基因变构人白细胞介素-2克隆构建和原核表达

目的构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏并将其在原核系统中进行高效表达,为研究基因变构IL-2穴88N→R雪的生物学活性奠定基础。方法分离人体T细胞经PHA刺激活化后,提取细胞的RNA为模板,逆转录构建cDNA文库,经套式PCR扩增出编码IL-2的基因,插入T-A载体后获得编码天然IL-2的克隆,核苷酸测序证实成功后,自行设计含有突变位点的引物,利用重组PCR技术,进行定点诱变构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏DNA测序确认变构成功。将改构后的IL-2基因重组于原核pGEX-4T-2质粒上,转化宿主菌E.coli.DH5α中,经IPTG诱导后表达IL-2变构体,表达产物经SDS-PAGE电泳分析。结果获得了人类天然IL-2的编码基因克隆和基因变构IL-2的编码基因克隆,并将变构IL-2穴88N→R雪在大肠杆菌中获得了高效表达。结论IL-2基因的成功定点变构及其在原核生物中获得稳定高效的表达,为进一步在真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2药物奠定基础。     

提高天然人白细胞介素-2效价的研究

由不同浓度的植物血凝素(PHA)、羧甲基茯苓多糖(CMP)、葡萄糖酸钙组成的复合诱生剂刺激人外周血单个核细胞(PBMC)产生的白细胞介素-2(IL-2)比单独用PHA刺激产生的IL-2活性高.诱生时间采用24h预温,然后37℃、5%CO_2旋转培养36～48h,可使产生的IL-2效价比单用PHA刺激48h提高15倍左右.这种复合诱生剂诱生的IL-2经临床使用,证实安全、有效.临床未发生明显副作用.37例恶性肿瘤IL-2治疗组总缓解率86.5%.比非IL-2治疗37例恶性肿瘤组总缓解率62.2%差异显著.     

提高重组人白细胞介素-2得率的研究

目的提高重组人白细胞介素- 2 (rhIL- 2 )的得率。方法用-2 巯基乙醇将rhIL- 2纯化过程中收集的二聚体和错配体还原,重新氧化复性。结果得到具有生物活性的rhIL- 2 ,使rhIL 2的得率由原来的4 0 %左右提高到6 0 %以上。结论显著提高了rhIL- 2的得率,重复实验结果稳定可靠     

双抗体夹心法测定注射用重组人白细胞介素-2的含量

目的:建立用双抗体夹心法(ELISA 法)测定注射用重组人白细胞介素-2的含量。方法:采用酶标仪在450 nm 处测量白细胞介素-2复合物的 A_(450nm)值,并计算重组人白细胞介素-2冻干粉的百分含量。结果:白细胞介素-2浓度在31.25～500 pg·mL~(-1)范围内线性关系良好(r=0.9999);低、中、高3种浓度的回收率分别为97.3%,98.4%,101.4%,RSD 均小于5.0%。质量控制符合要求。精密度在误差许可范围内。注射用重组人白细胞介素-2的含量为49.55μg·mg~(-1)。结论:方法准确、可靠,注射剂辅料对测定无干扰,可用于注射用重组人白细胞介素-2的含量测定。     

重组人白细胞介素-2提高收率的研究

目的：通过重组人白细胞介素-2较大规模纯化工艺中改变包涵体提取过程部分条件的研究，旨在获得大量的高纯度原液。方法：采用高性能分散机溶解包涵体；延长包涵体沉淀的时间等方法，纯化后的原液测定电泳纯度、等电点、宿主菌蛋白残留量等指标。结果：纯化收率达到2g/Kg菌以上，质量指标达到标准规定。结论：本研究对较大规模纯化工艺中实现高产率有重大意义。     

复方白细胞介素-2长循环脂质体的制备及其质量控制

目的:对复方白细胞介素-2(IL-2)长循环脂质体的制备方法及其质量控制进行研究.方法:用氯仿注入合并硫酸铵梯度法制备复方白细胞介素-2长循环脂质体.用紫外-Sephadex法测定脂质体中猪苓多糖的含量和包封率;用酶联免疫法(ELISA)测定IL-2的含量和包封率.结果:长循环脂质体中猪苓多糖和IL-2的含量分别为4.02 g·L-1和1 215 IU·mL-1;猪苓多糖和IL-2的包封率分别为35.5%和33.2%.结论:用氯仿注入合并硫酸铵梯度法可制得包封率高的脂质体.紫外-Sephadex法可用于测定猪苓多糖的含量和包封率,酶联免疫法可用于测定IL-2的含量和包封率;方法简便易行,准确度高,重现性好.     

