脐血CD34^＋细胞体外扩增的实验研究

目的 探讨脐血造血细胞体外扩增及其移植的最佳时期。方法 用免疫磁珠法分离纯化人脐血CD34^ 细胞,从CD34^ 细胞不同体外培养系中取样检测细胞总数、CD34^ 细胞百分率和ＣＦＣ（包括ＣＦＵ－ＧＭ和ＢＦＵ－Ｅ）。结果 Ａ组（加rhSCF、rhIL-3、rhG-CSF、rhＴＰＯ）与Ｂ组（加rhFL、rhＩＬ－3、rhG-CSF、rhEpo及rhTPO)对各阶段造血细胞扩增效果无显差异。Ｃ组（加rhSCF、rhCSF与rhFL有明显的协调效应;培养７d时开始增多,培养１４d进入高峰。培养２１d开始下降。培养２８d明显下降。结论 Ｃ组能明显扩增人脐血造血细胞,培养７－１４d造血细胞达高峰。为移植最佳时间。     

人脐血CD34^＋细胞的分离纯化及电镜观察

采用ＭＡＣＳ吸附单克隆抗体－磁珠分离系统对人脐血ＣＤ３４＾＋细胞进行了分离及透射电镜观察，结果显示：ＣＤ３４＾＋细胞为形态，大小不均一的单个核细胞群体，细胞直径介于５￣１０ｕｍ，其中少数细胞胞体大而圆，细胞核圆，核膜凹陷浅，核染色质细而弥散，核周胞质少，游离核糖体较多，线粒体少且形态特殊，即线粒体嵴内间隙较大，此形态特征与造血干细胞之间的关系尚有待进一步研究证实。     

脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离及功能特征的比较

目的分离成人外周血、脐血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞,并检测其功能,以了解脐血CD4^＋CD25^＋T细胞的特性。方法应用免疫磁珠分选法从健康成人外周血、脐血淋巴细胞中分离纯化CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞。应用流式细胞术检测分离纯度,胎盘蓝染色检测细胞存活率;RT-PCR技术检测CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞中Foxp3的mRNA的表达;体外增殖实验检测其对CD4＋CD25-T细胞的免疫抑制作用。结果 MACS分离的CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4＋CD25-T细胞纯度达（92.7±1.6）%、（90.3±1.2）%,细胞存活率达（95.3±2.1）%;体外经抗CD3、CD28单克隆抗体刺激培养的脐血及成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞同时得到扩增,而且高表达Foxp3;CD4^＋CD25^＋T细胞能有效的抑制效应T细胞的增殖,当效靶比为1︰1时,其抑制效应T细胞的作用最强,成人外周血抑制率为（81.36±1.61）%、脐血抑制率为（90.74±2.43）%。结论脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞是一群具有免疫抑制功能的调节性T细胞,与成人外周血相比,培养后的脐血CD4^＋CD25^＋T细胞比成人外周血有更强的免疫抑制功能。     

应用免疫磁珠法富集慢性髓性白血病骨髓CD34^＋细胞

利用免疫磁珠法 (MACS)富集慢性髓性白血病骨髓单个核细胞 (MNC)中的CD34 细胞 ,用流式细胞术检测富集前后CD34 细胞纯度。结果表明 ,富集前CD34 细胞纯度为 2 .3 %± 0 .4% ( x±SD ,下同 ) ,富集后纯度为 90 .68%± 3 .0 2 % ,仍保持细胞活力。该法简便、快速、富集纯度高 ,为分离纯化CML骨髓中的CD34 细胞提供了有效方法。     

脐血CD34+细胞高效分选技术的建立及应用

CD34+细胞包括造血干细胞和早期的祖细胞,在造血干细胞移植、体外扩增培养及基因治疗等方面都有广泛的应用,但其仅占正常成人外周血的0.05%～0.2%、骨髓的0.5%～3%和脐血的0.1%～0.5%,因此CD34+细胞分选技术越来越重要.通过长时期的摸索,本实验室建立了一套高效的脐血CD34+细胞分选富集技术,并成功地分选了180份脐血样本.     

