青光眼患者小梁网细胞线粒体的电镜观察

目的:原发性开角型青光眼(POAG)是一种发病隐匿的不可逆性致盲性眼病,发病机制有待进一步探讨。本研究通过电镜检测方法从小梁细胞线粒体形态改变及细胞连接的异常认识小梁细胞退行性改变,探讨POAG的发病机理。方法:原代培养POAG小梁网(GTM)与正常人的小梁网(NTM)细胞,电镜下对比观察小梁细胞线粒体和细胞连接的形态结构。结果:透射电镜可见培养的NTM细胞胞质内线粒体数量较多,结构完整,嵴的数目和形态正常,细胞连接以缝隙连接为主,结构完整,并可见丰富的粗面内质网,偶可见高尔基体等细胞器;GTM细胞线粒体数目少,形状多为空泡状,嵴多不可见,难以找到完整的细胞连接结构,其它细胞器明显减少。结论:(1)POAG患者小梁细胞的线粒体发生了病理学形态的退行性改变;(2)POAG患者小梁细胞的细胞连接连接出现了病理学形态的异常。提出POAG患者小梁细胞线粒体的形态与功能异常以及小梁细胞的细胞连接异常可能导致小梁网功能异常,推测其与眼压升高及POAG发病密切相关。     

重组人骨形态发生蛋白7对原发性开角型青光眼小梁网细胞增殖的影响

目的 建立原发性开角型青光眼(POAG)小梁网细胞体外原代培养体系; 分析不同终浓度重组人骨形态发生蛋白7(rhBMP7)对POAG小梁网细胞增殖的影响; 探讨rhBMP7与POAG发生、进展的相关性。 方法 取术中切除的带小梁网组织块(未使用丝裂霉素C),进行体外原代及传代培养,取3代小梁网细胞,在CFDA SE标记后,分别加入终浓度为0(对照组),20,50,80,100,200 ng/mL的rhBMP7无血清培养基,采用CCK8、荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测POAG小梁网细胞增殖情况。 结果 细胞经传代培养,经鉴定为POAG小梁网细胞; 采用CCK8法检测发现:经终浓度为0(对照组),20,50,80,100,200 ng/mL的rhBMP7处理后,POAG小梁网细胞吸光度(OD值)分别为:(0.561 2±0.026 9),(0.724 2±0.039 3),(1.416 0±0.016 2),(1.740 4±0.039 2),(1.853 8±0.014 5),(1.936 4±0.054 6); 实验组细胞增殖率分别为1.37%,2.96%,3.70%,3.96%,4.15%; 实验组与对照组及各实验组间增殖率比较,差别具有统计学意义(P<0.05); 荧光显微镜示:随着rhBMP7终浓度的增加,经CFDA SE标记的POAG小梁网细胞荧光染色变浅、细胞量及密度增加; 采用流式细胞仪检测经20,50,80,100,200 ng/mL终浓度rhBMP7干预的POAG患者小梁网细胞,分裂、增殖细胞所占的比例分别为17.85%,18.63%,20.10%,27.45%,72.41%。 结论 运用组织块培养法,可体外原代培养出POAG患者的小梁网细胞; rhBMP7在一定程度上可促进POAG小梁网细胞的增殖,且在一定范围内呈剂量依赖性。     

利福平对鱼藤酮致分化PC12细胞氧化应激的影响

【目的】 探讨利福平对鱼藤酮诱导的分化大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)细胞形态&#65380;活性氧(ROS)&#65380;还原型谷胱甘肽(GSH)及细胞凋亡的影响&#65377;【方法】 利用鱼藤酮诱导分化PC12细胞建立帕金森病体外细胞模型;显微镜下观察细胞形态,酶标仪检测细胞还原型谷胱甘肽,流式细胞仪检测细胞活性氧和凋亡&#65377;【结果】 鱼藤酮组细胞内还原型谷胱甘肽含量低于两对照组,而活性氧含量及凋亡率均高于两对照组;经100&#65380;200和300 μmol/L各浓度利福平预处理后,利福平预防组3组细胞内活性氧含量及凋亡率均低于鱼藤酮组,而细胞内还原型谷胱甘肽含量高于鱼藤酮组,且存在浓度依赖性&#65377;【结论】 利福平可能通过氧化应激途径减轻鱼藤酮诱导的分化PC12细胞的损伤作用,且存在浓度依赖性&#65377;     

