从卵巢癌cDNA文库中筛选新的肿瘤标志物

采用SEREX法筛选了自行构建的中国人卵巢癌cDNA表达文库 ,得到 2 7个阳性克隆 ,其中 3个为全长cDNA。序列分析和同源性比对结果表明所获得的 2 7个克隆分属于分化抗原、细胞结构蛋白及功能未知三类。选择其中一个全长cDNAMY OVA 13(该基因编码的蛋白是MAD2 ) ,利用基因工程方法克隆、表达和纯化得到目的蛋白 ,采用点杂交方法检测了MY OVA 13目的蛋白与正常人和肿瘤患者中的血清学反应。MY OVA 13抗体只在肿瘤组中检测到 (5 / 74 ) ,在正常组中均为阴性 ;间接ELISA测定结果显示 ,MY OVA 13抗体的水平在肿瘤组中均高于正常组 ,其中肝癌和前列腺癌组与正常组相比 ,在统计学上有显著差异 ,P值分别 <0 0 1和 <0 0 5。我们的初步结果表明MY OVA 13及其抗体具有一定的肿瘤特异性 ,有可能作为肿瘤诊断的标志物     

SEREX肿瘤抗原基因表达蛋白的研制和血清学初步筛选

目的 :利用基因工程方法获得SEREX肿瘤抗原基因原核表达蛋白 ,为进一步血清学分析奠定基础。方法 :采用SEREX方法 ,筛选中国人卵巢癌cDNA表达文库。对获得的 3个阳性克隆基因MY OVA 2、MY OVA 7和MY OVA 13,利用基因工程的方法克隆其全长基因 ,原核表达和亲和层析获得目的蛋白 ,并采用Dot blot的方法初步检测了目的蛋白抗原在正常人和肿瘤患者中的血清学反应格局。结果 :获得了纯化的目的蛋白 ,采用点杂交对 13例正常人和 74例肿瘤患者血清的测定结果显示 ,MY OVA 13的抗体只在肿瘤组中检测到 ,在正常组中为阴性 ;MY OVA 2和MY OVA 7在两组人群的血清中自身抗体检出率均呈现阳性 ,不同的肿瘤类型的阳性率各不相同。结论 :基因工程获得的蛋白质抗原可望成为肿瘤的血清学诊断工具     

重组cDNA表达文库血清学分析技术筛选肿瘤抗原的研究进展

1995年Sahin等首先建立了重组cDNA表达文库血清学分析法（SEREX）以来,大量的人类肿瘤抗原被发现和鉴定,并建立了SEREX技术合作组及相应的数据库。本文对SEREX技术的基本原理和流程及其在肿瘤抗原筛选中的应用和存在问题作一综述。     

SEREX筛选肿瘤抗原进展

肿瘤抗原的鉴定是肿瘤免疫学的重要任务之一,也是肿瘤免疫治疗发展的必然途径。重组cDNA表达文库的血清学分析法(serological analysis of re-combinant cDNA expression library,SEREX)是一种重要的筛选肿瘤抗原的方法,为临床肿瘤标志物的筛选、鉴定及肿瘤疫苗的研制提供了重要的技术手段。     

肝癌组织差异表达基因cDNA序列的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定肝癌组织特异表达基因。方法：通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库，用PCR方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析，用Northern印迹方法对新的cDNA序列进行初步鉴定。结果：从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选出13个阳性克隆，DNA测序获得11个不同的cDNA序列；同源性比较分析表明，6个cDNA片段与在基因高度同源，5个cDNA片段为新的序列。其长度大于300bp的3个新序列，Norther印迹证实它都来源于肝癌组织。结论：用抑制消减杂交方法构建的肝癌差异表达基因消减cDNA文库富含肝癌特异表达基因，经验证的3个新的cDNA序列可能为肝癌特异的基因序列。     

SEREX技术在筛选疾病相关抗原中的应用

重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)方法是一种筛选疾病相关抗原的有效分析方法,其筛选鉴定的疾病抗原不仅可对疾病进行早期检测,还能作为免疫治疗的靶标.本综述从肿瘤和其它具有免疫原性的疾病方面介绍了SEREX技术的应用价值,在总结SEREX缺点的基础上提出了SEREX技术的改进方向.     

