周围神经细胞外基质在神经再生中的研究进展

细胞外基质（extracellular matrix,ECM）是指自然发生沉积在细胞周围的大分子物质,其为细胞提供结构支撑和黏附位点,并在细胞黏附、迁移、增殖、分化和基因表达中起重要的信号传递作用.周围神经细胞外基质成分主要包括胶原（Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ）、层粘连蛋白、纤连蛋白、硫酸软骨素及其他神经因子,其组成和特点表现出了细胞外基质成分作为神经修复材料的优越性.本文对周围神经来源的细胞外基质在构建组织工程神经方面的研究进展进行综述.     

细胞黏附影响因素与骨组织工程

细胞与支架材料相互作用过程当中,细胞与支架材料的黏附是首先发生的生物学行为,对后续发生的增殖、分化、成骨具有重要影响。本文就骨组织工程当中促进细胞在支架上黏附的方法作一综述。     

组织工程支架材料研究进展

细胞支架材料作为组织工程组织再生的框架,其特性直接影响细胞的粘附、生长和代谢功能,因此它是组织工程的关键要素之一。目前应用于组织工程的支架材料可分三大类：人工合成高分子可降解聚合物,天然材料提取物和细胞外基质,结合近年来的相关文献,对组织工程支架材料研究进展进行总结。     

牙髓-牙本质复合体再生的影响因素及其生物学策略

再生性牙髓治疗利用组织工程方法修复缺损牙本质和牙髓组织,再生具有正常生理功能的牙髓-牙本质复合体,以期恢复牙髓的血管神经化和免疫功能并重建管样牙本质。显著影响再生性牙髓治疗效能的因素包括干细胞、生物信号分子和生物支架材料。根据是否来自牙源性组织,干细胞可分为牙源性干细胞（如牙髓干细胞）和非牙源性干细胞（如骨髓间充质干细胞）。鉴于干细胞具有倾向分化为其原始来源组织的特性,牙源性干细胞在再生性牙髓治疗中展现出一定优势。联合应用多种信号分子并通过激活信号转导通路如Wnt/β-catenin、BMP/Smad,对改善干细胞迁移、增殖、成牙本质细胞分化和血管神经再生潜能发挥关键作用。适用于再生性牙髓治疗的生物支架材料包括自然来源材料和人工合成材料,人工合成材料应模仿天然组织进行生物仿生修饰,以营造适宜的再生微环境并实现对信号转导通路的时空调控。牙髓-牙本质复合体再生的真正实现有赖于干细胞移植和干细胞归巢两大策略。干细胞归巢策略因可避免干细胞的体外分离和培养而在临床操作上更具优势,但如何提高干细胞归巢成功率并促进其增殖和分化以实现牙髓-牙本质复合体真正再生仍有待解决。本文介绍了诱导牙髓-牙本质复合体再生的影响因素,探讨其科学、可行的生物学策略,并展望再生性牙髓治疗未来的研究方向,以期为再生性牙髓治疗临床转化和推广应用提供参考。     

肝再生进程调控的研究

肝脏具有强大的再生能力,在肝损伤(如外科切除、化学性或病毒性损伤等)后,肝脏通过实质细胞和非实质细胞增殖分化,修复组织、拮抗损伤。肝再生是一个特殊、复杂的细胞增殖过程,其调控机制非常复杂。本文就肝再生进程及其调控机制简要综述。     

PTEN在胚胎早期心脏发育过程中作用的研究

目的 胚胎早期原肠胚形成期PTEN表达在原条及其而后发生的中胚层组织,本实验通过过表达PTEN探讨其在早期心脏发生发育过程的作用和意义。方法 《改良滤纸鸡胚胎整体培养法》取胚,37℃孵箱孵育待其发育到HH4期,对鸡胚心肌干细胞（Cardiac Stem Cell）进行PTEN电转染,转染成功后一部分鸡胚37℃孵箱继续培养30 h,待其发育形成心管,观察过表达PTEN对心管发生的影响;另一部分鸡胚在超净台内完成心肌干细胞的离体,体外培养使其分化发育成心肌组织[1],主要研究PTEN在细胞增殖、分化和凋亡过程中的作用。结果 30 h后鸡胚整体的免疫组织化学（N-cadherin）结果显示,PTEN-WT组和PTEN-G129E组鸡胚心管出现了反向环化、多囊化等畸形,GFP组和PTEN-C124S组心管发育受到的影响较小;转染后离体培养得到的心肌组织的跳动频率与GFP组下降的速度加快,且维持时间缩短,GFP组与PTEN-WT组有显著差异（P<0.05）,PTEN-WT组与PTEN-C124S组、PTEN-G129E组无显著差异（P＞0.05）。结论 PTEN蛋白酯酶可能参与早期胚胎心肌干细胞之间的粘附分子的表达从而调节细胞迁移、分化发育,并加速了心肌组织的衰老。     

