大肠杆菌poly(A)化mRNA基因片段的RD-PCR克隆

目的研究大肠杆菌(E.coli)中哪些基因mRNA3'端存在poly(A)化。方法利用E.colimRNA中可能存在的poly(A)尾,以oligo(dT)-cellulose进行mRNA的纯化,并以oligo(dT)18为引物逆转录合成cDNA,应用限制性显示-聚合酶链反应(RD-PCR)分离不同组别的基因片段并进行克隆。结果成功克隆100多个基因片段,并对其中30个进行了测序分析。结论细菌mRNA的poly(A)化可能不是偶然和个别的现象。     

大肠杆菌poly（A）化mRNA cDNA文库的构建与鉴定

目的：构建和鉴定大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库。方法：应用限制性显示PCR技术构建大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库，筛选，收集cDNA片段，并进行测序。根据测序结果进行初步的生物信息学分析和结果验证。结果：构建了大肠杆菌poly(A)化mRNA的限制性cDNA文库，并对其中66个基因片段进行了分析，结论：所构建的大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库片段重复性低，质量高。     

黑素瘤抗原-a基因在煤焦沥青烟气诱发小鼠肺癌组织中的表达及其意义

目的：探讨煤焦沥青（CTP）烟气诱发小鼠肺癌组织中黑素瘤抗原－a(mage-a)基因mRNA的表达及其意义。方法：CTP烟气诱发小鼠肺癌，提取癌组织中RNA，用逆转录－巢式聚合酶链反应（RT－PCR）方法对癌组织和相应癌旁组织mage-a mRNA表达情况进行研究；pUC18质粒克隆，大肠杆菌DH5α转化；PE－377DNA测序仪对2个阳性克隆中的目的基因片段进行DNA序列测定。结果：实验组29只小鼠中8只诱发出肺癌（8／29）；8只小鼠肺癌中，有5只癌组织mage-a mRNA表达阳性（5／8）；相应的癌旁组织均未表达。DNA序列测定证明扩增产物中目的基因片段均为mage-a cDNA序列。结论：小鼠肺癌组织中mage-a mRNA呈高比例表达，CTP烟气诱发小鼠肺癌可能是MAGE－A抗原肺癌免疫治疗的理想模型。     

大肠杆菌poly(A)化mRNA cDNA文库的构建与鉴定

目的构建和鉴定大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库。方法应用限制性显示PCR技术构建大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库,筛选、收集cDNA片段,并进行测序。根据测序结果进行初步的生物信息学分析和结果验证。结果构建了大肠杆菌poly(A)化mRNA的限制性cDNA文库,并对其中66个基因片段进行了分析。结论所构建的大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库片段重复性低,质量高。     

骨肉瘤cDNA文库的构建和筛选

目的 研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在骨肉瘤发生、发展中的作用,构建SAOS-2细胞cDNA文库,寻找与BMP-2相关作用蛋白.方法 从骨肉瘤细胞系SAOS-2中提取总RNA,进而分离poly(A) RNA,用poly(A) RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组.通过文库片段,线形化的pGADT7-Rec和诱饵质粒pGBKT7/HA-BMP-2共转化酵母AH109菌株在文库构建的同时进行与BMP-2相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线形化的pGADT7-Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选.最后用Far-Western blotting法进一步从体外论证BMP-2相互作用蛋白.结果 构建了具有基因多样性和库容量足够大的骨肉瘤cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000 bp.共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105.接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106.筛选到四个与BMP-2相互作用的阳性克隆.结论 此文库的多样性和库容量均符合筛选需求.可用于骨肉瘤相关基因的进一步筛选.     

mRNA差异显示法在分离肿瘤转移相关基因中的初步应用

用mRNA差异显示技术（mRNAdifferentialdisplay）对分别用200U／ml重组人IFN－a和IFN－Υ处理的MA891肿瘤细胞系总mRNA进行分析，分离出10个差异表达的片段，并进行了克隆。因IFN－a抑制MA891细胞系的肺转移能力，而IFN－Υ则增强其肺转移能力，故认为该10个片段所代表的基因中可能有某个或几个基因与肿瘤转移有关。     

爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A cDNA的克隆及序列分析

目的：克隆爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因，研究其基因工程疫苗，方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出EBV B95．8株LMP2A全部编码蛋白的基因，并克隆至载体pGEM-T中，通过α－插入失活，PCR及EcoRⅠ、SmaⅠ限制性内切酶双酶切等鉴定重组质粒，采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸 序列。结果：克隆出LMP2A第1个外显子到第8个外显子的全部编码蛋白的cDNA，测序结果与EB病毒B95．8原型株LMP2AcDNA作同源比较，完全一致，结论：本实验克隆了LMP2A基因的全部编码蛋白的cDNA全长片段。     

肺癌组织中黑色素瘤抗原-3基因mRNA的表达

目的：检测肺癌组织中黑色素瘤抗原－3基因（MAGE－3）mRNA的表达，方法；用逆转录－套式聚合酶链反应（RT－PCR）对31例肺癌患者癌组织和相应癌旁组织MAGE－3 mRNA表达情况进行测定；PE－377DNA测序仪对5例10个RT－PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA序列测定。结果：31例肺癌患者癌组织中26例表达MAGE－3 mRNA，阳性率为83.9%；相应的癌旁组织均未表达。DNA序列测定证明PCR扩增产物中目的基因片段均为MAGE－3 cDNA序列，所测5例样本中4例样本有2个相同位置的碱基发生了点突变，导致一个氨基酸残基改变。结论：（1）MAGE－3 mRNA在肺癌中呈高比例表达，提示此抗原有可能作为肺癌患者免疫治疗的靶抗原；（2）我国肺癌患者中存在MAGE-3基因个别位点的变异。     

HIV—1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的：克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（RD－PCR）扩增的HIV－1基因片段。方法：将所有HIV－1基因片段分成10组并进行RD－RCR扩增,纯化各组PCR产物后将之克隆至T载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩增靶片段并测序。结果：序列分析表明,所扩增的片段均属于HIV基因。结论：改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并用于限制性显示扩增片段的克隆。     

应用简并引物RT—PCR扩增锌指结构域筛选新基因

目的：应用简并引物RT－PCR扩增并克隆TF－ⅢA型锌指蛋白基因表达序称标签（EST）,以最终获得新的锌指蛋白基因,方法：分别用TPA和Hemin诱导人红白血病（HEL）细胞,提取总RNA。根据TF－ⅢA型锌指蛋白保守序列设计简并引物,并以之进行RT－PCR扩增,然后将其克隆到pGEM-T easy载体中测序,应用DNAsis软件分析序列并通过GenBankblast进行序列比较。结果：克隆并测序了30个扩增片段,22个是锌指蛋白基因的EST,其中17个是新的锌指蛋白基因EST。结论：应用简并引物RT－PCR克隆一些具有保守所酸顺序结构域的蛋白基因EST是可行的。并具有简便,高效等优点,此外,还可有目的地克隆一些具有重要功能结构域的蛋白质基因。     

应用70mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法 酵母经常规培养，抽提mRNA逆转录成cDNA后，经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段，根据目的基因SSAl设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记，与oligo阵列杂交，洗脱，扫描：然后进行杂交后剥除．收集剥除液．采用限制性通用引物扩增，产物克隆于PUC18T载体中，并转化至JM109大肠杆菌中培养，抽提质粒，进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明，用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因，而无需构建cDNA文库。另外，本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

应用70 mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法酵母经常规培养,抽提mRNA逆转录成cDNA后,经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段,根据目的基因SSA1设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记,与oligo阵列杂交,洗脱,扫描。然后进行杂交后剥除,收集剥除液,采用限制性通用引物扩增,产物克隆于PUC18T载体中,并转化至JM109大肠杆菌中培养,抽提质粒,进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明,用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因,而无需构建cDNA文库。另外,本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

