移植组(P＜0.05)。结论 hUCMSCs移植对HIBD新生大鼠脑功能有修复作用, 联用GM1, 有协同作用。     

脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的观察脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法抽取骨髓穿刺液10ml,采用含10％脐带血清的DMEM／F12培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系诱导BM—MSCs定向分化。结果BM—MSC—Ss高表达CD29、CD73、CD105,不表达CD34、CIM5、CD31,BM—MSCs体外能诱导为成骨细胞和脂肪细胞。结论脐带血清培养的BM—MSCs的具有较高的纯度和体外分化能力,脐带血清培养BM—MSCs适合临床应用。     

脐血干细胞培养过程中有核红细胞数量变化的实验研究

目的:对脐血干细胞进行液体和半固体细胞培养观察、记录有核红细胞增殖情况。方法:对脐血干细胞进行液体和半固体细胞培养,用流式细胞仪观察、记录有核红细胞增殖情况。结果:脐血液体培养经流式细胞仪检测,NRBC得率最大为20.0%,平均7.3%。结论:脐血干细胞培养可以获得较高的NRBC含量。     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的优化

目的探索脐血来源的间充质干细胞体外分离培养的更优方法。方法无菌条件下抽取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。50份脐血分为对照组和改良组,每组25份,分别以1.5×10^7/ml的细胞密度接种于25 cm^2培养瓶中。对照组贴壁3 d后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液;改良组贴壁0.5 h后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液。结果对照组杂细胞较多,最终成功培养出8份脐血间充质干细胞;改良组杂细胞较少,最终成功培养出18份脐血间充质干细胞。经流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,所培养出的脐血间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论采取脐血单个核细胞贴壁0.5 h弃上清更换新鲜培养液可以明显提高脐血间充质干细胞的培养成功率,其结果优于脐血单个核细胞贴壁3 d弃上清更换新鲜培养液。