人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外培养模型,并对其进行鉴定,为体外血管内皮细胞及相关疾病的研究搭建桥梁。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,于M199培养基(含20%胎牛血清,80%M199不完全培养基,1%终浓度为50μg/mL内皮细胞生长复合物,1%终浓度为100μg/mL肝素钠,1%青-链霉素,1%L-谷氨酰胺)中培养,待细胞80%以上融合后,用0.25%的胰酶和0.25%的EDTA消化传代,并在倒置显微镜下观察细胞形态,用免疫荧光法对细胞进行鉴定。结果原代培养的HUVECs在24 h后完全贴壁,2～3 d可达80%的融合,倒置显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排布,免疫荧光显示细胞胞浆中Ⅷ因子相关抗原阳性。结论 0.1%Ⅰ型胶原酶消化HUVECs方法便于操作,细胞获得量多且生长状态良好。     

人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

目的研究人脐静脉内皮细胞的体外培养方法,并进行细胞鉴定。方法胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞,加入DMEM/F12混合培养基,37℃5%CO2培养箱中培养,观察细胞形态及生长状况,近融合时消化传代培养。采用形态学观察和CD34免疫组化法进行细胞鉴定。结果原代培养的人脐静脉内皮细胞约于24h完全贴壁,4~5d后融合成单层铺路石样结构。CD34染色证实培养的细胞是人脐静脉内皮细胞。结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的人脐静脉内皮细胞。     

人脐静脉内皮细胞的培养和连续传代

本实验用新生小牛视网膜提取物作血管内皮细胞生长促进剂，成功地使人脐静脉内皮细胞在体外连续培养23代以上。细胞倍增时间平均为16．6h，细胞传代时间平均为5d，传代比率为1：2～1：3。用ABC法证明细胞内存在Ⅷ因子相关抗原(Ⅷr-Ag)，透射电镜下可见胞浆内含WP(Weibel-Palade)小体，证实所培养的细胞为血管内皮细胞。     

不同培养基对人脐静脉内皮细胞体外培养效果的影响

目的研究不同培养基对人脐静脉内皮细胞体外培养生长的影响,探讨内皮细胞的最佳体外扩增培养条件。方法取健康产妇分娩后脐带,用胶原酶Ⅰ消化后得脐静脉内皮细胞,进行原代培养,并用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,传代培养时则分别采用RPMI-1640培养基和EGM-2培养基,倒置显微镜观察两种培养条件下细胞的生长状态,同时利用流式细胞仪检测其生长周期,对比培养效果。结果 EGM-2组内皮细胞生长良好,2d后贴壁生长的细胞可达90%。EGM-2组S期细胞比例为(29.07±1.48)%,RPMI-1640培养基组S期细胞为(17.58±3.49)%,二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 EGM-2培养基更适合人脐静脉内皮细胞的体外传代扩增培养。     

人脐静脉内皮细胞体外培养与鉴定新方法探索

目的：探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养与鉴定新方法。方法：Ⅰ型胶原酶消化、分离HUVEC，含内皮细胞生长添加物(12．5mg／L)、肝素(100mg／L)的体积分数20％胎牛血清-M199培养系统培养HUVEC。流式细胞术和免疫荧光法检测其endoglin(CD105)、血小板源内皮细胞黏附分子-1(CD31)表达。结果：HUVEC均表达CD105和CD31；HUVEC CD105^ 百分率为96．56％，CD31^ 90．42％。结论：该培养系统简便、可行，CD105和CD31有助于鉴定HUVEC的分离纯度。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定

目的:体外进行人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)原代培养及鉴定.方法:用0.1%Ⅱ型胶原酶消化法收集HUVECs,加入含20%胎牛血清的M199培养基在37℃、5%CO2孵箱中培养,用Tryple express进行消化传代培养.采用细胞形态学观察、流式细胞仪测定CD34鉴定细胞.结果:原代培养的HUVECs在24 h完全贴壁,在3～5天融合成片,呈现单层铺路石样改变.流式细胞仪测定内皮细胞纯度为75.52%.结论:Ⅱ胶原酶及Tryple express的灵活使用可获得大量连续传代培养的HUVECs.     

人脐静脉内皮细胞的体外培养、鉴定及形态观察

目的 :建立血管内皮细胞培养模型 ,为体外研究血管内皮细胞提供重要的实验手段。方法 :用 0 .2 5%的胰蛋白酶消化、分离人脐静脉内皮细胞 ,种植在培养板中 ,观察其生长情况 ,且用间接酶免法及电镜下进行内皮细胞鉴定。结果 :种植在培养板中的内皮细胞 4h开始贴壁生长 ,48～ 72 h生长最快 ,7～ 1 0 d呈多角形。内皮细胞胞浆中有 VWF相关抗原和电镜下可见胞浆中有W- P小体 ,可确定培养的细胞为血管内皮细胞。结论 :用胰酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获得血管内皮细胞的一种好方法 ,获得细胞数量多、成活率高。     

