首例中国株乙型肝炎病毒D基因型全序列测定及分析

目的　测定并分析１例中国慢性无症状携带者感染的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｄ基因型的全基因序列。方法　用聚合 酶链式反应（ＰＣＲ）扩增ＨＢＶ全基因,将ＰＣＲ产物克隆后对其进行核酸序列分析并与已发表的ＨＢＶ毒株全序列进行 同源性比较;对 ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的３０株ＨＢＶ Ｄ基因型毒株的全序列进行系统进化树分析。结果　该病毒全基因长 ３１８２ｂｐ,为ａｙｗ亚型,Ｄ基因型;此毒株全基因ＧｅｎＢａｎｋ　ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ为ＡＦ２８０８１７;与ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的ＨＢＶＤ 基因型全序列同源性为９８．３％～９４．5％,与已发表的 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ和Ｇ基因型全序列同源性均小于８９．５％。结论　首例中 国株 ＨＢＶ Ｄ 基因型全序列与源于瑞典的四株 ＨＢＶ Ｄ 基因型全基因的进化距离最近。     

应用多重PCR法对广东地区HBV进行基因型（A—F）分型

目的：建立乙型肝炎病毒（HBV）基因型（A－F）多重PCR分型方法，并利用该方法对广东地区HBV PCR阳性血清进行分型。方法：将GenBank中114例HBV全序列进行比较分析，找出每种基因型相对于其他五种基因型的独特序列，并根据这些独特序列设计出六对分别针对A－F基因型的特异引物，利用这六对引物建立HBV的多重PCR分型法，结果：多重PCR与以前用PCR－限制温度长度多态型分析法的分型结果一致。对广州周边地区HBV携带者的初步分型结果显示，主要为B型和C型，分别占45．00％和38．75％，另外还有16．25％的D型，结论：用多重PCR分别法准确易行，灵敏性高，便于推广应用。     

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立

目的建立实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型B～D方法并验证其准确性。方法比较GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列，设计特异的组合引物探针，应用实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法对兰州地区128例慢性乙型肝炎患血清标本进行基因型B、C、D检测，并随机对检测的基因型各3株标本进行S基因测序验证。结果128例标本中B型检出率为20.3％(26／128)，C型71．9％(92／128)，D型7．8％(10／128)：18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。结论实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型，适宜用于HBV基因型的大规模临床和流行病学调查。     

一株鸭乙型肝炎病毒DHBV全基因的克隆和序列分析

目的 从本地樱桃谷鸭血清中克隆鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA，并进行序列分析。方法 用PCR扩增HBV全基因．连接至T载体上，挑选克隆进行测序分析，与GenBank中16株：DHBV全基因组进行同源性比较，并进行分子进化树分析。结果 24-18与16株DHBV基因组比较，核苷酸同源性介于89．4%-99．3％之间，各开放阅读框氨基酸同源性比较显示差异显地方位于P区。结论 24-18属于DHBV西方基因型中的一个亚型。     

一株输血传播病毒新变种的克隆和序列分析

目的：从1例不明原因转氨酶升高的病人血清中克隆输血传播病毒（TTV）DNA，并进行序列分析。方法：用巢式PCR扩增TTVDNA长片段，连接至pGEM-T载体上，挑选一个克隆（56－B）进行测序，将56－B与GenBank中五株TTV进行氨基酸和核苷酸序列的同源性分析，并用最大似然法进行分子进化分析。结果：56－B株与TA278等五株TTV序列的核苷酸同源性分别为42．4％，48．2％，47．9％，61．7％，氨基酸序列的同源性更低，但其5'，和3'两端非编码区的序列仍然很保守。结论：56－B株与其他TTV株之间的同源性很低，有很高的基因异质性，是TT的一个新变种，代表TTV的一个新的基因型。     

中国大陆柯萨奇病毒A组16型全基因参照序列的初步建立和分析

目的建立中国大陆柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)流行株的全基因参照序列。方法从GenBank中获得CoxA16中国大陆分离株的所有全基因序列和氨基酸序列,用DNAstar/MegAlign软件对所得序列进行多序列比对和进化分析,按照参照序列标准拟定CoxA16的全基因参照序列和氨基酸序列,并与参考序列进行比对分析。结果中国大陆分离的CoxA16毒株全基因序列共8株,分离于2005-2009年,其中2008年5株,广东省5株;通过序列比对获得了大陆CoxA16全基因和氨基酸参照序列;参考毒株间核苷酸序列同源性介于79.0%～98.8%,氨基酸序列同源性为94.3%～99.9%,与参照序列的核苷酸同源性为79.7%～97.0%,氨基酸同源性介于95.1%～99.5%之间,同源性最低的为2008年安徽阜阳的FY18株。结论比对分析了中国大陆CoxA16毒株全序列,成功建立了中国大陆CoxA16全基因和氨基酸参照序列。     