SEREX在肿瘤抗原分析中的研究进展

重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)为一种新的寻找抗原的方法,即利用患者自体血清对重组表达的cDNA克隆进行筛选,以获得相关抗原基因.这类抗原在荷瘤患者体内能诱导出多重免疫反应,且其核苷酸序列和蛋白质结构较易在分子水平确定,这一方法的运用,为发现新的肿瘤抗原开辟了一个崭新的领域,为肿瘤的免疫治疗的发展提供了一个现实的基础.     

类风湿关节炎滑膜组织cDNA文库的构建及自身抗原的筛选和鉴定

目的 通过SEREX（serological analysis of recombinant cDNA expression library）技术对类风湿关节炎滑膜组织cDNA文库进行初步筛选,得到新的类风湿关节炎自身抗原.方法 利用SMART技术构建类风湿关节炎患者滑膜组织cDNA文库,并对该文库进行SEREX筛选,获得特异性结合阳性克隆,对阳性克隆同源性分析.然后进行酶联免疫吸附实验（ELISA）验证,分析该阳性克隆对于类风湿关节炎诊断临床敏感度和特异度.结果 构建cDNA文库滴度约为6.89×10^6 pfu/mL,筛选文库获得12个阳性克隆,同源性分析3个阳性克隆插入片段为已知蛋白,分别是：Filaggrin、SERPINE2和p68.进行血清学初步验证,抗-Filaggrin和抗-SERPINE2具有高敏感度和低特异度,而抗-p68具有高敏感度和高特异度.结论 抗-Filaggrin、抗-SERPINE2和抗-p68对于类风湿关节炎的诊断具有不同的敏感度和特异度.     

卵巢上皮癌相关肿瘤抗原新基因的研究

目的探讨卵巢癌相关肿瘤抗原新基因在卵巢癌诊断和免疫治疗中的应用价值。方法利用网上生物信息学分析软件对筛选到的55个克隆的核苷酸序列进行分析,并检测其中8个新基因在卵巢癌患者和正常女性血清中的抗体。结果55个克隆的核苷酸序列代表45个卵巢癌抗原基因,其中8个是国内外首次发现的在GeneBank中尚未登记的新基因,是具有免疫原性的功能基因。其中OCY-142新基因是抑癌基因BARD1的可剪切变异体,可被CD4+和CD8+T细胞识别。8个卵巢癌肿瘤抗原新基因中7个在卵巢癌患者血清中的阳性率显著高于正常人,7个卵巢癌肿瘤抗原新基因对卵巢癌患者和正常女性进行联合检测,其敏感性和特异性达到96.9%和95.2%。CAl25异常的卵巢癌41例患者中,OCY-142单独检测的阳性率为95.12%,而CA125正常的卵巢癌57例患者中,OCY-142检测发现21例(36.9%)阳性。结论这些卵巢癌相关肿瘤抗原新基因在卵巢癌患者血清中产生的相应抗体可能成为卵巢癌的新的血清学标志物,可能是卵巢癌免疫治疗理想的新靶点。     

人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.方法:从2株人大肠癌细胞CCL-187和CX-1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、Xho Ⅰ酶切、过柱分级分离,除去＜400 bp片段.收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.结果:构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109 pfμ/L,重组率97%.重组子插入cDNA片段平均大小1 kb以上.结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础.     

Construction of cDNA library from NPC tissue and screening of antigenic genes

To construct cDNA library of nasopharyngeal carcinoma (NPC) and obtain the NPC associated or specific antigens from it, we used a powerful new method to identify the antigens eliciting humoral immune response, which is SEREX (serological identification of antigen by recombinant cDNA expression library). Autologous serum of NPC patient was used to screen the reactive clones in the human NPC tissue cDNA library consisted of 3.64×106 recombinants. The 23 exact positive clones were subcloned to monoclonality and the size of cDNA inserts was identified by PCR. Then the nucleotide sequence of cDNA inserts was determined, and the sequence alignments were performed with BLAST software on GenBank database. They represented 16 different antigens. A detailed sequence analysis showed that 10 of 16 genes were high homologous to genes known in GenBank, such as RPL31, S100 A2, MT2A, etc. However, there were also 6 genes with low homology to genes in GenBank. Furthermore, 3 of 6 genes may be novel genes. The associations of these genes to NPC and the roles that they played in the occurrence and development of NPC should be further revealed.     

