抗病毒蛋白MxA的诱导和检测方法的实验研究

目的 研究抗病毒蛋白ＭｘＡ的表达及其活性。方法用ＩＦＮα２ｂ或３型腺病毒（Ａ＿３）分别对ＷＩ－３８细胞或人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）作用 １２或２４ ｈ，并用Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ法或ＦＡＣＳ法，分别对Ｍ蛋白的表达进行定性和定量检测。采用微量细胞病变抑制法，对重组的ＭｘＡ和ＩＦＮα２ｂ进行抗病毒效应实验。结果 （１）低浓度的 ＩＦＮα２ｂ（＞ １×1０～＃ＩＵ／Ｌ）和Ａｄ＿３（＞２００ ＴＣＩＤ＿５０），均可诱导相应细胞表达 ＭｘＡ；（２）１０μｇ／Ｌ ＭｘＡ可抵抗２０个 ＴＣＩＤ＿（５０）的 ＨＳＶ－Ｉ、Ｐｏｌｉｏ． Ｖ感染 Ｖｅｒｏ细胞、Ａｄ＿３感染ＨｅＬａ细胞，抵抗２００个ＴＣＩＤ＿（５０）的ＶＳＶ感染Ｗｉｓｈ细胞。结论ＭｘＡ只能由干扰素（ＩＮＦα2ｂ）或病毒诱导产生，其具有广谱的抗病毒活性。     

人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析

目的 在大肠杆菌中表达抗入ＴＮＦ－α单链抗体（ＳｃＦｖ）,并分析它的结合活性和中和活性。方法 在获得抗人ＴＮＦ－αＥＳｃＦｖ基因的基础上,用热诱导载体ｐＢＶ２２０在大肠杆菌中表达Ｅ６ＳｃＦｖ蛋白。ＥＬＩＳＡ测定抗体的结合活性,实时ＢＩＡ技术确定亲和常数。Ｌ９２９细胞毒试验分析其中和活性。结果 克隆了抗人ＴＮＦ－αＥ６ＳｃＦｖ基因的热诱导载体ｐＢＶ２２０在大肠杆菌中,经４２℃热诱导,得到了相对分子质     

IFNαA—HBV preS融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物…

本实验利用重组ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因ｐｌｙ５质粒大大肠杆菌ＤＨ５α中表达ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白，该融合基因产物的分子量为３９ｋＤ左右，融合蛋白的表达率为１１．８％，对该融合蛋白的初步鉴定表明，该融合蛋白既具有ＨＢＶｐｒｅＳ蛋白的免疫原性，又具备ＩＦＮα的生物学活性。     

IFNα A-HBV preS 融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性的初步鉴定

本实验利用重组ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因ｐｌｙ５质粒在大肠杆菌ＤＨ５α中表达ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白。该融合基因产物的分子量为３９ｋＤ左右，融合蛋白的表达率为１１．８％。对该融合蛋白的初步鉴定表明：该融合蛋白既具有ＨＢＶｐｒｅＳ蛋白的免疫原性，又具备ＩＦＮα的生物学活性。     

细胞因子调节人肝癌细胞ICAM—1分子的表达及其对CD3AK杀伤功能…

应用基因重组人干扰素α（ＩＦＮ－α）、干扰素γ（ＩＦＮ－γ）和肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）体外处理人肝癌细胞系Ｈ－７４０２，ＡＢＣ－ＣＥＬＩＳＡ法检测各处理组和对照组细胞间粘附分子－１（ＩＣＡＭ－１）的表达水平，用ＬＤＨ释放法观察ＣＤ３单克隆缺本活化的杀伤细胞对各处理条件下Ｈ－７４０２细胞的杀伤活性。     