干扰素α(IFN-α)和白细胞介素2(IL-2)联合应用预防肾癌根治术后复发和转移的远期效果评价

目的研究干扰素α和白细胞介素2联合应用对预防肾癌根治术后复发和转移的远期效果评价。方法针对在我院2006年3月份到2012年2月份接受治疗的200例肾癌根治术患者,根据术后具体治疗方法的不同进行分组,分别分为Ⅰ组(123例)和Ⅱ组(77例)。然后对两组采用不同的方法进行治疗,Ⅰ组采用干扰素α和白细胞素2联合的方法,Ⅱ组则只实行根治术。结果Ⅰ组患者CD4+高于Ⅱ组患者,CD4+/CD8+高于Ⅱ组,CD8+低于Ⅱ组。Ⅰ组患者三期2年生存率与二、三期4年生存率均高于Ⅱ组。结论干扰素α和白细胞2联合应用能恢复肾癌根治术后患者的免疫功能,增强机体抵抗肿瘤的免疫功能,有效减少复发率,提高了患者的生存率。     

基因重组人白细胞介素-2在小鼠的药物动力学和分布(英文)

lodogen法制备~(125)I-rlL-2,放射纯度95％,ⅳ后快速、慢速分布和消除T_(1/2)分别为<2,30—120和6—15h,AUC与剂量呈正比,血尿原药占81±13％,im生物利用度0.57,ⅳ后15min浓度顺序为肝>胆汁>肾>血>肾上腺>>血浆>肺>甲状腺>脾>小肠>肠系膜淋巴结>肠内容>卵巢>心>膀胱>胸腺>粪>肌肉>>睾丸>脑>脂肪,24 h排出80％第2天5％。     

枸杞子多糖对小鼠白细胞介素-2活性的增强作用(英文)

本文研究了中药枸杞子的提取物枸杞子多糖(LBP)对成年(2月龄)和老年(16月龄)小鼠脾白细胞介素-2(IL-2)活性的影响。在诱导脾细胞IL-2的培养液(脾细胞5×10~6/ml和ConA 4μg/ml)中加入LBP,所制备的含IL-2上清液使成年小鼠胸腺细胞在体外增殖活性([~3H]TdR参入法)升高。老年小鼠IL-2促进淋巴细胞增殖水平显著低于成年。LBP可使老年小鼠IL-2的这种作用显著提高,达成年水平。这些结果表明,LBP对IL-2的活性有增强作用并使老年小鼠IL-2活性得到恢复。     

两步法合成(S)-1-(2-氯乙酰基)-2-腈基吡咯烷的工艺研究

目的 研究(S)-1-(2-氯乙酰基)-2-腈基吡咯烷的合成工艺.方法 L-脯氨酸与氯乙酰氯通过N-乙酰化得到(S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲酸,然后加入脲素和氨基磺酸实行分段保温反应得到产物(S)-1-(2-氯乙酰基)-2-腈基吡咯烷.结果 此路线所得产品收率为75.5％.结论 此工艺路线条件温和、操作简便、原料价廉易得.     

重组复合干扰素摇瓶发酵条件的研究

目的对表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coli DH5α的摇瓶发酵条件进行研究。方法利用单因素比较实验及正交试验等方法考查工程菌摇瓶发酵条件,探讨发酵条件对工程菌的生长和con-IFN表达的影响。结果优化后条件为培养基含玉米粉6%、牛肉膏5.5%、谷氨酸钠0.5%,发酵液初始pH 7.2,30℃培养7 h后升温至42℃诱导表达6 h,转速220r/min,装样量10%,接种量2%。结论优化后平均蛋白质表达量达到36.39%,和LB培养基相比,目的蛋白质表达量提高了4.8%,为工程菌的大规模发酵提供参考。     

表达GST-NK4工程菌的发酵工艺研究

目的建立重组GST NK4融合基因工程菌的发酵工艺。方法采用摇瓶、发酵罐发酵,对影响工程菌生长和表达的条件如pH值、诱导时间及诱导剂浓度等进行优化。结果根据优化的条件,15L发酵罐发酵11h ,菌体收获量可达到湿重(2 4 .6±0 .98)g/L ,目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的5 0 %左右。结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺     