信号分子GRF的PH结构域基因片段的克隆与表达

目的：从大鼠脾脏克隆信号分子ｇｕａｎｉｎｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＦＲ）的ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｂｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）结构域基因并进行谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合表达,为进一步寻找其新配基、研究其功能打下基础。方法：采用一步法从大鼠新鲜脾组织中提取总ＲＮＡ,反转录合成ｃＮＤＡ,ＰＣＲ方法扩增目的基因片段,并克隆到载体ｐＵＣ１９中。引物末端标记后,以双脱氧终止法     

容量调控氯通道基因siRNA表达载体的构建及其沉寂效应检测

目的:构建针对容量调控氯通道基因(CLC3)的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对CLC3基因的干扰作用. 方法:设计CLC3靶向的发夹状siRNA,据此设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPER载体,转化扩增后进行序列测定. 用脂质体转染法转染胃癌细胞SGC7901,通过RT-PCR、间接免疫荧光检测CLC3基因表达水平的变化. 结果:把针对CLC3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pSUPER载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确,稳定转染人胃癌细胞SGC7901后, RT-PCR、间接免疫荧光检测表明,CLC3基因的表达水平明显降低. 结论:构建了针对CLC3基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制CLC3基因表达.     

人组织因子基因RNA干扰载体的构建与鉴定

目的 构建人组织因子基因RNA干扰载体,为达到阻止凝血过程的启动打下基础.方法 利用Invitrogen公司在线软件设计人组织因子基因(NM 001993)干扰片段,合成shRNA序列,再制备双链寡核苷酸(ds oligo),退火后形成的ds oligo双链克隆到pENTRTM/U6载体的粘性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒DNA小提、测序.将构建的载体转染到脐静脉内皮细胞,应用RT-PCR和免疫荧光验证载体对目的基因的干扰情况.结果 测序证实阳性克隆为pENTRTM/U6-TF-shRNA,转染到脐静脉内皮细胞后组织因子的表达受到明显抑制.结论 成功构建出凝血途径的人组织因子基因RNA干扰载体,为研究组织因子基因RNA干扰载体在凝血疾病中的应用提供了稳定的转染细胞载体.     

结核分枝杆菌复活促进因子B的原核表达、鉴定和纯化

目的:构建结核分枝杆菌复活促进因子B(RpfB)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfB基因(1089bp),然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a( )载体连接,转入大肠杆菌Top10;阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定.测序正确后,将重组质粒转化到的大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了RpfB蛋白;利用Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,最后对目的蛋白进行纯化.结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致.经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现61KDa处有特异性蛋白条带.结论:成功克隆并构建了RpfB基因的重组表达质粒pET32a( )-RpfBv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

大鼠肝再生增强因子编码区的cDNA克隆和原核表达

目的：克隆大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）编码区ｃＤＮＡ并进行原核表达。方法：提取新生大鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，再以我们设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增获取大鼠肝再生增强因子编码区双链ｃＤＮＡ；以基因重组技术构建大鼠ＡＬＲ的原核表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌内以ＩＰＴＧ诱导表达。结果：成功克隆出大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ，其序列与以前报道的完全一致；构建的大鼠ＡＬＲ原核表达重组质粒在大肠杆菌内高效表达ｒＡＬＲ融合蛋白，其表达量占菌体蛋白３０％。结论：大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ的克隆及其在大肠杆菌的高效表达为ＡＬＲ的深入研究奠定了基础。     

人甲状旁腺素N端34肽基因的合成,克隆及融合表达

选用大肠杆菌偏爱的密码子,用计算机辅助设计、合成长度分别为59 、59 及60 碱基的三段寡核苷酸。以中段寡核苷酸为模板,两端寡核苷酸为引物,经PCR 合成完整的hPTH(134) 基因,并克隆到pUC18 载体中。对克隆基因进行序列分析,结果与设计的完全一致。将该基因与表达载体pKA 连接构建表达质粒pKAT,转化大肠杆菌JM105 细胞,SDSPAGE 表明hPTH(134) 融合蛋白获得了表达,并且酸水解后融合蛋白被裂解为大小两个片段。