鱼藤酮致PC12细胞线粒体功能及超微结构的影响

目的检测不同浓度鱼藤酮对体外培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(pheochromaffinoma,PC12)细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体跨膜电位(用△Ψm表示)及超微结构的作用,以探讨鱼藤酮损害线粒体的可能机制.方法应用流式细胞仪检测鱼藤酮对PC12细胞ROS的影响,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测线粒体跨膜电位及透射电镜观察超微结构的变化.结果0.1、1.0、2.0和3.0μmol/L浓度的鱼藤酮可诱导细胞产生ROS分别为1.55±0.17、2.16±0.10、1.77±0.20和1.40±O.12,损坏△Ψm分别为93.86±10.12、119.43±7.09、102.71±9.36和83.14±10.70,与其对照组比较具有显著性差异(P＜0.01),实验组中以1.0 μmol/L鱼藤酮作用最显著(P＜0.01).当鱼藤酮浓度大于1.0μmol/L时,其作用呈现剂量依赖性递减.电镜下多数细胞线粒体形态异常,表现为:局部水肿、部分线粒体嵴排列紊乱、线粒体髓样变及空泡样变性等.结论鱼藤酮诱导ROS生成、损伤线粒体△Ψm及改变线粒体超微结构,可导致线粒体功能障碍.     

姜黄素通过抗氧化作用拮抗鱼藤酮致PC12细胞损伤的研究

目的 探讨姜黄素(Cur)对鱼藤酮(Ro)致PC12细胞损伤的保护作用及其机制.方法 用鱼藤酮建立PC12细胞损伤模型;用四氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖活力;苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化;比色法检测细胞内总超氧化物歧化酶(SOD)的活性;DCFH-DA染色检测细胞内活性氧类物质(ROS)水平;流式细胞术(Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法)检测PC12细胞的凋亡.结果 0.5 μmol/L姜黄素和1.0 μmol/L姜黄素均可减轻0.1 μmol/L鱼藤酮对PC12 细胞增殖活力的抑制,与鱼藤酮组比较差异有统计学意义(P＜0.01);明显减轻了细胞损伤的形态学改变;明显增加了 PC12 细胞内SOD的活性,与鱼藤酮组比较差异有统计学意义(P＜0.05);明显降低了PC12细胞内ROS的含量,明显抑制了鱼藤酮对PC12 细胞凋亡的诱导作用,与鱼藤酮组比较差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 姜黄素可拮抗鱼藤酮致PC12细胞的损伤,其机制可能与清除细胞内ROS,诱导抗氧化酶的活性有关.     

阿糖胞苷诱导人MDS细胞株MUTZ-8细胞凋亡过程中活性氧水平的变化

目的探讨阿糖胞苷诱导人MDS细胞株MUTZ-8细胞凋亡的可能机制。方法将细胞分为以下5组:阴性对照组、0.1μmol/L Ara-c组、1μmol/L Ara-c组、10μmol/L Ara-c组、10μmol/L Ara-c+62.5μmol/L ALA组。用MTT法测定阿糖胞苷对各组细胞抑制率的影响,用Annexin V-FITC/PI双染法及Hoechst33258荧光染色观察阿糖胞苷对各组细胞凋亡的影响,并用流式细胞仪检测各组细胞线粒体膜电位的变化。运用二氢二氯荧光素(DCFH-DA)为细胞内活性氧探针,通过荧光显微镜及流式细胞仪检测各组细胞内活性氧水平的变化。结果 MTT结果提示,阿糖胞苷处理组细胞增殖抑制率高于阴性对照组,二者相比差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪结果提示,不同浓度的阿糖胞苷作用MUTZ-8细胞后,凋亡率明显升高,线粒体膜电位明显下降,与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪及荧光显微镜检测均显示,阿糖胞苷作用后细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)明显上升。而加入抗氧化剂α-硫辛酸后细胞内ROS表达水平下降。结论阿糖胞苷明显抑制了人MDS细胞株MUTZ-8的生长并诱导其凋亡,可能与阿糖胞苷影响了细胞内ROS水平有关。     