软骨脱细胞基质多孔支架与骨髓基质干细胞体外构建组织工程软骨的研究

目的 探讨关节软骨脱细胞基质多孔支架(CEDIS)与骨髓基质干细胞(BMSCs)体外培养组织工程软骨的可行性.方法 粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架.扫描电镜观察其微观结构,并进行组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖(GAG)、DNA含量,牛物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;分离培养犬骨髓基质干细胞,TGF-β1成软骨诱导,PKH26标记,接种到支架上体外继续诱导培养,荧光显微镜及扫描电镜观察培养3 d后细胞在支架内的黏附、分布情况.结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测:总胶原含量为(708.2±44.7)μg/mg,GAG含量为(254.7±25.9)μg/mg,DNA含量为(0.021±0.007)μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E=(1.226 ±0.288)MPa,覆水后压缩弹性模量E=(0.052±0.007)MPa.荧光显微镜、电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显.结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织.

Abstract：

Objective To develop a novel cartilage ECM-derived porous scaffold(cEDPs)and investigate the attachment,proliferation and distribution of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) cultured in vitro within the scaffolds.Methods Cartilage microfilaments were prepared after pulverization and gradient centrifugation and prepared into suspension after acellularization treatment.The scaffolds were examined by histological staining,scanning electron microscope(SEM),biochemical and biomechanical analysis.After labeling with PKH26,the canine BMSCs were seeded onto the scaffolds.The attachment,proliferation and differentiafion of cells were observed by inveaed fluorescent microscope and SEM.Results On histology,most extracellular matrices were retained in the scaffold after the removal of cell fragments.Safranin O staining and immunfluorescence examination with collagen Ⅱ antibodies provided positive results.Biochemical analysis showed that the collagen content was(708.2 4±44.7)μg/mg,glycosaminoglycan(254.7 ±25.9)μg/mg and DNA(0.021±0.007)μg/mg.Mechanical testing showed the compression moduli(E)were(1.226±0.288)and(0.052±0.007)MPa ander dry and wet conditions respectively.Inverted fluorescent microscope and SEM showed moderate cell adhesion.chondrocyte-like morphology and matrix synthesis around cells. Conclusion The CEDPS retains most extracellular matrices after a thorough decellularization so as to possess an excellent microstructure with ideal biomechanical characteristics and a good biocompatibility. Thus it is a suitable candidate as an alternative cell-carrier for cartilage tissue engineering. Chondrogenic BMSCs and CEDPS may be used to construct cartilage-like tissue in vitro.     

Biocompatibility evaluation of electrospun aligned poly(propylene carbonate) nanofibrous scaffolds with peripheral nerve tissues and cells in vitro

Background  Peripheral nerve regeneration across large gaps is clinically challenging. Scaffold design plays a pivotal role in nerve tissue engineering. Recently, nanofibrous scaffolds have proven a suitable environment for cell attachment and proliferation due to similarities of their physical properties to natural extracellular matrix. Poly(propylene carbonate) (PPC) nanofibrous scaffolds have been investigated for vascular tissue engineering. However, no reports exist of PPC nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering. This study aimed to evaluate the potential role of aligned and random PPC nanofibrous scaffolds as substrates for peripheral nerve tissue and cells in nerve tissue engineering.

Methods  Aligned and random PPC nanofibrous scaffolds were fabricated by electrospinning and their chemical characterization were carried out using scanning electron microscopy (SEM). Dorsal root ganglia (DRG) from Sprague-Dawley rats were cultured on the nanofibrous substrates for 7 days. Neurite outgrowth and Schwann-cell migration from DRG were observed and quantified using immunocytochemistry and SEM. Schwann cells derived from rat sciatic nerves were cultured in electrospun PPC scaffold-extract fluid for 24, 48, 72 hours and 7 days. The viability of Schwann cells was evaluated by 3-[4,5-dimethyl(thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl] tetrazolium bromide (MTT) assay.

