2种制备Taq DNA聚合酶方法的比较

目的比较2种制备纯化Taq DNA聚合酶的方法,为PCR提供实验用酶。方法Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli菌株,IPTG诱导12 h后收集菌体,分别用硫酸铵沉淀法和冻融法进行纯化,SDS-PAGE电泳和PCR扩增分析比较其纯度和活性。结果硫酸铵沉淀法制备的Taq DNA聚合酶活性能可有效扩增DNA片段;冻融法制备的Taq DNA聚合酶活性较低。结论硫酸铵沉淀法制备的Taq DNA聚合酶优于冻融法,能够达到分子生物学实验中基因扩增的要求。     

解除膜板DNA中杂质对Taq DNA聚合酶抑制作用的方法

在应用常规Kunkel法,提取甲型血友病家系成员外周血白细胞DNA为模板扩增F8C基因,进行RFLP连锁分析时,我们发现,有些DNA样品,不论是提高变性温度还是延长变性时间,都不能通过PCR扩增出恃异性产物。对这些样品,我们采取了如下处理方法:     

大肠杆菌表达耐热DNA聚合酶的纯化和鉴定

探讨工程菌表达的耐热ＤＮＡ聚合酶的纯化方法。（２）方法收集ＩＰＴＧ诱导带有耐热ＤＮＡ聚合酶（ＴＤ聚合酶）基因表达质粒的工程菌株ＤＮ－ＴＤ４，用溶菌酶裂解，６０℃处理后，上清液用硫酸铵沉淀，根据溶解度差异进行粗分级，然后进行离子交欣慰以析细分级，并经聚合酶链式反应鉴定其活性。     

基因重组Taq DNA聚合酶的制备

目的制备重组Taq DNA聚合酶,为PCR提供试剂。方法用Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli菌株,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导12 h表达Taq DNA聚合酶,溶菌酶、NP40裂解细菌,硫酸铵沉淀、4℃透析,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和PCR扩增分析其纯度和活性。结果分离纯化制备的Taq酶,纯度、活性都可与同类产品相比,能有效扩增DNA片段。结论该方法制备可用于PCR的Taq酶具有快速简便的优点。     

DNA聚合酶ξ的研究概况

近年来 ,随着真核细胞ＤＮＡ体外模型的建立 ,蛋白纯化技术的提高 ,以及对ＤＮＡ聚合酶基因的克隆 ,对真核细胞ＤＮＡ聚合酶研究取得了很大进展 ,目前已经在人体细胞中发现了 15种ＤＮＡ聚合酶 ,并分为以下 4类 :Ａ类 ,包括γ、θ及其它聚合酶 ,γ是目前发现的唯一存在于线粒体的聚合酶 ;Ｂ类 ,包括α、δ、ε和ζ ,主要参与ＤＮＡ复制和修复 ,ＤＮＡｐｏｌα主要在ＤＮＡ半保留复制中起作用 ,ＤＮＡｐｏｌδ和ε参与核苷酸切除修复 ,增殖性细胞核抗原 (ＰＣＮＡ)对它们的辅助作用是相近的 ;Ｘ类 ,包括β、λ、μ和σ ,ＤＮＡｐｏｌβ参与短…     

结核杆菌DNA聚合酶链反应技术的应用

结核杆菌ＤＮＡ聚合酶链反应技术的应用李秀珍莫英曼（贵阳医学院附院肺内科贵阳５５０００４）结核病是长期以来危害人类健康的常见病，以往结核病的实验室检查依赖于涂片和培养，现在由于免疫学和分子生物学在医学领域中的应用，使结核病诊断的准确性有了很大程度的提高...     

乙型肝炎病毒感染DNA聚合酶的检测

应用氚标核苷酸标记被检者血清中HBVDNA聚合酶-P(DNA-P)活性,结果表明,此项检测比目前临床上肝炎病毒5项检测敏感,对乙型肝炎的临床诊断有重要意义。     

E.coli中的alkA基因启动子分离纯化

含有alkA基因启动子的质粒pMCP1000经用限制性内切酶EcoRI酶切、酶Ba131修饰和T_4DNA连接酶连接,重组成新质粒,命名为pAY系列。EMB琼脂板培养筛选,限制性内切酶EcoRI、SalI和BamHI酶切和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出最短的有活性的alkA基因启动子,pAY108。DNA序列分析证明在启动子上游区-49到起始密码区与1984年Nakabeppu报道的alkA基因启动子序列一致。β-半乳糖苷酶试验证明与野生型活性近似。     

DNA聚合酶β对DNAγ线辐射损伤的修复作用

采用ＤＮＡ聚合酶专一性抑制剂，观察ＤＮＡ聚合酶β对ＤＮＡｒ线损伤的修复作用。结果表明：在重组大鼠ＤＮＡ聚合酶β作用下，［＾３Ｈ］－ＴＴＰ掺入率明显高于未照组（Ｐ＜０．０１）；在一定剂量范围内（肝细胞小于２０ｇｙ，ＳＭＭＣ－ＬＴＮＭ肝癌细胞小于５Ｇｙ），［＾３Ｈ－ＴＩＰ掺入率随照射剂量增加而升高， 继续增加照射剂量时，［＾３］－ＴＴＰ掺入率反而下降；在同一剂量下，不同剂量率照射线这间ＤＮＡ聚合酶β的     