重组人血管生长素基因工程菌发酵条件的初步研究

目的研究表达重组人血管生长素 (rhANG)工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵 ,研究不同宿主菌对表达rhANG的影响 ,同时对培养基、诱导时期、诱导时间和初始pH等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果选用E .coliCDH为宿主菌 ,在SOB培养基中培养至A6 0 0nm 为 0 .5～ 0 .6时 ,诱导表达 5h ,rhANG表达量最高达 30 %。重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论此发酵条件可以较好地提高rhANG的表达量 ,为发酵规模的扩大奠定了基础     

重组人白细胞介素21表达条件的探讨

目的探讨重组人白细胞介素21工程菌诱导表达的最佳条件。方法用摇瓶发酵的方法探索不同诱导条件(诱导温度、诱导时间、接种量I、PTG浓度等)对目的蛋白质表达的影响。结果该工程菌表达目的蛋白质的最佳温度是42℃;高密度接种更有利于目的蛋白质的表达。结论建立了BL21/pET-30a(+)-IL21工程菌最佳诱导表达条件,为重组人白细胞介素21的制备奠定了基础。     

重组人乙型肝炎病毒核糖核酸酶H基因工程菌发酵条件的初步研究

目的研究表达乙型肝炎病毒核糖核酸酶H1及H2 (HBV -RNaseH1及H2 )工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵,研究不同宿主菌表达HBV- RNaseH1及H2的效果,同时对培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH值等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果选用EcoliBL2 1为宿主菌,在LB培养基中培养至A60 0nm为0 .6时,诱导表达4 .5h ,HBV- RNaseH1及H2表达量最高达33.6 %和30 .8%。且重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论此发酵条件可以较好地提高HBV- RNaseH1及H2的表达量,为发酵规模的扩大奠定基础     

重组人白细胞介素15工程菌高密度发酵条件探讨

目的研究表达重组人白细胞介素15(rhIL-15)工程菌高密度发酵的条件。方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白质表达的因素进行优化。结果以甘油为碳源可明显抑制有害物质乙酸的积累,提高工程菌的表达量和收获率。高密度发酵明显提高了目的蛋白质的表达量和工程菌的产量。结论该发酵工艺大大提高了rhIL-15工程菌的产量和表达水平,为rhIL-15的规模化生产打下了基础。     

重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化表达重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)工程菌的高密度发酵条件。方法考察培养基以及诱导时机、诱导剂量和诱导时间对蛋白表达的影响;用自控发酵罐进行分批补料培养实验,确定优化工艺条件。结果以2×YT+0.5%葡萄糖为发酵培养基,经0.8 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导5 h,通过pH-stat反馈补料方式实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每1 L发酵液收获干菌体50.1 g,IGF-Ⅰ含量达5.25 g/L。结论建立了IGF-Ⅰ工程菌优化的高密度发酵工艺,为IGF-Ⅰ的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

重组Pichia pastoris的发酵条件初步研究

在摇瓶中进行重组Pichia pastoris菌株SIBAS 5071发酵条件的研究,考察了碳源、底物、pH、磷酸盐浓度、溶氧量等对该菌细胞生长和产生S-腺苷甲硫氨酸(sAM)的影响,初步确定的优化条件下发酵3 d后,SAM产量可达2.3 g/L(118 mg/g干细胞).     

人血管生长素重组大肠杆菌发酵条件优化

考察了Mg^ 、Ca^ 、NH^ 4、PO^3-4-等无机离子、初始pH、装液量以及诱导前添加葡萄糖对重组大肠杆菌表达rhANG和菌体生长的影响。经过优化，rhANG表达量提高约39％，菌体干重达1．59g／L，为工程菌发酵的扩试提供了参考。     

毕赤酵母工程菌高密度发酵肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的研究重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)巴斯德毕赤酵母工程菌发酵工艺。方法首先用摇瓶对工程菌的甲醇诱导周期、甲醇浓度、pH进行研究 ,在此基础上 ,采用 5L发酵罐补料培养进行中试研究。结果人可溶性TRAIL巴斯德毕赤酵母菌在pH 6 .0、甲醇诱导浓度 1%的条件下诱导 96h ,目标蛋白质浓度最高 ,可达 72 .8mg/L。 5L发酵罐培养放大 ,可以达到 184mg/L。结论此发酵工艺可以较好地提高人可溶性TRAIL工程菌的分泌表达。