Results  The diameter of aligned and random fibers ranged between 800 nm and 1200 nm, and the thickness of the films was approximately 10–20 μm. Quantification of aligned fiber films revealed approximately 90% alignment of all fibers along the longitudinal axis. However, with random fiber films, the alignment of fibers was random through all angle bins. Rat DRG explants were grown on PPC nanofiber films for up to 1 week. On the aligned fiber films, the majority of neurite outgrowth and Schwann cell migration from the DRG extended unidirectionally, parallel to the aligned fibers. However, on the random fiber films, neurite outgrowth and Schwann cell migration were randomly distributed. A comparison of cumulative neurite lengths from cultured DRGs indicated that neurites grew faster on aligned PPC films ((2537.6±987.3) μm) than randomly-distributed fibers ((493.5±50.6) μm). The average distance of Schwann cell migration on aligned PPC nanofibrous films ((2803.5±943.6) μm) were significantly greater than those on random fibers ((625.3±47.8) μm). The viability of Schwann cells cultured in aligned PPC scaffold extract fluid was not significantly different from that in the plain DMEM/F12 medium at all time points after seeding.

Conclusions  The aligned PPC nanofibrous film, but not the randomly-oriented fibers, significantly enhanced peripheral nerve regeneration in vitro, indicating the substantial role of topographical cues in stimulating endogenous nerve repair mechanisms. Aligned PPC nanofibrous scaffolds may be a promising biomaterial for nerve regeneration.

     

RGD修饰的聚乳酸-羟基乙酸骨组织工程材料的研究进展

[摘要]PLGA骨组织工程支架在骨损伤修复和再造方面有着重要的应用,但由于PLGA亲水性差,不利于种子细胞在支架上的粘附和增殖。RGD肽修饰PLGA支架后,材料的细胞亲和性可得到有效改善,促进种子细胞粘附和增殖。本文就近年来RGD修饰的PLGA骨组织工程材料的相关研究作一综述。     

应用高浓度Ⅱ型胶原蛋白构建组织工程软骨支架

目的构建有利于种子细胞黏附、增殖和分化的软骨组织工程海绵支架。方法依据天然软骨主要成分,提取透明软骨Ⅱ型胶原蛋白,将提取的胶原蛋白通过高速离心进行浓缩,真空冷冻干燥制得海绵支架材料,应用化学交联剂EDC/NHS进行化学交联,对支架采用组织化学染色、体外降解实验、扫描电镜和接种细胞静态培养的方法进行相关检测。结果支架具有良好的孔隙结构,孔径40～130μm,孔隙率在90%以上,细胞在支架上增殖、分化良好。结论构建的高浓度Ⅱ型胶原蛋白海绵支架具有良好的生物相容性,有较好的应用前景。     

体外培养的兔骨髓基质细胞在牛松质骨载体上的生长与分化

目的体外培养兔骨髓基质细胞（Marrow Stromal Cells,MSCs）,研究其生物学特性,为骨组织工程应用提供基础。方法抽取新西兰白兔骨髓,进行体外培养并传代,观察细胞生长情况,然后将细胞与牛松质骨（bovine cance Uousbone,BCB）载体复合。通过用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞粘附和生长情况,同时测定碱性磷酸酶活性和细胞增殖分化情况。结果骨髓基质细胞在体外培养生长良好,细胞与支架复合后可以在支架表面粘附伸展。结论骨髓基质细胞在体外生长良好,可以作为种子细胞在组织工程中应用。     

转化生长因子β1基因修饰的间充质干细胞／仿生基质材料的体外复合培养

目的 探讨转化生长因子β1（TGF－β1)基因转染对间充质干细胞（MSCs)增殖分化的影响,评价涂覆多聚赖氨酸（PLYS）的聚DL乳酸（PDLIA）仿生基质材料能否作为关节软骨组织工程学研究的支架材料。方法 将组织工程学与分子生物学有机结合,体外将具有多重生物学效应的TGF－β1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞－－间充质干细胞（MSCs）,并与表面涂覆PLYS的PDLLA可降解三维多孔基质材料体外复合培养。以单纯空载体转染MSCs为对照,通过扫描电镜等方法观察种子细胞的粘附、增殖及分化等情况。结果 基质材料孔隙率为88％,其中孔径为150－200μm的有效孔占80％。所有细胞增能很好地粘附于基质材料上,其中TGF－β1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。结论 利用扮子组织工程学原理可使TGF－β1持续高效发挥作用,使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。涂覆PLYS的PDLLA仿生基质材料不仅具有良好的生物相容性和结构相容性,而且具有更好的表面相容性和生物学活性,在一定程度上解决了细胞－－基质材料之间非的界面不相容问题,是关节软骨缺损修复的良好基质材料。     