中和抗体识别短肽对IFN-α生物学活性的影响

目的研究合成肽ＷＬＤＰＲＨ的免疫反应性和对干扰素（ＩＦＮ）诱导的生物学活性的影响。方法根据我们早先的研究，已用中和抗体从噬菌体展示６肽库中筛选出了两个与ＩＦＮ－α有同源性的肽片段，将其中之一进行了人工合成（ＷＬＤＰＲＨ），并进行了同源性比较分析，体外竞争酶联免疫吸附实验（ＥＬＩＳＡ），体外ＩＦＮ诱导抗病毒和抗增殖分析。结果计算机分析表明，人工合成肽ＷＬＤＰＲＨ与推理的Ｉ型ＩＦＮ受体结合区ＬｏｏｐＡＢ（２９－３５位）有相当的同源性。体外竞争ＥＬＩＳＡ实验表明，合成肽在２５μｇ／ｍｌ浓度时能特异性抑制ＩＦＮ－α与中和抗体４Ｃ１结合。体外抗病毒结果显示，干扰素在亚保护剂量时（２０～７０ｐｇ／ｍｌ）时，合成肽能提高ＩＦＮ－α作用细胞后的抗病毒活性，并且合成肽ＷＬＤＰＲＨ在１．４μｇ／ｍｌ时，ＩＦＮ－α抗病毒保护率从４０％提高到８６％，为最高保护率的最低剂量，但合成肽为１．４μｇ／ｍｌ，ＩＦＮ浓度为５～５５ｎｇ／ｍｌ时，对ＩＦＮ－α诱导的抗增殖作用不明显。结论用中和抗体筛选的短肽ＷＬＤＰＲＨ能影响ＩＦＮ分子作用模式，并且有可能模拟ＩＦＮ分子ＬｏｏｐＡＢ的结构和功能，这为免疫治疗及ＩＦＮ的小分子模拟设计奠定基础。     

人α—干扰素与乙型肝炎病毒前S2嵌合蛋白的表达？…

目的 重组表达人α－干扰素与乙型肝炎病毒前Ｓ２融合蛋白（ＩＦＮ－Ｐｒｅ Ｓ２）,探索治疗ＨＢＶ感染的特异性免疫药物。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ０技术扩增出人ＩＦＮ－α２ｂ和ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２基因片段,分步克隆获取融合基因,构建ｐＢＶ－ＩＦＮ－Ｐｒｅ Ｓ２重组表达载体,转化Ｅ．ｃｏｌｉ后诱导表达ＩＦＮ－Ｐｒｅ Ｓ２融合蛋白。结果 在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达了相对分子质量为２７０００的目标蛋白,后者以     

IFNαA－HBVPre－S融合基因的克隆及序列测定

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｐｒｅ－Ｓ蛋白是ＨＢＶ与靶细胞结合的重要蛋白。ＩＦＮ是生物体内具有多种生物功能的细胞因子，ＩＦＮ在乙型肝炎的防治中具有重要意义。通过ＰＣＲ技术，我们在体外扩增了ＩＦＮαＡ基因的全序列和ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ基因的全序列。为了便于融合基因的克隆和表达，我们在引物的５’端设计了相应的酶切位点，保护位点，起始密码和终止密码。通过基因克隆技术，我们构建了ＩＦＮαＡ－ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ融合基因的克隆并进行了序列测定。大量研究表明，ＨＢＶ和靶细胞的结合可能是由ＨＢＶ包膜上的Ｐｒｅ－Ｓ蛋白表位介导的，因此带有附着位点的Ｐｒｅ－Ｓ蛋白，可能比ＨＢｓＡｇ疫苗保护效果好。另一方面，α－干扰素作为治疗乙型肝炎的重要生物制剂，也是乙肝免疫接种过程中良好的免疫性剂。ＩＦＮαＡ－ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ融合基因克隆的成功，为表达同时具有ＩＦＮαＡ生物学活性以及ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ蛋白免疫原性的双特性蛋白奠定了基础。     

LPS和几种促炎细胞因子促进人血管平滑肌细胞iNOS mRNA的表达

ＬＰＳ、ｒｈｌＬ－１β、ｒｈＩＬ－６、ｒｈＴｈＦ－ａ和ｒｈＩＦＮ－γ单独或两两组合加于培养的人血管平滑肌细胞（ｈＶＳＭＣ）,测定了ｈＶＳＭＣＮＯＳ活性,ｃＧＭＰ含量,ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达丰度和培养液中ＮＯ２浓度。ＬＰＳ和细胞因子都能诱导ｈＶＳＭＣ表达ｉＮＯＳ　ｍＲＮＡ,升高ｈＶＳＭＣ　ＮＯＳ活性、ｃＧＭＰ含量和培养液中ＮＯ２浓度;ＴＮＦ－ａ是受试细胞因子中唯一能与另外三种细胞因子分别组合都显示出协同效应的细胞因子;ＬＰＳ和其余三种细胞因子间的两两组合都没有显示出协同效应;本研究结果表明：ＬＰＳ、ｒｈＴＮＦ－α、ｒｈＩＬ－１β、ｒｈＩＬ－６、ｔｈＴｈＦ－α、ｔｈＩＦＮ－γ都能诱导ｈＶＳＭＣ合成ＮＯ;ＴＮＦ－α可能是诱导ｈＶＳＭＣｉＮＯＳ表达的致炎细胞因子中最为重要的。     