脐血CD34^＋细胞分离方法比较

目的：比较不同方法分离脐血单个核细胞（MNC）及纯化CD34＋细胞效果。方法：采集脐血48份，在室温下保存12、24、48小时，分别用密度离心法和羟乙基淀粉（HES）沉淀法分离脐血MNC，再用免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞，以台盼蓝拒染法检测细胞存活率。结果：脐血在室温下保存48小时分离MNC和CD34^＋细胞数最多．其次为12小时，在24小时分离所得最低（P〈0．05）；HES沉淀法较密度离心法分离所得MNC和CD34^＋细胞数明显增多（P〈0．05）；6组细胞存活率差异无统计学意义（P〉0．05）；免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞可达（88±5）％的纯度。结论：HES沉淀法优于密度离心法，且48小时分离为优，免疫磁珠法纯化CD34＋细胞可提高纯度：各种方法对细胞存活率无明显影响。     

免疫磁珠法纯化小鼠CD34^＋造血干细胞

目的 探讨免疫磁珠法（MiniMACS)能否用于纯化小鼠骨髓CD34^ 造血干细胞。方法 应用免疫磁珠纯化小鼠骨髓CD34^ 细胞，流式细胞仪（FACS）评估纯化效率，检测纯化后的细胞活力。结果 纯化后CD34^ 细胞纯度81．5％（范围76．80％－85．38％），回收率47．54％（范围40．50％－54．31％），纯化前后细胞活力不受影响（P＝0．169）。结论 应用MiniMACS纯化小鼠骨髓可获得高纯度CD34^ 细胞，并不影响细胞活力。     

人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用

目的研究人脐血基质细胞(hUCBSCs)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用. 方法应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34+细胞,按照DEXTER法行脐血基质细胞培养,观察hUCBSCs的生长状态及细胞表面分子的表达情况.建立以hUCBSCs为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩增体系,并对脐血CD34+细胞短期扩增后行集落形成单位(CFU)-GM、CFU-E和CFU-Mg半固体培养. 结果脐血基质细胞为混合细胞群,包括CD68(+)、Fn(+)、CD31(+)和CD34(-);以hUCBSCs为滋养层的体外扩增体系对脐血CD34+细胞具有明显的扩增作用,体外液体扩增后的脐血CD34+细胞集落形成能力明显高于对照组,其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合hUCBSCs体系的扩增作用最强,hUCBSCs在促进CFU-Mg集落形成的作用中具有明显优势. 结论hUCBSCs具有体外支持造血作用,与细胞因子联合对促进脐血CD34+细胞扩增作用更加明显.hUCBSCs对促进巨核细胞扩增可能具有特殊的意义.     

应用单克隆抗体—免疫磁珠分离系统分离纯化再生障碍性贫血骨髓CD34^＋细胞

目的 分离、纯化再生障碍性贫血(简称AA)患者骨髓CD34^ 细胞，探讨其发病机制。方法 对42例AA患者，以常规方法进行骨髓液采集和有核细胞分离，用单克隆抗体—免疫磁珠分离系统(MACS)分离、纯化骨髓CD34^ 细胞，用碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶(APAAP)法作CD34^ 细胞的纯度检测。结果 骨髓CD34^ 细胞纯度达95％—99％，AA患者骨髓CD34^ 细胞多呈单个、散在分布，着色较淡；而对照组骨髓CD34^ 细胞多呈均匀或丛簇状分布，着色较深。结论 应用MACS分离从骨髓CD34^ 细胞，特异性强、纯度高，是研究从骨髓CD34^ 细胞功能、形态的最直接、客观、准确的方法。     

脐带间充质干细胞对脐血CD_(34)~+祖细胞免疫反应的影响

目的 探讨脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)是否能有效抑制脐血CD_(34)~+祖细胞的免疫反应,影响反应过程中免疫调节细胞因子的分泌.方法 从脐带中分离、培养MSCs,观察其生长形态,流式细胞术检测表面标志;将不同数量的UC-MSCs加入脐血CD_(34)~+祖细胞、外周血单个核细胞(PBMC)共培养体系中作为实验组,不加UC-MSCs的CD_(34)~+祖细胞、PBMC共培养体系为阴性对照;另设用Tramwell将UC-MSCs和脐血CD_(34)~+祖细胞、外周血单个核细胞共培养体系分隔培养,分别收集各组上清液,ELISA检测IFN-γ和IL-10水平.结果 UC-MSCs高表达CD_(105)、CD_(90)、CD_(29)、CD_(49);不表达CD_(40)、CD_(80)、CD_(86)、HLA-DR;加UC-MSCs组与阴性对照组相比,IFN-γ的分泌量减少(19.30±0.78) vs(27.00±1.11),(P＜0.05);IL-10的分泌量增多(50.28±1.29)、vs(31.68±3.08),(P＜0.05).而且具有数量依赖性;Transwell分隔培养组与阴性对照组相比,IFN-γ的分泌量减少(18.33±0.475)vs(27.00±1.11),(P＜0.05);IL-10的分泌量增多(48.47±1.18)vs(31.68±3.085,(P＜0.05);与接触培养组相比,IFN-γ的分泌量增多(18.33±0.47)vs(7.14±0.13),(P＜0.05),IL-10的分泌量减少(85.19±2.36)vs(48.47±1.18),(P＜0.05).结论 UC-MSCs能抑制脐血CD_(34)~+祖细胞的免疫反应中IFN-γ的分泌,同时促进IL-10分泌,并且这种作用部分依赖于细胞间的相互接触.UC-MSCs和CD_(34)~+祖细胞共移植可作为干细胞移植治疗缺血性心肌病的有效方式.     

