骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究

目的 通过体外细胞培养和贴壁筛选法将骨髓间充质干细胞由骨髓中分离纯化并加以鉴定，观察该细胞的生物学特性，为其用于组织工程提供实验基础。方法 提取骨髓，通过离心和贴壁筛选培养获取骨髓间充质干细胞，原位杂交检测骨髓间充质干细胞的表面标志CD44对培养细胞进行鉴定；测定其生长曲线和贴壁率。结果 通过体外培养和贴壁筛选可获得骨髓间充质干细胞，该细胞在体外培养条件下可在短时间内贴壁生长，增殖速度迅速，适应性强，长期传代不改变其生物学特性。结论 体外细胞培养和贴壁筛选能有效分离纯化免骨髓间充质干细胞，细胞扩增稳定。     

离心分离法与贴壁分离法对培养骨髓间充质干细胞生物学特性影响

目的探讨分离高质量和高活性骨髓间充质干细胞的方法。方法选取出生2月龄的健康兔,采用密度梯度离心分离法与贴壁分离法培养骨髓间充质干细胞,检测培养骨髓间充质干细胞生物学特性。结果贴壁分离法培养的原代骨髓间充质干细胞贴壁增殖快,细胞活性高,而密度梯度离心分离法培养的原代骨髓间充质干细胞贴壁增殖慢,细胞活性低,但这些差别在传代后消失。离心分离法得到的细胞纯度较贴壁分离法获得的细胞纯度高。结论与离心分离法相比贴壁法获得的原代骨髓间充质干细胞的细胞活性较高、贴壁增殖快,具有方法简单的优点。     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

人和大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和生物学特性的对比研究

目的 对比体外分离培养的人和SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长情况和生物学特性.方法 骨髓穿刺抽取健康成人的骨髓,SD大鼠处死后从股骨取骨髓,采用密度梯度法分离出BMSCs,MTT法测定两种细胞的生长曲线,用成骨、成脂培养基对细胞进行定向诱导分化.结果 两种原代培养的BMSCs生长到第3代后,细胞形态均一、呈梭形排列,生长曲线提示人的BMSCs第9、15代仍有较强的增殖能力,第20代后增殖速度明显减慢.大鼠的BMSCs第8、16代增殖能力也很强,第30代 仍有活力.2种干细胞都能成功诱导分化为骨细胞和脂肪细胞.结论 人和大鼠骨髓间充质干细胞均能在体外分离培养,并具有多向分化潜能,大鼠的骨髓间充质干细胞增殖能力更强于人的骨髓间充质干细胞.     

人胎盘来源间质干细胞移植治疗改善心肌梗死大鼠的心功能

目的 从人胎盘中分离培养间充质干细胞,评价其生物学特性并观察其改善大鼠心梗模型心功能的能力.方法 用酶消化法自人胎盘组织中分离培养,并以流式细胞术对其进行鉴定.利用Percoll密度梯度离心方法从骨髓中分选出人骨髓来源间充质干细胞.将两种来源细胞进行大鼠心梗模型移植,4周后超声心动图检测大鼠心脏功能.结果 人胎盘组织中可分离培养出间充质干细胞,并且胎盘来源间充质干细胞与骨髓来源间充质干细胞具有相似的改善心梗后心功能的能力.结论 胎盘来源间充质干细胞是心肌组织工程良好前景的种子细胞来源之一.     

人骨髓间充质干细胞的分离和体外培养

目的 探讨骨髓间充质干细胞的体外分离和培养方法。方法 采用密度梯度离心法和贴壁法进行骨髓间充质干细胞的分离，体外培养并观察其形态学特点。结果 细胞呈梭形或星形，4-5代内具有良好的增殖能力。结论 该方法是一种较理想的骨髓间充质干细胞培养方法。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察

目的：观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养的生物学特性和作为组织工程的种子细胞的可能性。方法：将人骨髓MSCs自骨髓中分离、纯化和培养，观察原代和传代培养的增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCS有活跃的增殖能力。结论：体外获得的人骨髓MSCs的生物年龄较为年轻，可以为组织工程的进一步研究提供种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探索体外分离培养人骨髓间充质干细胞的方法并观察基本生长特性，为今后研究其分化提供实验依据。方法：采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离人骨髓间充质干细胞，体外培养扩增，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，细胞计数法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期。结果：密度梯度离心法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞，细胞形态呈圆形、三角形或棒杆状，48h后细胞开始贴壁，4-5d可见有集落形成，2w左右可达到基本融合。生长曲线示骨髓间充质干细胞增殖活跃，流式细胞仪检测显示约有86％的细胞处于G0、G1期。结论：人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下生长性状稳定，增殖能力较强，可作为肝组织工程中理想的种子细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究