排斥导向分子在中枢神经系统中的研究进展

排斥导向分子（RGMs）家族包括三种蛋白,即RGMa、RGMb和RGMC,通过其受体neogenin,在发育及成年神经系统中显示了多种生物学活性.近年来,RGMa被证实参与了细胞增殖和分化、细胞粘附和迁移、神经褶皱形成、轴突导向、生长锥塌陷和轴突生长/再生等神经系统发育早期事件,同时RGMa还在多发性硬化症和老年性痴呆（AD）等中枢神经系统疾病中发挥了独特的作用.本文就RGMa在神经系统中的研究进展作一述评.     

血小板衍生生长因子-BB在口腔种植中的应用研究进展

血小板衍生生长因子-BB（Platelet-derived growth factor,PDGF-BB）是PDGF的一个亚型,是广泛存在于多种组织的多肽生长因子,可以通过促进成骨细胞的增殖和分化及抑制破骨细胞增殖和分化的双重作用,促进口腔种植过程中骨组织的再生,同时还能促进软组织的再生。本文就血小板衍生生长因子-BB修复组织缺损的作用作一综述。     

Wnt信号转导通路与细胞凋亡

细胞信号转导是各类信号通过细胞膜或细胞内信使分子引起基因表达或物质代谢改变的过程。因此,细胞信号转导过程发生障碍或异常,必然会导致细胞生长、分化、代谢及生物学行为异常,从而引起各种疾病甚至肿瘤。Wnt信号转导通路是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系;是胚胎发育、调控细胞生长增殖的关键途径。由于基因突变或稳定性增加引起该途径异常激活可以启动c-myc、cyclin、MMP-7、Survivin等下游靶基因表达异常,导致细胞增殖,抑制细胞凋亡,肿瘤形成等。Wnt信号通路作为细胞信号转导系统之一,参与肿瘤发生的机制涉及信号转导、细胞周期、细胞增殖、迁移和分化、细胞凋亡,介导细胞的黏附等多方面。     

Id1/Id3在子宫内膜癌中的表达及对子宫内膜癌细胞生物学的作用

目的探讨DNA分化抑制因子（inhibitor of DNA differentiation, Id）Id1/Id3在子宫内膜癌中的表达及对子宫内膜癌细胞
增殖、侵袭、迁移及粘附等生物学行为的作用。方法Western blot方法检测4例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中的Id1/Id3
的表达;将子宫内膜癌RL-952和HEC-1-B两株细胞各分为未处理细胞组、空白病毒组、启动子病毒组和Id1/Id3双敲低组。通
过qRT-PCR检测不同腺病毒载体感染细胞后MMP2、CXCR4和P21 mRNA表达量,Western blot检测MMP2、CXCR4、P21蛋白
表达情况;通过MTT增殖试验、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验和细胞粘附实验检测Id1/Id3表达改变后,对子宫内膜癌细胞
增殖、侵袭、移行和粘附能力的影响。结果Id1/Id3在子宫内膜癌组织中较癌旁组织表达增高（P<0.05）;双敲低Id1/Id3,子宫内
膜癌细胞中MMP2、CXCR4的mRNA水平和蛋白水平明显降低（P<0.05）,P21的mRNA水平和蛋白水平则明显升高（P<0.05）,
RNAi组与其他3组细胞相比均有显著性差异;Id1/Id3双敲低组子宫内膜癌RL-952和HEC-1-B株细胞增殖能力、侵袭能力、迁
移能力和粘附能力均抑制（P<0.05）。结论Id1/Id3在子宫内膜癌患者组织中高表达,并可通过升调MMP2、CXCR4和降调P21
的表达促进子宫内膜癌细胞增殖、侵袭、迁移及粘附作用,靶向Id1/Id3治疗可能成为预防和治疗子宫内膜癌的新方案。
     