脐血CD34+细胞向巨核细胞的分化扩增及基因的表达变化

目的研究脐血CD34+细胞向巨核细胞的诱导分化及体外扩增,并观察此过程中巨核细胞特异性基因表达的变化。方法免疫磁珠法分离获得CD34+细胞培养在无血清无基质培养基中,采用TPO+SCF+IL 3+IL 6、 TPO+SCF+IL 3、 TPO+SCF三种不同因子组合对其诱导分化及扩增。收集3、7、10、14?d的扩增产物,运用荧光显微镜检测巨核细胞的表面标志;流式细胞术（FCM）检测巨核细胞的凋亡;对巨核细胞进行DNA含量检测以及荧光定量PCR检测特异性基因表达的变化。结果分离获得的CD34+细胞在体外可以有效扩增,随培养时间的延长,CD34+/CD41+细胞数第7天达最高值,之后逐渐下降;而CD41+、CD42b+、CD61+细胞随培养时间的延长表达量逐渐增高。DNA含量检测发现,随着培养天数的增加,多倍体细胞所占的百分比增加。三种因子组合中TPO+SCF+IL 3+IL 6组扩增效率最高。荧光定量PCR显示转录因子GATA 1、NF E2、TXS、GPIIb和HPRT在第7天表达量最高,之后下降。凋亡转录因子APAF 1随培养天数的延长表达量增加。结论脐血CD34+细胞在体外可向巨核细胞诱导分化及扩增,其基因表达的变化也支持这一结论。     

CD_(34)~+细胞与骨髓增生异常综合征患者生存率的关系

目的　探讨CD34+细胞与骨髓增生异常综合征 (MDS)患者生存率的相关性。方法　应用免疫组化SAP法对 56例MDS患者骨髓细胞CD34抗原进行检测 ,并随访 3～ 5年 ,同时定期门诊复诊及住院治疗。结果　 56例中 ,CD34- 3 3例 ,CD34+2 3例 ,随访 3～ 5年后 ,阴性组 10例 ( 3 0 .3 % )转为急性白血病 (AL) ,阳性组 14例 ( 60 .9% )转为AL ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。 17例RAEB患者中 ,CD34- 中数生存期 4 7月 ,CD34+者 16月 ,3年生存率前者 69% ,后者 2 1.1% .12例CD34+高表达RAEB T患者中 ,转化成AL时间明显缩短。结论　CD34+患者具有高危转为AL ,CD34+高表达RAEB T短期内转化为AL ,提示预后不佳     

脐血CD_(34)~+细胞体外扩增的实验研究

目的　探讨脐血造血细胞体外扩增及其移植的最佳时期。方法　用免疫磁珠法分离纯化人脐血CD+34细胞 ,从CD+34细胞不同体外培养系中取样检测细胞总数、CD+34细胞百分率和CFC(包括CFU -GM和BFU-E)。结果　A组 (加rhSCF、rhIL - 3、rhG -CSF、rhEpo及rhTPO)与B组 (加rhFL、rhIL - 3、rhG -CSF、rhEpo及rhTPO)对各阶段造血细胞扩增效果无显著差异 ,C组 (加rhSCF、rhFL、rhIL - 3、rhG -CSF、rhEpo及rhTPO)各项结果均显著优于A组 (P <0 0 1)和B组 (P <0 0 1) ,rhCSF与rhFL有明显的协调效应 ;培养 7d时开始增多 ,培养 14d进入高峰 ,培养 2 1d开始下降 ,培养 2 8d明显下降。结论　C组能明显扩增人脐血造血细胞 ,培养 7～ 14d造血细胞达高峰 ,为移植最佳时间。     