广东地区乙肝病毒基因型B及血清型adw2流行株参照序列的建立

目的建立广东地区乙型肝炎病毒流行株全基因参照序列。方法测定16例慢性无症状HBV携带者HBV基因组全序列，应用同源性分析及对齐比较等方法确定基因型和血清型，并选相同基因型和血清型的HBV全基因建立参照序列。结果10例基因型B／血清型adw2、4例基因型C／血清型adrq＋、2例基因型C／血清型adw2；相同基因型和血清型HBV各序列间X基因差异最大，不同亚型间C基因差异最小；建立的广东地区基因型B／血清型adw2乙型肝炎病毒流行株参照序列与根据GenBank中我国不同地区相同亚型HBV全序列建立的标准参照序列相比仅有两个核苷酸的差异，引起X基因一个氨基酸不同。结论初步建立了广东地区乙型肝炎病毒基因型B／血清型adw2流行株全基因参照序列，为研究本地区乙肝病毒基因变异奠定基础。     

唐山市流行性腮腺炎病毒小疏水蛋白基因序列分析

目的 探讨唐山市流行性腮腺炎病毒的分子特征。方法 收集唐山市不同行政区的流行性腮腺炎患儿唾液标本5份，其中，爆发病例2例，散发病例3例。经RT-PCR扩增小疏水蛋白（SH）基因并测序，利用Clustal X软件进行系统发育分析。结果 唐山市分离的5株流行性腮腺炎病毒均为F亚型。各株病毒SH基因的核苷酸序列一致率为94．8％～100．0％，氨基酸序列一致率为91．4％～100.0％，但与国内主要野毒株SH基因的氨基酸序列一致率只有80．7％。系统发育分析显示，唐山市的各样本之间同源性较高．其次是国内的野毒株。而与国外野毒株及疫苗株同源性低。结论 唐山市存在多种流行性腮腺炎病毒株流行，主要基因型为F亚刑。     

肾综合征出血热患者流产胎儿分离毒株84FLi的全基因序列分析

目的：克隆和测定汉滩病毒疫苗生产株84FLi的全基因组序列,了解其分子基础。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）,分节段扩增84FLi株L、M和S基因片段的cDNA,直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果：84FLi株L、M、S3个片段的全基因组序列为6533,3616和1688个核苷酸,分别编码2151,1135,429个氨基酸。A、C、G、T4种核苷酸分别为3830,2050,2510和3447个,GC含量为38．52％,AT含量为61．48％。序列同源性分析表明84FLi株与分离自广州的RG9株和分离自安徽的Chen4株高度同源。S片段核苷酸的同源性99．6％。与HTNV的国际标准毒株76－118的3个片段核苷酸同源性分别为83．7％、84．0％和87．2％,氨基酸同源性分别为97．5％、96．0％和97．9％。结论：84FLi株属于汉滩型病毒,并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高,与中国株Chen4株和RG9株属于同一亚型。     

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。     

新疆2011-2013年肠道病毒71型VP1区基因特征分析简

目的了解新疆肠道病毒71型（EV71）分离株VP1区基因特征。方法选取2011-2013年新疆部分地州手足口病病例标本,临床标本或其病毒培养物经实时荧光PCR鉴定后,通过RT—PCR法进行VP1区编码基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,所得序列用ChromasPro1．7．4,BioEdit7．1．11和MEGA5．1软件进行序列校正、拼接、整理和分析,并与EV71各型及亚型参考序列构建基于VPl序列的系统进化树。结果新疆EV71分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性在92．8％～100．0％和97．9％～100．0％,22株病毒株与安徽阜阳和山东临沂C4a基因参考株最为相近,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在93．9％～98．6％和98．6％～99．6％。而与A、B基因型参考株差异较大,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在82．1％～84．8％和95．9％～98．3％。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定的阳性率为30．0％,低于用病毒培养物的阳性率（100．0％）。结论2011—2013年新疆EV71分离株均为C4a基因型,与安徽和山东分离的EV71毒株可能有相同的起源。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定可用于肠道病毒的分型鉴定。     