目的建立人骨髓间充质干细胞体外分离、培养体系,并将其向成骨细胞定向诱导分化。方法采用梯度离心法从人骨髓血中提取骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cell,MSC),经体外培养扩增,观察其生物学特性。结果在体外培养条件下,骨髓MSC具有较强的增殖能力,并能被诱导向成骨细胞分化。结论建立了骨髓MSC体外分离、培养的体系,探讨了骨髓MSC的生物学特性,为进一步研究MSC作为骨组织工程的种子细胞打下了基础。     

兔骨髓间充质干细胞的生物学特性实验研究

目的 了解兔骨髓闻充质干细胞的生物学特性，为组织工程寻找理想的种子细胞。方法 采用Percoll梯度离心及体外细胞贴壁培养技术对兔骨髓间充质干细胞分离、纯化和原代、传代培养观察。细胞染色。结果 获得的兔自体骨髓间充质干细胞形态均一，传代细胞之间有着不全相同增殖生长特点。细胞染色：PAS、ANAE阳性，AIP、ACP阴性，苯胺蓝染色阴性，胶原I型免疫染色为阳性，胶原Ⅱ型免疫染色则为阴性。结论 骨髓间充质干细胞具有独特生物学特性，将成为组织工程独特的种子干细胞。     

3 种不同组织来源的间充质干细胞促内皮祖细胞血管形成作用的比较

目的：比较人骨髓、脂肪和脐带来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)促进内皮祖细胞 (endothelial progenitor cells,EPCs)形成血管以及维持血管稳定的能力。方法：采用体外共培养成血管试验比较3种来 源的MSCs促EPCs形成管状结构的能力;采用体内基质胶Matrigel成血管试验、免疫组织化学染色比较3种MSCs促进 EPCs在体内形成功能血管的能力。结果：EPCs在脂肪MSCs单层上形成的管状结构长度和节点数均高于在骨髓和脐带 MSCs单层上的形成数;EPCs与脂肪MSCs在Matrigel上共培养时形成的毛细血管样结构稳定性高于骨髓和脐带MSCs; 脂肪MSCs与EPCs在体内Matrigel中形成大量有血流灌注的功能血管,脐带MSCs与EPCs在体内Matrigel中形成少量有血 流灌注的功能血管,而骨髓MSCs与EPCs在体内Matrigel中只形成有血细胞渗漏的不完整血管。结论：脂肪MSCs在体 内、体外促EPCs形成血管结构并维持其稳定的能力高于骨髓和脐带MSCs。     

脂肪间充质干细胞治疗缺血缺氧性脑病的研究进展

目的 脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSC)是一类具有多向分化潜能、免疫调控功能和自主更新能力的干细胞.与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)相比,ADMSC具有脂肪组织来源丰富、提取率高、取材过程痛苦程度低等特点.缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)致死、致残率极高,但现有的治疗方法临床效果不佳.近年来的研究发现,ADMSC能通过归巢、旁分泌、免疫调节、神经样分化及内源性神经再生等机制减轻脑缺血缺氧引起的神经损伤,有望成为治疗HIE的新方法.本文综述了ADMSC治疗HIE的相关机制和已经开展的临床试验及其存在问题.     