人脐静脉内皮细胞体外培养及其相关研究

血管内皮损伤是许多疾病如动脉粥样硬化等发生的始动机制。血管内皮细胞在体外的成功培养为研究内皮细胞功能及其在各种疾病的发生发展中所起的作用提供了良好的基础。人脐静脉内皮细胞取材容易,操作方便,目前已成为血管内皮细胞体外实验的的重要材料。近年来,人脐静脉内皮细胞在妊娠高血压综合征、静脉血栓等方面的研究中有很高的应用价值。     

人脐静脉内皮细胞分离及冷冻保存的技术

目的 研究分离、培养、扩增人脐静脉内皮细胞及进行冷冻保存技术，探讨建立脐带血管内皮细胞库的可能性。方法 新鲜脐带42条，脐静脉内灌注消化酶消化，获得内皮细胞：以含20％的胎牛血清M199液进行培养。采用Ⅷ因子免疫荧光染色及扫描电镜检查，鉴定所获内皮细胞及其纯度：内皮细胞加入含10％DMSO冷冻保存液，置于液氮进行保存，复苏后进行锥虫蓝试验，四氮唑盐(MTT)试验以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。结果 血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞，与未冻存细胞相比，复苏的细胞活力保持在95％以上。复苏后的内皮细胞的生长曲线与未冻存细胞的生长曲线无差异。冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高，但无统计学意义。结论 脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力，可作为制备组织工程学血管的种子细胞来源。     

人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定

目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法,提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法取2根脐带(至少20 cm)冲净淤血,采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液,一根用0.2%胶原酶Ⅱ,另一根用0.1%胶原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液,比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养,观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点,同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞,胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶,且比较理想的消化时间均为13 min,细胞接种后4～5 h开始贴壁生长,1周左右可生长成单层,光镜下呈多角形,"铺路石"样排列,免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法,而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液,成功率高,可靠性大,可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

胆汁纳米细菌培养及鉴定

①目的 探讨胆汁中纳米细菌的培养、鉴定方法及微生物学特性.②方法 对6例胆结石患者胆汁标本进行纳米细菌培养,观察其生长情况.采用透射电镜、间接免疫荧光染色、Von KOSSA钙染色进行纳米细菌鉴定并采用扫描电镜对其进行能谱分析.③结果 6例胆结石患者胆汁标本纳米细菌培养均为阳性;透射电镜下观察,纳米细菌约为80～350nm,呈椭球形或短棒状,聚集成簇状,其表面被覆细菌被膜;经Von KOSSA法钙染色,其形成的矿化外壳呈黑色;间接免疫荧光染色显示纳米细菌被荧光标记抗体结合,呈绿色荧光颗粒.扫描电镜能谱分析(EDX)显示,纳米细菌外壳含有钙、磷、镁等元素,其钙/磷比值为1.62;④结论 胆囊结石患者胆汁中存在纳米细菌感染.纳米细菌体积微小,生长缓慢,能在生理条件下于其菌体表面产生矿化外壳.纳米细菌单克隆抗体联合透射电镜可鉴定纳米细菌,钙染色对纳米细菌的鉴定有着重要的参考价值.     

原代脐静脉内皮细胞与脐静脉内皮细胞株的生物学特性比较

目的:建立高效脐静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cell,HUVEC)体外培养方法,与HUVEC株生物学特性进行对比研究,为组织工程及相关医学基础研究提供更好的细胞来源.方法:在新鲜脐静脉内灌注2.5 g/L胰蛋白酶消化获得内皮细胞,内皮细胞培养基(endothelial cellmedium,ECM)进行培养;RPMI1640培养HUVEC株.比较两组细胞形态;免疫组化、RT-PCR检测vWF,CD144的表达;Western Blot检测两组冻存复苏后细胞vWF,CD144蛋白水平的表达.结果:原代HUVEC体外生长2～3 d可铺满单层,细胞呈梭形、饱满,漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构;HU-VEC株胞质多颗粒,细胞单薄.免疫组化原代HUVEC的vWF和CD144表达明显高于HUVEC株[vWF分别为(142.7±3.3),(113.6±0.7);CD144分别为(118.6±0.5),(74.2±0.4);P<0.01].在mRNA水平,原代HUVEC基因CD144(577 bp)的表达量为HUVEC株的(3.15±0.12)倍(P<0.05);vWF(434 bp)表达量为HUVEC株的(6.15±0.37)倍(P<0.05).蛋白水平冻存复苏的原代HUVEC的CD144(135ku)表达量为HUVEC株的(2.07±0.31)倍(P<0.05);vWF(210 ku)表达量为HUVEC株的(5.38±0.23)倍(P<0.05).结论:脐静脉灌注胰蛋白酶消化法配合ECM培养可迅速获取大量内皮细胞,其生物学特性明显优于HUVEC株,是组织工程及相关医学基础研究更好的细胞来源.     