1株抗肝肿瘤新城疫病毒溶瘤株F基因的克隆和测序

目的对我们发现的1株高效抗肝肿瘤新城疫病毒溶瘤株的F基因进行扩增、序列测定和分析。方法RT—PCR扩增F基因片段,序列测定后与国际标准株弱毒株La Sota、B1及强毒株HER33、ITA／45、TEX／48、JS206WD、YG03的F基因比较研究,并对这株病毒F蛋白分子结构的疏水性、抗原表位及进化树分析。结果扩增出的F基因片段核苷酸长度为1656bp,单一的开放读码框编码552个氨基酸,其核苷酸序列与以上7种NDV的F基因同源性分别为：87．1％、87．5％、91．4％、91．7％、87．5％、90．7％、92.4％,氨基酸序列同源性为：90．2％、89．7％、94．9％、93．8％、90．8％、94．4％、95．5％。F基因裂解位点的氨基酸序列为112R—R—Q—K—R—F117,与所有强毒株在这一区域的序列（112R／K—R—Q—K／R—R—F117）相符,疏水性与抗原表位均与强毒株相似,进化树分析属于基因Ⅵ型。结论推测新发现的1株高效抗肝肿瘤新城疫病毒为NDV基因Ⅵ型强毒株。     

7型腺病毒温州株基因组主要序列的克隆与分析

目的：克隆和分析7型腺病毒温州株（Ad7wz1）基因组主要序列ITR、E1A261R、E1B55kDa、Hexon和E3。方法：分离并提取了Ad7wz1基因组DNA,PCR扩增得到各基因后利用PMD18 simple T载体进行克隆,并测序分析。结果：获得Ad7wz1 ITR-L、E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3和ITR-R六个基因的克隆,并测得核苷酸序列;分析表明其核苷酸序列和相应的氨基酸序列与GenBank上已发表的Ad7全基因组序列比较同源性分别达到93.2%～100%和97.8%～100%。结论：初步确定本次分离的Ad7wz1毒株为Ad7d2型,Ad7wz1与已经发表的Ad7病毒株序列有高度同源性,为研究Ad7的致病机制提供了重要的理论基础。     

广州地区HCMV临床病毒株UL137基因的结构特征与多态性

【目的】研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代分离株UL137基因的结构特征与基因多态性。【方法】从62份被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离获得3株低传代临床病毒株，经多重PCR鉴定后分别命名为HCMVD2、D3和D52。对3株临床分离株进行HCMVUL137基因全序列PCR扩增，PCR产物纯化后进行基因克隆，构建HCMVUL137-pMD18-T重组质粒；基因测序；将HCMVUL137基因序列呈报GenBank，并进行基因生物信息学分析。【结果】成功从广州地区新生儿感染HCMV患儿体内分离3株HCMV临床病毒株。克隆测序后呈报GenBank并被收录，收录序列号分别为：DQ180388、DQ180376、DQ180360。通过序列分析，结果显示低传代分离株UL137基因DNA序列高度保守，同源性在96．91％～100％之间．其变异均为碱基替换：编码蛋白均由96个氨基酸残基组成，同源性在90．63％～100％之间，超半数的变异发生在第61～81位氨基酸残基之间：编码蛋白翻译后修饰位点包括PKS、MYS、cAMPs三类，其中4个PKS和44～49位的MYS高度保守，cAMPs位点仅在5株病毒出现；编码蛋白等电点在11．50～12．00之间，呈强碱性。【结论】广州地区临床低传代分离株HCMVUL137基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列极为保守，但仍存在-定多态性。提示HCMVUL137ORF可能是-个具有重要功能的基因。     

2009年肠道病毒71型广州分离株的全基因组序列分析

目的分析2009年肠道病毒71型广州分离株GZHY09的全基因组序列,并与GenBank中的序列进行分析比对。结论从GenBank上选不同地区的EV71全基因组序列,设计相互重叠的覆盖病毒整个基因组序列的12对引物,采用RT-PCR扩增出12个基因片段,通过测序获得全基因组序列,并参考国内外各EV71基因型的分离毒株,用MEGA4软件进行进化树分析,用DNAStar软件中的MegAlign进行同源性分析。结果 12个重叠基因片段序列拼接获得EV71全基因组序列,共7404个核苷酸,同源性分析结果表明在VP1区,GZHY09株与中国大陆的Anhui08、Zhejiang08、Shenzhen08的核苷酸序列同源性比较高,其中以Anhui08最高(97.7%)。结论 GZHY09属EV71病毒的C4亚型,与近年我国大陆地区流行的EV71株在进化上属于同一基因型,与Anhui08、Zhejiang08、Shenzhen08具有高度的同源性。     