大鼠脂肪间充质干细胞向成肌细胞诱导分化的研究

目的探索在不使用5-氮杂胞苷的情况下,体外诱导大鼠脂肪间充质干细胞向成肌细胞的分化。方法取SD大鼠附睾处脂肪垫组织,酶消化分离获间充质干细胞,传至第3代,加入成肌细胞诱导液,在体外诱导8周,应用间接免疫荧光法、激光共聚焦显微镜进行成肌细胞的鉴定。结果大鼠脂肪组织来源的间充质干细胞经诱导5d后,显微镜下见细胞形态发生变化。2～8周的诱导细胞Myosin染色阳性。逆转录聚合酶链反应检测诱导3周的细胞有MyoD1和Myosin表达。结论大鼠脂肪组织来源的间充质干细胞在体外经诱导具有向成肌细胞分化的潜能。     

Proliferation and apoptosis property of mesenchymal stem cells derived from peripheral blood under the culture conditions of hypoxia and serum deprivation

Background  The proliferation and apoptosis property of mesenchymal stem cells derived from peripheral blood (PB-MSCs) were investigated under hypoxia and serum deprivation conditions in vitro so as to evaluate the feasibility for autologous PB-MSCs applications in cartilage repair.

Methods  MSCs were mobilized into peripheral blood by granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) and AMD3100. The blood samples were collected from central ear artery of rabbits. Adhered cells were obtained by erythrocyte lysis buffer and identified as MSCs by adherence to plastic, spindle shaped morphology, specific surface markers, differentiation abilities into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts in vitro under appropriate conditions. MSCs were cultured in four groups at different oxygen tension (20% O₂ and 2% O₂), with or without 10% fetal bovine serum (FBS) conditions: 20% O₂ and 10% FBS complete medium (normal medium, N), 20% O₂ and serum deprivation medium (D), 2% O₂ and 10% FBS complete medium (hypoxia, H), 2% O₂ and serum deprivation (HD). Cell proliferation was determined by CCK-8 assay. Apoptosis was detected by Annexin V/PI and terminal deoxynucleotide transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining.

Results  Spindle-shaped adherent cells were effectively mobilized from peripheral blood by a combined administration of G-CSF plus AMD3100. These cells showed typical fibroblast-like phenotype similar to MSCs from bone marrow (BM-MSCs), and expressed a high level of typical MSCs markers CD29 and CD44, but lacked in the expression of hematopoietic markers CD45 and major histocompatibility complex Class II (MHC II). They could also differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts in vitro under appropriate conditions. No significant morphological differences were found among the four groups. It was found that hypoxia could enhance proliferation of PB-MSCs regardless of serum concentration, but serum deprivation inhibited proliferation at the later stage of culture. Apart from that, hypoxia or serum deprivation could promote the apoptosis of PB-MSCs after 48 hours; the effect was stronger when these two conditions combined together. Furthermore, the effect of serum deprivation on apoptosis was stronger compared with that of hypoxia.

Conclusions  PB-MSCs possess similar phenotypes as BM-MSCs. Their differentiation and proliferation abilities make them a new source of seed cells for ischemia-related cell therapy and tissue engineering in the field of the articular cartilage repair.

     

体外成骨诱导增加人骨髓间充质干细胞刺激PBMCs增殖

目的初步观察人骨髓间充质干细胞(human bonemarrow derivedmesenchymal stem cell,hMSCs)及其成骨分化后代的免疫原性,为异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞研究提供理论基础.方法应用Percoll密度梯度离心法从人骨髓中分离、培养细胞hMSCs;将第3代hMSCs及其体外诱导成骨3周的分化后代分别与人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)混合培养,观察上述细胞对PBMC的刺激指数.结果Percoll(1.073g/ml)分离培养的原代hMSCs为均匀一致的梭形,呈漩涡样排列.其在体外成骨诱导3周时Von-Kossa染色见细胞间质有大量的钙盐沉积,免疫细胞化学检测见到大多数细胞骨钙素表达阳性.混合细胞培养结果显示:不同细胞数量的hMSCs对PBMCs的刺激指数(stimulation index,SI)均小于2;而1×104、5×103、103的hMSCs-Osteo对PBMCs的刺激指数大于2.结论hMSCs的免疫原性较低,在体外不能刺激PBMCs增殖.但hMSCs的成骨分化后代的免疫原性增加,一定数量细胞在体外能够刺激PBMCs增殖,其在异基因宿主体内可能引起免疫排斥反应.本实验结果提示:异基因骨髓间充质干细胞要作为骨组织工程种子细胞,必须克服免疫方面的障碍.     