抗HIVp24单链抗体的基因构建及序列测定

应用重组噬菌体抗体系统，从经过ＨＩＶ全蛋白裂解物及ｐ２４免疫过的鼠脾细胞ｍＲＮＡ中构建出组合单链抗体（ＳｃＦｖ）ｃＤＮＡ文库。ｃＤＮＡ文库克隆到噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ，转化大肠杆菌ＴＧ１，得到２５×１０７个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现，用ｐ２４蛋白对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行两轮亲和富集获得一株特异性好的抗ｐ２４的噬菌体单链抗体。经ＥＬＩＳＡ鉴定，该噬菌体呈ｐ２４结合ＥＬＩＳＡ阳性的滴度小于１０７ｐｆｕ／ｍｌ。并对ＳｃＦｖ进行了序列分析，对今后的应用奠定了基础。     

抗CEA单链抗体与人hTNF-α融合基因的构建、表达和纯化

采用基因重组技术将已获得的抗癌胚抗原（ＣＥＡ） 单链抗体基因（ＳｃＦｖ） 与人肿瘤坏死因子α（ｈＴＮＦ α） 基因拼接成抗ＣＥＡＳｃＦｖ ｈＴＮＦ α（免疫毒素） 融合基因, 并克隆进大肠杆菌分泌性表达载体ｐＥＴ ２２ｂ （ ＋ ） 中, 在大肠杆菌中表达了６ ×Ｈｉｓ免疫毒素融合蛋白, 其６ ×Ｈｉｓ 位于ＳｃＦｖ 的Ｎ 端, 在胞内以可溶性存在, 其表达量占菌体总蛋白的６％ , ＳＤＳ ＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 显示表达产物分子量为４３ｋＤ, 与其基因编码蛋白的理论推算值相符。经Ｎｉ２＋ ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱一步纯化的６×Ｈｉｓ 免疫毒素纯度可达９０％ 以上, 得率为０－２ｍｇ／１００ｍｌ。表达产物除了具有与ＣＥＡ 结合的活性, 也具有对Ｌ９２９细胞杀伤的功能。     

重组人γ－干扰素单克隆抗体的制备及初步应用

应用常规方法制备了４株能稳定分泌抗人重组γ－干扰素单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的小鼠杂交瘤细胞系：３Ｄ３、３Ｄ１２、３Ｆ９和３Ｂ８．经免疫琼脂双扩散法鉴定，其分泌的ＭｃＡｂ的亚类分别为：ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１和１ｇＧ１．相对亲和常数前两株ＭｃＡｂ为６．２５×１０－１１、后两株ＭｃＡｂ为６．２５×１０－１３．问接ＥＬＩＳＡ法测培养上清的效价为２×１０２～１．２８×１０５．由小鼠腹水提取的４株ＭｃＡｂ与天然γ－干扰素均产生交叉反应，对重组的人γ－干扰素均具有中和活性．其中３Ｆ９和３Ｄ３培养上清对重组人γ－干扰素亦有明显的中和活性。用３Ｆ９ＭｃＡｂ与溴化氢活化的ＳｅＰｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联制备了亲和层析柱，用其纯化粗提的γ－干扰素纯度达到９５％以上，比活性达１．９×１０７ＩＵ／ｍｇ蛋白．     