新型培养基促进牙乳头细胞成骨分化及其在牙周骨组织再生中的应用

  目的  探讨新型化学成分明确培养基（chemically defined medium, CDM）对牙乳头细胞（dental papilla cells, DPCs）成骨分化潜能及体内牙周骨再生的影响。  方法  分离大鼠 DPCs，按培养基不同分为传统培养基（conventional medium, CM）组和CDM组，分别在CM和新型CDM中培养，评估两组DPCs细胞表面标记、增殖、迁移、成骨分化潜能；制备SD大鼠牙周骨缺损模型，CM和CDM两组DPCs分别复合胶原凝胶植入缺损区域内，评估两组DPCs在牙周骨缺损中的骨再生修复能力。  结果  在CM和CDM组中，DPCs细胞均显示相似的细胞表面标记；与CM相比，CDM可促进DPCs增殖、克隆形成及细胞迁移（P<0.05）；定量PCR显示CDM组DPCs成骨相关基因Runx2、Alp和Opn上调（P<0.05）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色显示CDM组DPCs细胞 ALP活性高于CM组（P<0.05）；细胞经成骨诱导后，茜素红染色显示CDM组DPCs细胞成骨分化能力高于CM组（P<0.05）。在大鼠体内牙周骨缺损模型中，移植CDM组DPCs细胞8周后，HE染色显示缺损区域皮质骨连续的新生骨，而CM组新生骨较少，骨皮质仍未愈合，microCT扫描定量分析显示CDM组骨体积分数（BV/TV）高于CM组（P<0.05）。  结论  CDM培养基可促进DPCs增殖和成骨分化能力，为未来细胞治疗中干细胞培养基的选择提供了新的方案。     

全骨髓贴壁法分离培养rBMSCs及成骨诱导探讨

[摘要]　目的 通过研究在体外培养大鼠骨髓基质干细胞(rBMSCs)及其成骨生物学特性,探讨构建骨组织工程种子细胞的方法。方法 通过全骨髓贴壁培养法分离大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、维生素C、β2甘油磷酸钠的诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测碱性磷酸酶活性及钙结节茜素红染色反应,进行成骨细胞鉴定。结果 全骨髓贴壁培养下,骨髓基质干细胞增殖能力强,生长迅速,呈成纤维细胞样生长。诱导条件下细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,并且钙结节茜素红染色反应阳性。结论 采用全骨髓贴壁培养法,骨髓基质干细胞分离培养及体外扩增更为简便迅速,诱导条件下成骨能力肯定,可为骨组织工程构建提供大量种子细胞。     

组织工程皮肤用真皮支架细胞相容性的比较研究

目的研究几种真皮支架的细胞相容性，为构建组织工程皮肤提供资料。方法取胶原海绵、明胶海绵、PEGA和PHBV共4种真皮支架，与小鼠成纤维细胞和ES源表皮样干细胞体外培养，观察前者对后者粘附率的影响，及对成纤维细胞增殖的影响，评价真皮支架的细胞相容性。结果成纤维细胞和ES源表皮样干细胞在4种支架材料上均能粘附存活，成纤维细胞能增殖，但在胶原海绵、PHBV和PLGA支架上的增殖率明显高于明胶海绵。结论几种真皮支架的细胞相容性较好，可用于新型组织工程皮肤的构建。     

PLGA新型纳米支架的制备及其生物相容性

目的探讨和比较应用不同参数静电纺丝技术制备复合型聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA]纳米纤维缓释膜片的可行性,检测其表面特性以及生物相容性。方法使用不同参数制备纳米纤维膜,扫描电镜观察膜片表面形态;人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPLDCs)培养及鉴定后接种于空白膜上,扫描电镜观察细胞与膜的附着情况,以MTT[3-(4,5-dimethylthiaozol-2-yl)-2,5-dip henyltetrazolium bromide]实验检测不同浓度材料浸提液对细胞增殖变化情况的影响。结果随着PLGA流量增加,纳米纤维直径增加;细胞与PLGA膜复合后粘附良好且增殖状态无明显变化;不同浓度材料浸提液对牙周膜细胞增殖的影响无明显差异。结论通过不同参数静电纺丝制备的新型纳米纤维膜具有良好的生物相容性,可进一步作为多种药物及细胞因子载体构建缓释型支架,从而用于引导性牙周组织再生(guided tissue regeneration,GTR)或者牙周组织工程。