龙葵碱调控还原型谷胱甘肽和活性氧氧化还原体系损伤线粒体

目的 探讨龙葵碱诱导 HepG2 细胞凋亡与线粒体损伤的关系。 方法 倒置显微镜观察细胞形态,Annexin V/PI 双染激光共聚焦扫描显微术检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡率。透射电镜观察细胞线粒体超微结构,CDFH-DA 染色激光共聚焦扫描显微术检测活性氧 (ROS) 相对量,比色法检测还原型谷胱甘肽 (GSH) 量。 结果 龙葵碱组 HepG2 细胞贴壁细胞数量减少,部分出现死亡。Annexin V/PI 双染激光共聚焦扫描显微镜下观察发现龙葵碱组细胞 Annexin V-FITC 高染,细胞膜呈绿色荧光;PI 低染,细胞核呈红色荧光,呈现明显的早期凋亡特征。流式细胞术分析 0.4、2、10 μmol/L 龙葵碱作用 HepG2 细胞 24 h 后,早期凋亡率分别为 4.0%、8.5%、20.1%。透射电镜观察发现龙葵碱作用 HepG2 细胞 24 h,细胞线粒体超微结构出现肿胀,嵴排列紊乱、嵴消失,重度空泡样变性等变化;细胞内 ROS 水平升高,GSH 的水平降低。 结论 龙葵碱通过降低 HepG2 细胞内 GSH 量,使 ROS 不能被及时清除而损伤线粒体结构,导致 HepG2 细胞凋亡。     

原发性开角型青光眼小梁网组织早衰的初步研究

摘 要: 【目的】 观察正常小梁网组织和POAG小梁网组织在超微结构和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)表达方面是否存在差异?【方法】 正常人小梁网组织取自广东省眼库的正常人眼球(10例),平均年龄(36.90 ± 10.10)岁;POAG小梁网组织来自中山眼科中心青光眼科行小梁切除术者(10例),平均年龄(39.80 ± 11.64)岁?用透射电镜观察两组小梁网组织超微结构;用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法对两组小梁网组织进行染色,并分析两者之间衰老染色的差异?【结果】 透射电镜发现正常人小梁网组织细胞膜完整,核染色均匀居中, 胞浆中可见形态正常的中心体, 周围散落分布着的线粒体?溶酶体等细胞器;基底膜完整连续;弹性纤维周围绕有薄鞘,胶原纤维呈束状排列?整齐;Schlemm管管腔通畅?而POAG患者的小梁网组织中可见细胞脱落溶解,细胞膜不完整,细胞核固缩或肿胀,线粒体水肿,线粒体嵴扩张;Schlemm管管腔变狭窄;弹性纤维增多且排列紊乱;基底膜增厚?SA-β-Gal染色发现POAG小梁网中的衰老细胞阳性率较正常人小梁网组织高(P < 0.001)?【结论】 POAG小梁网超微结构破坏明显,SA-β-Gal染色增强,在POAG小梁网中可能存在早衰?     

叔丁基过氧化氢诱导小梁网细胞氧化应激模型的建立

目的体外建立叔丁基过氧化氢小梁网细胞氧化应激模型。方法应用t BHP刺激体外培养的小梁网细胞(i HTM)后,观察小梁网细胞形态学的改变,分别用MTT法检测氧化损伤后小梁细胞的活性,流式细胞术检测活性氧水平,SucLLVY-荧光底物检测糜蛋白酶样蛋白酶体的活性,流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测小梁细胞的凋亡。结果正常培养的小梁细胞呈梭形,折光性好,贴壁较牢;应用t BHP刺激后,部分细胞变圆、脱落、皱缩,小梁细胞的细胞活性明显下降,活性氧水平升高,糜蛋白酶样蛋白酶体活性降低,细胞凋亡水平明显增加。随着刺激时间的延长,上述改变更为明显。结论 t BHP刺激后,小梁网细胞出现典型的氧化应激改变,t BHP刺激小梁网模型的建立可应用于青光眼氧化应激的研究。     