汉滩病毒西安分离84FLi的M片段全基因序列测定及分析

目的 测定我国肾综合征出血热患者流产胎儿肝脏分离病毒84FLi株的全M片段基因序列，了解其分子基础。方法 采用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），分节段扩增M基因片段的cDNA，直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果 84FLi株的全M基因序列组成为：M片段基因共由3616个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A30．92％，C18．03％，G21．18％，T29．87％。GC含量为39．21％，AT含量为60．79％，最大开放读码框为41－3448，共编码1135个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明84FLi株与HTN型同源性高于与其他型汉坦病毒的同源性，其中与中国株的同源性较高，与HV114株的同源性为85．5％。与HTNV的国际标准毒株76－118的核苷酸同源性分别为84．0％，氨基酸的同源性为96．0％。结论 84FLi株属于汉滩型病毒，并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高。     

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立

目的 建立实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型B~D方法并验证其准确性。方法 比较GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列,设计特异的组合引物探针,应用实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法对兰州地区128例慢性乙型肝炎患者血清标本进行基因型B、C、D检测,并随机对检测的基因型各3株标本进行S基因测序验证。结果 128例标本中B型检出率为20.3%(26/128),C型71.9%(92/128),D型7.8%(10/128);18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。结论 实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型,适宜用于HBV基因型的大规模临床和流行病学调查。     

长沙市柯萨奇病毒A2型和A5型全基因组序列特征分析

目的 了解长沙市柯萨奇病毒A2型（coxsackievirus A2, CV-A2）和A5型（coxsackievirus A5, CV-A5）的序列分子特征及进化趋势。方法 采用二代测序技术获得CV-A2和CV-A5的全基因组序列,进行同源性和进化树分析,使用SimPlot查看毒株序列重组区域。结果 获得长沙市2019年手足口病常规监测病例中CV-A2和CV-A5毒株全基因组序列。CV-A2毒株命名为S281/Changsha/CHN/2019,基因组全长7 422 bp。CV-A5毒株命名为S272/Changsha/CHN/2019,基因组全长7 425 bp。CV-A2全基因组序列与国内CV-A2毒株进行同源性分析发现,非结构蛋白区比结构蛋白区同源性低。CV-A2毒株与原型株Fleetwood（NC038306）相比同源性为79.20%,与湖北省CV-A2毒株（MN419014）同源性最高为95.60%,但非结构蛋白3C和3D区同源性最低,分别为90.51%和92.06%。进化树分析发现3C和3D区位于CV-A4分支。非结构蛋白区新增多个氨基酸突变位点,结构蛋白区氨基酸序列保守。基因重组分析发现CV-A2毒株在3C和3D区存在重组现象。对CV-A5全基因组序列分析发现,与国内CV-A5毒株相比,非结构蛋白区比结构蛋白区同源性低。全基因组序列与CV-A5原型株Swartz（AY421763）相比同源性为80.7%,与澳大利亚毒株（MH111030）相比同源性最高为97.43%,进化树分析发现与MH111030位于同一分支,证明CV-A5为输入型毒株。CV-A5毒株结构蛋白区氨基酸序列保守。结果 长沙市CV-A2毒株为重组毒株,CV-A5毒株为国外输入型。本研究可帮助了解长沙地区CV-A2和CV-A5的全基因组特征,为了解柯萨奇病毒的进化趋势及遗传特征提供理论数据,以便及时有效地阻断疾病传播。     

汉坦病毒辽宁地区黑线姬鼠体内分离株的基因分型

目的 分离辽宁地区汉坦病毒，对分离株(SY13)进行基因分型，以弄清辽宁地区汉坦病毒流行株的基因型和基因亚型。方法 采用组织细胞培养法分离汉坦病毒：用RT—PCR法分别扩增SY13的M片段G1、G2区和S片段，通过DNAstar序列分析软件分别对三个基因片段的序列与从GenBank下载的序列进行同源性分析，并构建种系发生树。结果 通过对三个基因片段进行比较分析，SY13与HTN型同源性较高，为79．3％～97．0％；通过M片段G2区的比较分析，SY13与BA010、BA014、JIANG13、BA09、Q33处于同一分支，同源性达到95．0％～97．0％。结论 辽宁地区汉坦病毒分离株(SY13)与黑龙江地区分离株属同一亚型，为HTN型病毒中的H4亚型。