结核病核酸疫苗纯化过程的初步研究

对结核病核酸疫苗的质粒DNA的制备性纯化过程进行了初步研究。此工艺主要包括以简化的碱裂解法处理大肠杆菌、超滤与离心法除大部分杂质并浓缩样品、Q-Sepharose阴离子交换层析、DNA B ioSepharTMFF亲和层析等步骤,以去除细胞RNA和蛋白等杂质,并对不同分子结构的质粒DNA作分离。结果表明:以碱裂液中质粒DNA为计算基准的得率为56.61%、超螺旋质粒DNA的电泳纯度100%。     

海洛因依赖与多巴胺D2受体基因Taq I A多态性的关联研究

目的探讨海洛因依赖和多巴胺D2受体基因的关系．方法应用聚合酶链反应技术检测209例海洛因依赖者和109名正常对照多巴胺D2受体基因Taq I A多态性．结果海洛因依赖者和对照组之间的上述的基因型和等位基因频率的差异无显著性（P〉0．05）．结论多巴胺D2受体基因Taq I A多态性与海洛因依赖无关联．     

一种简便快速制备多聚酶链反应模板的方法

在多聚酶链反应时采用一种快速简便的模板ＤＮＡ制备方法。组织块在冰浴中剪碎和匀浆，再用蛋白酶Ｋ降解；细胞则直接用蛋白酶Ｋ处理。离心后，取上清则可直接作为ＰＣＲ的模板。采用此方法制备的模板，经ＰＣＲ扩增，检测宫颈细胞、细胞培养物、口腔肿瘤活检组织中ＨＰＶ６、１１和ＨＳＶ的感染，取得了满意的结果。揭示该方法能从各种细胞和组织中制备ＰＣＲ的模板，而无需用ＳＤＳ－苯酚－氯仿抽提ＤＮＡ。     

DNA探针的PCR标记法

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ片段进行地高辛配基标记制备探针，与经典的随机引物标记法相比较，ＰＣＲ标记法能使探针产量明显提高，而且快速、经济，值得进一步应用和探讨。     

快速蛋白液相色谱系统纯化和分析小鼠肝癌细胞热休克蛋白70例的研究

目的：应用快速蛋白液相色谱（FRLC）系统建立分离和纯化615系小鼠肝癌细胞Hcaf细胞膜上热休克蛋白（HSP70）的分离方法。方法：用经43℃热处理8h的Hcaf细胞制备裂解液,用ConA-Sepharose4B和MonoQ柱进行连续分离,所得蛋白经电泳及Western-blot进行蛋白分子量及性质鉴定。结果：纯化蛋白经鉴定分子量70000的HSP70。结论：用此层析法经FRLP可分离纯度较高的HSP70。     

人类mdr1基因新型Taq Man-MGB探针实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种比现有方法敏感、特异性高、重复性好的实时荧光定量PCR检测的新方法检测人类mdr1基因。方法以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1/A为阳性模板,用Primerexpress2.0引物设计软件设计引物和TaqMan-MGB探针,建立荧光定量PCR检测方法。结果当待扩增DNA浓度在3.601×103cps/ml～3.601×109cps/ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,相关系数r2大于0.98。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确度高等优点,可作为进一步研究人类mdr1基因的方法。     

基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化

目的 对来自于日本七鳃鳗的基因重组蛋白L243包涵体进行变性、复性与纯化,以获得成分均一的活性蛋白.方法 以6 mol/L尿素为变性剂,以0.1 mol/L氧化型谷胱甘肽及0.9 mol/L还原型谷胱甘肽为复性剂,对构建于pET23b的日本七鳃鳗L243基因在大肠杆菌Rosetta中表达的包涵体进行了的变性、复性与组氨酸亲和层析纯化.结果 经变性、复性后,获得了均质的L243纯化蛋白,该蛋白的复性率达80%.结论 成功对上述重组蛋白包涵体进行了变性、复性及纯化,为后续与此蛋白相关的生物活性测定奠定了物质基础.     

一种改进的显微注射用DNA片段的纯化方法

目的显微注射用DNA的纯度是影响转基因动物制备成功与否的重要因素,本文建立一种可行的适用于普通实验室的纯化DNA方法,替代普遍使用的试剂盒纯化方法。方法分别使用酚-氯仿多次抽提法及常规的凝胶提取试剂盒纯化含有蚓激酶基因的DNA片段,通过显微注射技术将纯化的DNA片段导入小鼠受精卵的原核,制备转基因小鼠。根据转基因实验的结果对两种方法进行比较。结果使用两种方法纯化DNA均能获得转基因小鼠。在DNA纯度及注射卵的存活率上,两种方法无明显差别;在移植卵的出生率及转基因阳性率上,抽提法优于试剂盒法。结论本实验建立的抽提方法可以替代试剂盒方法纯化显微注射用DNA片段,在降低实验成本、简化实验条件及提高转基因阳性率方面具有优势。