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞体外分离培养的简便方法。方法以无血清的RPMI1640培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养。通过细胞形态学观察,台盼蓝染色计数细胞活力,瑞氏染色计算纯度,细胞吞噬墨汁颗粒测定其吞噬率,鉴定这些细胞是巨噬细胞。结果本实验获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简便的巨噬细胞体外分离培养方法。     

兔软骨细胞的体外分离、培养及鉴定

目的探讨体外软骨细胞的分离培养方法。方法采用机械-双酶消化法对兔软骨组织进行消化,以获得软骨细胞,经过体外培养传代后,通过观察显微形态学、细胞增殖生长曲线及Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色对软骨细胞进行鉴定。结果成功建立体外培养兔软骨细胞的培养体系。显微镜显示原代培养的软骨细胞呈多角形或三角形贴壁生长,传代5次后出现"纤维样分化"。物理形态及免疫组织化学染色显示5代以内的细胞可以保持稳定的生物学特征。结论本研究建立的软骨细胞分离方法简单、方便。     

健康成人尿源性干细胞的分离、培养与鉴定

目的:分离培养和鉴定健康成人尿源性干细胞(USCs).方法:收集3名健康成人新鲜尿液,采用贴壁培养法分离培养细胞.进一步观察细胞形态,对细胞进行染色体核型分析,流式细胞术检测细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、CD34和CD45的表达情况,采用茜素红及油红O染色分别检测钙结节和脂质的形成以验证细胞成骨和成脂分...     

胎鼠脊髓神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的:分离、培养和鉴定胎鼠脊髓神经干细胞,为建立稳定的脊髓神经干细胞系提供基础.方法:应用无血清培养技术从胎鼠脊髓分离、培养神经干细胞,并应用神经干细胞特异性抗体对其进行标记;应用BrdU掺入培养检测其分裂增殖能力;应用神经元和星形胶质细胞特异性抗体分析其多向分化潜能.结果:分离到的细胞具有不断分裂增殖的能力,可被神经干细胞特异性抗体所标记,并在血清条件下分裂为神经系统多种细胞.结论:分离到的细胞具有自我复制能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞,为应用于中枢神经系统损伤治疗提供了基础.     

HCMV对培养HUVEC凋亡的作用

目的 :探讨人巨细胞病毒 (HCMV)在动脉粥样硬化 (AS)发生和发展中的作用及可能的机制。方法和结果 :采用组织培养技术和流式细胞计数仪观察HCMV对离体培养的HUVEC凋亡的影响。实验发现无血清培养和TNF诱导的细胞凋亡率较正常对照组升高 ,而CMV感染组凋亡率明显降低。用流式细胞仪检测发现 ,在DNA直方图上 ,在G1峰左侧可呈现亚二倍体核峰型 (亚G1峰 ,即凋亡峰 )。而正常的细胞经流式细胞仪检测 ,没有亚二倍体细胞群的峰型 ;CMV可以抑制HUVEC的一氧化氮 (NO)的合成 ,并且呈浓度依赖性。结论 :HCMV感染HUVEC后能够抑制HUVEC的细胞凋亡 ,可能的介导因素为被HCMV感染的HUVEC其NO合成减少。     

SD胎鼠脊髓神经干细胞分离、培养及鉴定

目的 分离、培养和鉴定胎鼠脊髓神经干细胞,为建立稳定的脊髓神经干细胞系提供基础.方法 应用无血清培养技术从胎鼠脊髓分离、培养神经干细胞,用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞.结果 分离培养的细胞具有不断增殖的能力,表达神经巢蛋白,并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞.结论 分离到的细胞具有自我复制能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞,为应用于中枢神经系统损伤治疗提供了基础.     

壁虎骨骼肌卫星细胞的原代培养与鉴定

目的:建立一种有效的壁虎骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定体系。方法:取壁虎后肢肌,采用I型胶原酶消化法获得细胞悬液,经差速贴壁法纯化骨骼肌卫星细胞,通过Pax7免疫细胞化学方法鉴定骨骼肌卫星细胞。用此法也分离到小鼠骨骼肌卫星细胞。结果:(1)分离到的细胞呈小圆形,培养2天后可见纺锤形细胞。(2)免疫细胞化学染色显示,分离得到的壁虎骨骼肌卫星细胞表达Pax7。Pax7阳性的小鼠骨骼肌卫星细胞达99%以上。培养3天后卫星细胞开始增殖。结论:成功建立壁虎骨骼肌卫星细胞的纯化和鉴定方法,为进一步研究卫星细胞在高等哺乳动物损伤修复中的可塑性奠定基础。     

牙源性角化囊性瘤上皮细胞的体外培养及鉴定

目的:建立牙源性角化囊性瘤上皮细胞体外培养体系并进行初步鉴定.方法:采用组织块及酶消化法原代培养牙源性角化囊性瘤上皮细胞,以无血清的角化上皮细胞培养基进行体外连续培养,并行细胞形态学观察及免疫组织化学鉴定.结果:体外培养的牙源性角化囊性瘤上皮细胞为多角形,胞浆均匀,轮廓清晰,表现上皮细胞特有的铺路石样外观,体外可传2～4代,生长周期约30～50 d.经波形丝蛋白、广谱角蛋白及角蛋白10、角蛋白14免疫组化染色证实,分离培养的细胞为上皮来源,无间充质细胞混杂.结论:采用无血清的角化细胞培养基可在体外进行牙源性角化囊性瘤上皮细胞的连续培养.