人胎肝cDNA文库的免疫学筛选

用人胎肝组织粗提物多克隆抗体对构建的人胎肝ｃＤＮＡ文库进行免疫学筛选，筛选约１０＾６重组子后，得到９株阳性克隆，５株阳性克隆核苷酸序列表明：３株为ａ１株蛋白ｃＤＮＡ序列，２株为未报道序列。     

卵巢癌自身抗体谱研究及应用

目的 肿瘤自身抗原可以诱导机体免疫反应,产生与肿瘤相关的自身抗体.因此,在肿瘤患者血清中存在肿瘤自身抗体谱.本研究拟寻找鉴定卵巢癌自身抗体谱,研究这些自身抗体作为卵巢癌诊断候选血清标志物的可能性;同时鉴定这些自身抗体的抗原,为卵巢癌的免疫治疗提供候选靶抗原.方法 用卵巢癌组织建立了库容量达1.82×106pfu的cDNA表达文库,用卵巢癌患者血清进行了文库血清学分析(SEREX),筛选获了阳性抗原克隆,进一步分析了其中5个克隆与48例卵巢癌48例正常人血清的反应情况.结果 获得的67个阳性克隆中,5个克隆与已知EST序列明显无同源性,另外49个克隆与已知基因高度同源.BHLHB2等5个抗原克隆与卵巢癌患者和正常人血清反应阳性率分别为41.6%(14.6%)、29.2%(6.25%)、29.2%(12.5%)、31%(18.7%)、31%(6.2%).联合5个克隆诊断卵巢癌的敏感性为81%,特异性75%.结论 本研究发现的45个卵巢癌抗原可能作为卵巢癌诊断新的候选血清学标志物和免疫治疗潜在分子靶点.BHLHB2等5个克隆与卵巢癌患者血清的反应阳性率明显高于正常人的血清,5个克隆联合诊断卵巢癌有较好的敏感性和特异性,其相关自身抗体可作为卵巢癌诊断的血清标志物.     

Identification and characterization of cDNA clones encoding antigens of Eimeria tenella

An Eimeria tenella cDNA library was constructed in the expression vector λgt11 from poly (A⁺) RNA extracted from sporulating oocysts. The library was screened with rabbit antiserum raised against antigens extracted from fully sporulated oocysts. All of the antigen-expressing plaque-purified clones were initially characterized by cross screening with antisera raised against different stages of the E. tenella life cycle, as well as with antiserum raised against sporozoites of a related species, namely E. acervulina. A selected number of clones were further characterized by antibody selection coupled with immunoblotting and DNA cross hybridization. Three different E. tenella antigens were identified. All three appear to be constitutively expressed at the protein level during sporogony.     

趋化因子受体CCR7的表达与卵巢癌淋巴管入侵及淋巴结转移的关系

目的 观察趋化因子受体CCR7在卵巢癌组织内的表达情况,分析CCR7的表达与肿瘤淋巴管入侵和淋巴结转移之间的关系。方法 取临床资料完整的卵巢癌病例64例,其中,淋巴结转移组40例,无淋巴结转移组24例。应用免疫组化法和Western blot技术观察CCR7在卵巢癌组织内的表达。以D2-40作为淋巴管内皮特异性标记物,观察卵巢癌组织内肿瘤淋巴管入侵的情况。结果 免疫组化法和Western blot检测结果表明,CCR7表达于卵巢癌细胞浆和胞膜内,有淋巴结转移组的表达量明显高于无淋巴结转移组(p<0.05)。D2-40表达于卵巢癌组织内淋巴管内皮细胞,肿瘤淋巴管入侵在CCR7阳性组的发生率明显高于CCR7阴性组的发生率,CCR7表达与肿瘤淋巴管入侵发生率有显著相关性(p<0.05)。结论 CCR7的表达与卵巢癌发生肿瘤淋巴管入侵和淋巴结转移密切相关,提示CCR7在卵巢癌淋巴结转移中可能起重要作用。     

从人T细胞淋巴瘤cDNA文库中筛选含PH结构域编码序列的新基因

目的 从T细胞中获得更多含PH结构域编码序列的新基因。方法 采用低严谨核酸杂交技术，根据T细胞中已知的PH结构域的分子设计探针，对人T细胞淋巴瘤cDNA文库进行筛选。结果 在筛选过程中得到了4个新基因，各cDNA长度依次为：1733bp,2308bp,2130bp和1647bp，分别编码含229，376，211和143个氨基酸残基的多肽。经生物信息学分析，在基因数据库中未发现与此4种cDNA序列类似的基因。该4个基因均已被GenBank收录，登录号分别为：AF334588，AF334589，AF334590和AF334792。结论 这些新基因的获得及进一步研究，可能会为深入探讨T细胞激活机制提供新的线索。