多巴胺对鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集的促进作用

目的:探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集过程中的作用。方法:采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,流式细胞术检测双氢罗丹明123荧光强度;Western印迹法检测胞质内α-突触核蛋白表达;免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集体。并采用多巴胺耗竭剂——利血平预处理3h,观察上述指标。结果:鱼藤酮处理24h后,PC12细胞内过氧化物水平显著升高,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,细胞内过氧化物水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05)。鱼藤酮处理后,α-突触核蛋白表达水平显著升高,胞质内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集体形成;采用利血平预处理后,α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05),α-突触核蛋白聚集体面积减小。结论:在鱼藤酮作用过程中,多巴胺可促进α-突触核蛋白表达上调及其聚集体的形成。     

人眼小梁组织及体外培养的人眼小梁细胞SPARC mRNA及其蛋白表达

目的:研究人眼小梁组织(TM)及体外培养的人眼小梁细胞(TMCs)是否可以表达酸性富含胱氨酸分泌型蛋白(SPARC) mRNA及SPARC蛋白. 探讨SPARC蛋白在原发性开角型青光眼(POAG)发病机制中的作用. 方法:分别采用RT-PCR和Western-Blot方法,对小梁组织和细胞进行检测,用抗SPARC蛋白免疫荧光染色方法对细胞进行染色. 结果:组织和细胞RT-PCR均在300 bp处出现预期的电泳条带,组织和细胞Western-Blot在Mr为43×103处出现蛋白条带. TMCs抗SPARC免疫荧光染色表现为胞质均匀着色. 结论:TM组织及体外培养的人眼TMCs均可表达SPARC mRNA及其相关蛋白,并起着调节细胞外基质(ECM)的生成和降解作用.     

SIRT1增强青光眼小梁网细胞DSBs修复能力及抗细胞衰老的研究

目的 研究Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶SIRT1与青光眼小梁网细胞（GTM）DNA双链损伤（DSBs）修复能力及细胞衰老之间的关系。方法 首先通过RT-PCR和Western blot检测正常小梁网细胞（HTM）与GTM之间SIRT1表达的差异;然后将HTM、GTM细胞分别分为4组,白藜芦醇组（0.5 μmol/L Res干预24 h）、SIRT1-ShRNA组（构建成功的SIRT1干扰质粒转染细胞）、microRNA34a组（构建成功的microRNA34a表达质粒转染细胞）以及Control组,通过Western blot检测各组细胞中SIRT1表达水平的差异;SA-β-Gal衰老染色检测连续生长10 h、32 h、3 d、6 d后各组细胞的衰老变化;中性彗星电泳检测经1.33 mol/L H2O2液处理0 h、2 h时各组细胞中DNA双链损伤情况;Western blot检测1.33 mol/L H2O2液处理0 h、1 h、2 h后,各组细胞中γ-H2AX表达的变化情况。结果 HTM及GTM细胞中均存在SIRT1的表达,且HTM中的表达要高于GTM;HTM、GTM细胞各组内比较发现,SIRT1蛋白的表达水平呈Res组＞Control组＞microRNA34a组＞SIRT1-ShRNA组趋势;SA-β-Gal衰老染色则发现在相同时间点,GTM细胞的衰老程度均高于HTM细胞,而在同一类细胞中,SIRT1-ShRNA组细胞最先表现出衰老,且随着时间的延长,其衰老程度也最为严重,Res干预细胞24 h后,能明显延缓细胞衰老。中性彗星电泳检测表明经氧化剂处理后,GTM组双链DNA的损伤情况比HTM组严重,并呈现出SIRT1-ShRNA组>microRNA34a组>Control组>Res组的趋势,γ-H2AX表达量的检测结果与中性彗星电泳的结果一致。结论 SIRT1表达活性的下调可能是诱发青光眼的因素之一;Res能显著增强HTM细胞中SIRT1的表达活性,上调的SIRT1能促进HTM细胞DNA双链损伤修复的能力,维持细胞基因组的稳定性,进而减缓细胞的衰老。     

Effect of CD44 Suppression by Antisense Oligonucleotide on Attachment of Human Trabecular Meshwork Cells to HA