bFGF诱导脐血CD_(34)~+干细胞基因表达变化的研究

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)体外诱导脐血CD_(34)~+造血干细胞分化的基因表达变化,理解脐血CD_(34)~+造血干细胞的生物学特性,为体外诱导分化和临床应用打下基础.方法 利用MiniMACS免疫磁珠法从脐静脉血单个核细胞中分离出CD_(34)~+造血干细胞,经含千细胞因子(SCF)、bFGF、B27的DMEM/F12细胞营养液培养10～15d,提取培养前后细胞总RNA,利用Oligo GEAArray(R)芯片和GEArray表达分析软件进行芯片数据分析.结果 在所检测的263个基因中,发现10个基因培养后比培养前显著上调,20个基因显著下调.这些基因主要涉及干细胞特异性标志、细胞周期、干细胞分化标志、以及与干细胞相关的信号转导、细胞因子及其受体等.结论 bFGF通过一些特定基因的变化影响脐血CD_(34)~+干细胞增殖分化,有助于从基因水平理解bFGF对CD_(34)~+干细胞增殖分化的影响,促进bFGF诱导的CD_(34)~+细胞在临床上的应用.     

缺氧脐带间充质干细胞对脐血CD34＋祖细胞免疫反应的影响

目的：探讨脐带来源的缺氧间充质干细胞（MSCs）是否能有效抑制脐血CD34＋祖细胞免疫排斥反应,影响反应过程中免疫调节细胞因子的分泌。方法：从脐带中分离、培养MSCs,观察其生长形态,流式细胞术检测其表面标志;将缺氧处理后的脐带MSCs加到脐血CD34＋祖细胞、外周血单个核细胞（PBMc）共培养体系中,96h后收集上清液,ELISA检测IFN-γ和IL-10水平。结栗：脐带MSCs不表达CD40、CD80、CD86、HLA—DR、CD34;缺氧的脐带MSCs能抑制共培养体系中淋巴细胞IFN-γ的分泌（与对照组比,P〈0．05）,同时促进IL-10分泌（与对照组比,P〈0．05）,但与非缺氧脐带MSCs组相比,IFN-γ的分泌量增多,IL-10的分泌量减少。结论：缺氧脐带MSCs能抑制脐血CD34＋祖细胞的免疫排斥反应,抑制IFN-γ的分泌,同时促进IL-10分泌,但与非缺氧脐带MSCs相比,免疫调节功能下调。     

Effect of intracranial transplantation of CD34+ cells derived from human umbilical cord blood in rats with cerebral ischemia

As a source of transplantable stem cells, the CD34^＋ subpopulation in human umbilical cord blood （HUCB） has been used extensively to treat some hematopoietic system diseases. However, whether CD34^＋ cells hold the therapeutic potential to cerebral ischemia is unknown. The purpose of this study was to observe the recovery of neural function after transplantation of CD34^＋ cells derived from HUCB into ischemic cerebral tissue in rats.     

新型的CD_4~+T细胞:Th17细胞

Th17是近年来发现的一种CD4+T细胞亚型,在自身免疫性疾病中发挥重要的作用,其分泌产生几种致炎细胞因子,包括新发现的细胞因子白细胞介素17。Th17产生的细胞因子与Th1、Th2不同并且与其相互对抗。Th17细胞很可能对防御胞外病原菌的感染及自身免疫性疾病产生影响。影响Th17细胞从T细胞前体分化的因素也很快被发现,本文综述了Th17细胞诱导分化的影响因素、产生的细胞因子、在自身免疫病中的作用。     

成人骨髓间充质干细胞对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的: 探讨骨髓间充质干细胞(MSCS)对脐血CD34 细胞体外扩增作用. 方法: 分离培养成人MSCS作为滋养层,联合SCF, IL-11和GM-CSF分别组成对脐血CD34 细胞的不同扩增体系,培养3 wk后观察脐血有核细胞、CFCs以及CD34 细胞扩增倍数的变化. 结果: MSCS联合细胞因子组较其他组培养体系对有核细胞总数、CFCs含量及CD34 细胞含量均具有明显的扩增作用,分别扩增了114.2±2.4, 40.5±8.6, 11.3±0.4 倍. 结论: 成人MSCS协同其他细胞因子可增强脐血CD34 细胞的体外扩增作用.     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。