干扰素对人胃癌细胞IAP—2表达的调节

应用基因重组干扰素－α和－γ体外诱导三侏人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１，ＭＧＣ８０３和ＭＫＮ４５，ＡＢＣ－ＣＥＬＩＳＡ法测定诱导组和对照细胞表面免疫抑制酸性蛋白Ⅱ型的表达量。在基础培养条件下，三株细胞表达ＩＡＰ－２均呈低水平。低浓度（＜１０００ｕ／ｍｌ）ＩＦＮ－α或－γ反使其ＩＡＰ－２表达量显著减少。这些结果提示：（１）ＩＦＮ－α和－γ可能对胃癌细胞ＩＡＰ－２表达呈双向调节作用；（２）癌细胞ＩＡＰ－２     

α-黑素细胞刺激素体外对星形胶质细胞产生NO和前炎性细胞因子的影响

目的：研究α－黑素细胞刺激素（α－ＭＳＨ）对ＬＰＳ诱导星形胶质细胞产生ＮＯ和前炎性细胞因子的影响。探讨α－ＭＳＨ的抗炎作用机制。方法：分别用ＬＰＳ或α－ＭＳＨ＋ＬＰＳ处理体外培养的大鼠脑星形胶质细胞,用Ｇｒｉｅｓｓ试剂测定ＮＯ,以ＭＴＴ显色法检测ＩＬ－１、ＩＬ－６和ＴＮＦ－α,采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测ＭＩＦｍＲＮＡ表达。结果：体外培养的星形胶质细胞在ＬＰＳ刺激下产生ＮＯ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α和表达ＭＩＦｍＲＮＡ表达。结果：体外的星形胶质细胞在ＬＰＳ刺激下产生ＮＯ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α和表达ＭＩＦｍＲＮＡ显著增高;若同时给予ＬＰＳ和α－ＭＳＨ,可明显降低ＮＯ、ＩＬ－１、ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的产生以及ＭＩＦｍＲＮＡ表达。结论：Ｒ昧α－ＭＳＨ抑制星形胶质细胞产生ＮＯ和前炎性细胞因子与其抑制中枢神     

干扰素和肿瘤坏死因子对人脐静脉内皮细胞表达HLA—Ⅱ类抗原…

采用ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法对ＩＦＮ－α，γ及ｒＴＮＦα单独或协同影响人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）表达ＨＬＡ－Ⅱ类抗原作了定量观察，结果表明，ＩＦＮγ直接刺激ＨＵＶＥＣ可依浓度和时间依赖的方式提高其ＨＬＡ－Ⅱ类抗原表达量，而ｒＴＮＦα，ＩＦＮα单独处理ＨＵＶＥＣ无效，当ｒＴＮＦα和ＩＦＮγ同时诱导时，对ＨＵＶＥＣ表达ＨＬＡ－ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ均表现抑制作用，但是，当先用ＩＦＮγ诱导ＨＵＶＥＣ２４ｈ后     

抗人免疫缺陷病毒1型gp120人源单链抗体的表达

目的研究人源抗人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）ｇｐ１２０单链抗体（ＳｃＦｖ）。方法以人工合成的ＨＩＶ－ｌｇｐ１２０Ｖ３环多肽为抗原，利用噬菌体抗体库技术，筛选含有抗－ｇｐ１２０ＳｃＦｖ基因的噬菌体，提取质粒，转化大肠杆菌ＨＢ２１５１，表达可溶性ＳｃＦｖ。结果经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表达产物分子量为２８ｋＤ左右，且具有ｃ－ｍｙｃ活性；ＥＬＩＳＡ和Ｄｏｔｂｌｏｔ结果表明，可溶性ＳｃＦｖ具有较好的抗原结合活性和较强的特异性；竞争性ＥＬＩＳＡ实验结果进一步证明表达产物的特异抗－ｇｐ１２０活性。结论该技术便捷有效，可大量获得人源抗ＨＩＶ抗体片段，为进一步研究抗ＨＩＶ抗体的生物活性和ＨＩＶ感染诊治打下基础     

胸腺基质细胞的抗原提呈作用

目的 研究胸腺基质细胞的抗原提呈能力。方法 应用ＯＶＡ－特异的、受Ｉ－Ａ＾ｄ分子识别限制的辅助Ｔ细胞杂交瘤（３ＤＯ．１８．３）识别提呈的ＯＶＡ的ＣＮＢｒ水解片段而被活化后产生ＩＬ－２,测定ＩＬ－２活性来分析胸腺基质细胞的抗原提呈作用。结果ＩＦＮ－γ能促进ＭＴＥＣＩ和ＭＴＳＣ４表达Ｉ－Ａ＾ｄ分子,并促进ＭＴＳＣ４表达Ｂ７－１分子。经ＩＦＮ－γ作用后,ＭＴＥＣ１和ＭＴＳＣ４均有抗原提呈能力,ＭＴＳＣ     