大鼠脂肪干细胞与去细胞神经支架相容性研究

目的观察大鼠脂肪干细胞与去细胞神经支架体外相容性,为周围神经组织工程寻求合适的种子细胞载体。方法将大鼠脂肪干细胞与去细胞神经支架体外体外复合培养,采用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上的生长、黏附情况,MTT法测定细胞活性并与空白对照组比较。结果脂肪干细胞在去细胞神经支架上生长、黏附情况良好。结论两者具有很好的体外组织相容性,去细胞的神经支架可以作为有效的周围神经组织工程的细胞载体。     

人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究

目的探讨人胎盘底蜕膜间充质干细胞(MSCs)体外生物学特性,并验证其多向分化潜能。方法通过酶消化和密度梯度离心法从人足月胎盘底蜕膜中获取MSCs,倒置显微镜下观察其形态变化和生长特点;CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期及表面抗原(CD29、CD44、CD73、CD90、CD34、CD45、CD14)的表达;在特定诱导条件下,使其向成骨、成脂、成软骨方向分化,鉴定其多向分化潜能。结果人足月胎盘底蜕膜中分离的MSCs呈克隆样生长,形态类似于骨髓MSCs,传代后细胞增殖迅速,细胞倍增时间为(2.21±0.21)d;大于70%的细胞处于静止期(G0/G1期),阳性表达CD29、CD44、CD73、CD90,不表达CD34、CD45、CD14;经诱导后茜素红染色、油红O染色和Alcian blue染色均呈阳性表现。结论胎盘底蜕膜中含有丰富的MSCs,易于体外分离培养,且具有多向分化潜能,有希望成为另一新颖的干细胞来源。     

胎儿心脏间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的建立胎儿心脏间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的分离培养方法,并检测其表面标志及多向分化潜能。方法取胎龄4~5月水囊引产胎儿心脏,用1.073 g/mL的Percoll密度梯度离心分离低密度细胞,MSC培养基纯化贴壁细胞,用流式细胞术检测其表面标志,成脂肪及成骨诱导鉴定多向分化潜能,并与胎儿骨髓MSC对比,研究其增生及生长特征。结果流式细胞术证明,胎心MSC表达干细胞标志,具有间充质细胞的特征及多向分化能力。原代及传代培养显示,同胎儿骨髓MSC一样,胎儿心脏MSC具有活跃增生的能力。结论胎儿心脏中可成功地分离MSC,为组织工程的种子细胞和基因工程的载体细胞提供了新的可行的来源。     

靶向脐带间充质干细胞的构建及其在小鼠脾脏内的定位

目的 构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体, 用携带P1-GFP融合基因的慢病毒感染MSC, 使MSC具有靶向性, 将靶向MSC注入小鼠体内后观察MSC在小鼠脾脏的定位及与淋巴细胞的关系。方法 用组织片贴壁法培养健康人脐带间充质干细胞, 用基因工程技术构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体并感染人脐带间充质干细胞, 通过尾静脉将转入P1-GFP融合基因的MSC注入小鼠体内, 18 h后免疫组化染色观察GFP在小鼠脾脏的定位。 结果 培养的健康人脐带间充质干细胞生长良好, MSC感染含P1-GFP融合基因的慢病毒18 h后MSC开始出现绿色荧光, 随着培养时间的延长, 荧光强度逐渐增强, 72 h达高峰。靶向MSC表达髓系干细胞的表面标记 CD105(90.0%)/CD44(98%),CD73(85.0%)/CD90(98.5%)。将靶向MSC经尾静脉注入小鼠体内, 18 h后小鼠脾脏出现大量GFP阳性细胞, 并与脾脏淋巴细胞密切接触。结论 本研究成功构建了含P1-GFP融合基因的靶向MSC, 靶向MSC成功定向脾脏, 并与脾脏淋巴细胞密切接触, 可用于后续的实验研究。     

筛选后的巢蛋白阳性细胞流式鉴定及诱导分化

目的观察胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞(符合医学伦理学)是否具有与间充质干细胞类似的表面标志以及多向分化的潜能.方法从胎儿胰腺中分离的巢蛋白阳性细胞筛选后进行扩增,用流式细胞仪分析表面标志,并探讨这类细胞的成脂和成骨的分化潜能.结果筛选纯化后的巢蛋白阳性细胞的表面标志与骨髓间充质干细胞表面标志相似:此类细胞可在体外诱导为脂肪细胞或骨细胞.结论筛选纯化的胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞具有一定间充质干细胞的特性.