The effects of suppression of CD44 by CD44-specific antisense oligonucleotide on attachment of human trabecular meshwork cells to hyaluronic acid (HA) were observed and the possible relationship between CD44 and primary open-angle glaucoma (POAG) investigated. CD44-specific antisense oligonucleotide was delivered with cationic lipid to cultured human trabecular meshwork cells. The expression of CD44 suppressed by CD44-specific antisense oligonucleotide was detected by RT-PCR and Western blotting. The effect of CD44 suppression by specific antisense oligonucleotide on attachment of trabecular meshwork cells to HA was measured by MTT assay. Results showed that expression of CD44 was suppressed by CD4 , specific antisense oligonucleotide. Antisense oligonucleotide also suppressed the adhesion of human trabecular meshwork cells to HA in a concentration dependent manner. It was concluded that attachment of human trabecular meshwork cells to HA was decreased when CD44 was suppressed by specific antisense oligonucleotide. CD44 might play a role in pathogenesis of POAG by affecting the adhesion of trabecular meshwork cells to HA.     

大鼠肝细胞线粒体周围内质网的体视觉分析

目的：D直细胞与其周围内质网的结构关系,方法：使用钻占石刀对肝组织进行连续切片,电镜下观察线粒体及其周围内质网的三维结构。对肝细胞细胞器,特别是线粒体及其周围内质网进行体视学分析。结果：几乎所有的线粒体都在内质网的包绕下工作,在整个肝细胞内有26％的RER的32％的SER贴附近线粒体的周围。结论：肝细胞线粒体通常在内质网在包绕下执行生理功能,二者是结构和功能紧密联系的整体。     

豚鼠心传导系形态学研究(Ⅱ)——豚鼠窦房结、房室结的亚微结构观察

目的 :为临床心血管试验提供形态学资料。方法 :对 5例豚鼠心脏的窦房结和房室结 ,进行透射电镜观察。结果 :窦房结和房室结内的细胞主要为P细胞和T细胞。P细胞圆形或多边形 ,胞核大 ,肌微丝少排列不规则 ,线粒体少 ,糖原颗粒及核糖体丰富 ,核旁有高电子密度颗粒。T细胞呈梭形 ,平行排列、核长 ,核膜及胞膜不平滑 ,肌微丝可形成较完善的肌节 ,核糖体和糖原颗粒丰富 ,也有高电子密度颗粒。结内细胞多以未分化型连接为主。结论 :该研究能为了解心传导系的传导机制和探讨心律失常发病机制 ,提供形态学基础     

脂质体介导的CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞粘附功能的影响

目的：观察脂质体介导的CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞粘附功能的影响，探讨CD44分子在原发性开角型青光眼(POAG)发病过程中可能的作用。方法：采用硫代修饰的CD44反义寡核苷酸，通过脂质体导人体外培养的人眼小梁细胞，RT—PCR、Western印迹及MTT法观察CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞CD44基因表达及粘附功能的影响。结果：RT—PCR及Western印迹结果提示：CD44反义寡核苷酸抑制人眼小梁细胞CD44表达。MTT法检测显示：CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞与细胞外基质透明质酸的粘附起抑制作用且呈浓度依赖性。结论：CD44反义寡核苷酸抑制人眼小梁细胞与细胞外基质透明质酸的粘附，粘附分子CD44可能参与了POAG发病过程。     

兔窦房结的光镜和电镜观察

目的了解窦房结的形态结构,为临床心血管试验提供形态学依据。方法取10例大白兔心脏,常规石蜡包埋窦房结组织连续切片,HE染色后在光镜下观察。另取2例大白兔窦房结对其特化的P细胞和T细胞进行透射电镜观察。结果兔窦房结主要位于右房界沟的静脉窦侧,其长轴与界沟平行,向上可达腔耳角下1.5mm,向下可达下腔静脉入口处,窦房结的厚度可占据整个心房壁全层或心内膜下心房壁外侧2/3。兔的窦房结的形态结构变化较大,多数呈长尾形,结内未见到大的窦房结中央动脉,内部有丰富小血管分布。光镜下窦房结细胞小而密,胞质淡染,主要为P细胞及T细胞。电镜下P细胞细胞器少、核大,呈圆形或椭圆形,近核膜有染色质凝聚,线粒体少,高尔基体发达,位于核旁。T细胞胞核呈长圆形,线粒体较多,可见较完整的肌节,细胞间连接多为中间连接。结论大白兔窦房结的位置较高,形态有一定差异,其细胞发育较为成熟。