γ－干扰素在淋巴细胞介导的子宫颈角化上皮细胞毒作用中的意义

本研究以子宫颈角化上皮为靶细胞，用试管培养技术及非同位素细胞毒性试验，探讨了干扰素（ＩＦＮ－γ）对淋巴细胞介导的对宫颈角化上皮细胞毒作用的影响及细胞间吸附分子１（ＩＣＡＭ－１）与白细胞功能相关抗原１（ＬＦＡ－１）在细胞毒作用中的意义。结果显示ＣａＳｋｉ、ＳｉＨａ、ＨｅＬａ、Ｗ１２及ＮＣｘ均为ＮＫ抵抗、ＬＡＫ敏感细胞。ＩＦＮ－γ预处理靶细胞明显增加ＬＡＫ细胞的杀伤活性，但对ＮＫ活性影响不大；ＩＦＮ－γ预处理效应细胞可增强ＬＡＫ细胞对上述靶细胞的溶解作用，但并不改变ＮＫ对靶细胞的选择性；抗ＩＣＡＭ－１与ＬＦＡ－１单克隆抗体能有效地降低ＬＡＫ细胞对靶细胞的杀伤作用，而抗ＨＬＡＡＢＣ及ＨＬＡＤＲ则无此作用。提示ＩＦＮ－γ仅对ＬＡＫ细胞介导的对宫颈角化上皮的细胞毒作用有明显增强作用，而对ＮＫ细胞无明显影响；ＩＣＡＭ－１－ＬＦＡ－１通路为ＬＡＫ细胞结合并溶解靶细胞的主要通路，且这种细胞毒作用是非ＭＨＣ限制的。     

大鼠骶髓后连合核神经元兴奋性氨基酸诱导的反应

应用制霉菌素穿孔全细胞电压钳技术，研究急性分离的大鼠骶髓后连合核（ＳＤＣＮ）神经元对谷氨酸受体激动剂的反应。钳制电压为－４０ｍＶ的条件下，Ｌ－谷氨酸（Ｇｌｕ），Ｎ－甲基－Ｄ－门冬氨酸（ＮＭＤＡ），使君子酸（ＱＡ），α－氨基－３－羟基－５－甲基异倾阶－４－丙酸（ＡＭＰＡ）和红藻氨酸（ＫＡ）均诱导产生内向电流。随着激动剂浓度的增高，这些电流的量效关系曲线呈典型的Ｓ型。ＥＣ５０值分别是Ｇｌｕ３．３×１０－５Ｍ，ＮＭＤＡ９．０×１０－ＳＭ，ＱＡ６．４×１０７Ｍ，ＡＭＰＡ１．３×１０－４及ＫＡｇ．６×ｕ１０－５Ｍ。Ｎｉｌｌ系数分别是Ｇｌｕ０．７４，ＮＭＤＡ０．８３，ＱＡ１．３，ＡＭＰＡ１．１和ＫＡ１．３。代谢型谷氨酸受体激动剂ｔＡＣＰＤ（１０－３Ｍ）未能诱导出电流．Ｃｙｃｌｏｔｈｉａｚｉｄｅ显著增强ＫＡ和ＡＭＰＡ诱导的反应。相反，伴刀豆球蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）对ＫＡ和ＡＭＰＡ反应作用甚微，提示ＳＤＣＮ神经元主要表达ＡＭＰＡ型非ＮＭＤＡ受体。     

人γ－干扰素cDNA基因在大肠杆菌中高效表达

人γ－干扰素ｃＤＮＡ基因在大肠杆菌中高效表达王永俊，李文，蔡庆，林万明，马大龙人γ－干扰素（ｈＩＦＮ－γ）具有抗病毒活性、细胞生长抑制活性和免疫调节活性。目前，ｈＩＦＮ－γ在临床上主要用来治疗类风湿关节炎以及肿瘤。１９８２年Ｇｒａｙ等首次在大肠杆菌中...